呼肠孤病毒Ⅲ型免疫荧光检测方法的建立及初步应用

目的 建立呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)免疫荧光(IFA)检测方法,应用于人用动物源性生物材料及生物制品外源Reo3的检测。方法滴定病毒TCID50,筛选Reo3敏感细胞,依据国标IFA法制备抗原片,方阵法滴定免疫荧光素最佳工作浓度。并进行特异性、敏感性和稳定性试验。结果选取BSC-1细胞作为Reo3敏感细胞,病毒感染力滴度(TCID50)为10-5.8/mL;免疫荧光素最佳工作浓度为1∶100;与小鼠鼠痘(Ect)病毒、小鼠肝炎(MHV)病毒均无交叉反应;稳定性和敏感性试验显示,不同时间IFA检测灵敏度均为1∶1280;可检测到的病毒滴度最低为10-4.1/mL。结论建立的IFA法敏感性、特异性强,稳定性好,可用于人用动物源性生物材料及生物制品Reo3的检测。     

树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法,为树鼩的质量控制提供检测方法。方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒,经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)。根据GenBank中已发表的MRV L1基因的保守区域,设计合成巢式引物,对所分离的三株树鼩呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT-nPCR扩增,优化反应条件,进行特异性、敏感性试验。应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测。结果针对分离到的三株树鼩呼肠孤病毒的RNA进行RT-nPCR扩增,均得到513 bp的特异性目的片段,培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带。敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0.01 pg/μL。25只树鼩粪便样本经RT-nPCR检测,有14只TRV阳性,其中死亡动物组10只,检出率为100%;存活动物组15只,检出率为27%。结论建立的TRV RT-nPCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于TRV的常规检测。     

长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。方法根据已发表的小鼠肝炎病毒(MHV)S基因序列,设计合成引物。提取MHV细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、稳定性、重复性试验。并对65只长爪沙鼠及12只小鼠进行检测。结果建立的MHV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以MHV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为3.1 pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-3/mL。65只沙鼠经RT-PCR检测,均为阴性,12只小鼠经RT-PCR检测,有3只MHV阳性,测序结果与Genbank中MHV核酸序列同源性均为97%。结论建立的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。     

长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法

目的 建立长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。方法 根据已发表的小鼠肝炎病毒（MHV）S基因序列,设计合成引物。提取MHV细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、稳定性、重复性试验。并对65只长爪沙鼠及12只小鼠进行检测。结果 建立的MHV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以MHV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为3.1pg/μl,可检测病毒最小滴度为10-3.ml-1。65只沙鼠经RT-PCR检测,均为阴性,12只小鼠经RT-PCR检测,有3只MHV阳性,测序结果与GenBank中MHV核酸序列同源性均为97%。结论 建立的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立及灰仓鼠中流行情况调查

目的建立仙台病毒(SV)RT-PCR检测方法,并对灰仓鼠仙台病毒感染情况进行调查。方法根据NCBI发表的SV(gi:9627219)基因组序列设计引物,建立RT-PCR方法,对方法的特异性和灵敏性进行验证,并用该方法检测60份灰仓鼠的肺脏样本。结果建立的SV RT-PCR方法显示有较好的敏感性和特异性:以仙台病毒为模板扩增产生197 bp的单一目的条带,经测序比对与NCBI数据库中SV相关序列的一致率为98%,而以猴副流感病毒(SV5)、犬瘟热病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型及腮腺炎病毒为对照无任何条带产生;能检出的SVcDNA最低浓度是96.8 ng/mL;用该方法检测60份灰仓鼠,SV的感染率为3.33%(2/60)。结论建立的SV RT-PCR方法可用于实验类啮齿动物动物SV的常规检测,自然条件下灰仓鼠感染SV的问题不容忽视。     

脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.方法 根据已发表的EMCV VP1基因序列设计合成引物.建立RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用该方法检测62只长爪沙鼠、12只小鼠.结果 建立的EMCV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定.以EMCV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为4.1 pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-7mL-1.经RT-PCR检测,62只沙鼠均为阴性;12只小鼠中有1只EMCV核酸阳性,测序结果与GenBank中EMCV标准株核苷酸序列进行比对,其同源性为85%.结论 建立的脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.     

实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力验证结果评价

目的 通过实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力验证计划，了解实验动物检测机构检验能力，提高实验动物质量检测水平。方法 按照CNAS批准的能力验证方案，血清经过标定后，经过稳定性和均匀性检验合格，作为能力验证样品。采用随机编号，发样给参加单位，并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件，其结果与样品预检结果一致的判为满意结果，不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果 共有17个省市的27个实验动物检测机构报名参加本次能力验证项目。27个检测机构均提交了满意结果，占总参加机构的100%。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法的有26个检测机构，采用免疫荧光实验（IFA）方法的有1个检测机构。结论 实验动物质量检测机构实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力较高，实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

我国商业化SPF级小鼠病原体污染分析

目的 按现行国标《实验动物微生物学检测方法》和《实验动物寄生虫学检测方法》对我国商品化的无特殊病原体(specific pathogen free,SPF)小鼠进行微生物状况检测,为生产高质量的实验动物提供依据.方法 对五家主要实验动物生产单位生产的ICR、KM、C57 BL/6、BALB/c及BA LB/c-nu品系的SPF级小鼠进行随机抽检.检测抽检小鼠所携带的微生物和寄生虫情况.结果 在抽检的SPF级小鼠中,病毒污染主要包括呼肠孤病毒Ⅲ型( Reo-3)、小鼠肺炎病毒(PVM)和多瘤病毒(POLY);主要细菌污染为肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌.这些微生物病原体中,除条件性致病菌绿脓杆菌外,其他病原体对小鼠本身和实验研究均具有一定的影响.     

呼肠孤病毒导致白血病细胞凋亡的分子机制研究

  目的  初步探讨溶瘤病毒呼肠孤病毒3型(Reovirus 3,Reo3)致白血病HL60细胞凋亡的分子机制。  方法  用不同感染复数(MOI)的Reo3感染HL60细胞, 设未感染的HL60细胞为对照组,病毒感染48 h后,通过CCK8法检测不同MOI的病毒对HL60细胞活性的影响;利用流式细胞术检测HL60细胞凋亡率;Western blot检测HL60细胞中双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)活化水平和凋亡相关蛋白表达情况。用PKR特异性抑制剂2-氨基嘌呤(2-AP)作用HL60细胞24 h后,Reo3感染HL60细胞48 h,检测细胞凋亡水平和凋亡相关蛋白表达水平。  结果  MOI为1的Reo3作用于HL60细胞48 h后对细胞的抑制作用明显,细胞存活率为(24.333±3.396)%,细胞凋亡率为(29.96±2.06)%,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。Western blot结果显示:与对照组比较,感染Reo3的HL60细胞PKR、p-PKR、Bax、Caspase3、cleaved Caspase3蛋白表达均升高(P＜0.05),而Bcl-2蛋白表达水平下降(P＜0.05)。与未加抑制剂组比较,采用2-AP预处理的HL60细胞感染Reo3后细胞凋亡率下降(P＜0.05),PKR磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平亦下降(P＜0.05)。  结论  溶瘤病毒Reo3作用HL60细胞可以引起PKR的活化,导致HL60细胞的凋亡。     

实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体的实验室检测能力验证结果评价

目的 通过实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法 按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果 共有17个省市的27个实验动物检测机构报名参加本次能力验证项目。27个检测机构均提交了满意结果,占总参加机构的100%。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法的有26个检测机构,采用免疫荧光实验(IFA)方法的有1个检测机构。结论 实验动物质量检测机构实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法,并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立SV5实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL,灵敏度为6．8copy／μL,批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％,批间CV为1．52％-12．38％,而且方法特异性好;在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。     

小鼠腺病毒PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立小鼠腺病毒（MAdV） PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MAdV的检测.方法 根据已发表的小鼠腺病毒（MAdV） E1B基因序列,设计合成引物.建立RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用建立的方法对65只长爪沙鼠、12只小鼠进行检测.结果 建立的MAdV PCR检测方法与小鼠微小病毒、多瘤病毒无交叉反应;以MAdVDNA为模板,所能检测DNA最小模板浓度为1.67 pg/μl,可检测病毒最小滴度为10-7/ml; MAdVDNA在-30℃冰箱放置12个月,仍能扩增出大小约606 bp的可见目条带.经PCR检测,65只沙鼠和12只小鼠均为阴性.结论 建立的小鼠腺病毒（MAdV） PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于小鼠、长爪沙鼠等实验动物MAdV的检测.     

实时RT-PCR定量检测NGF mRNA表达水平方法的建立

目的:建立一种用SYBR GreenⅠ实时定量逆转录(SYBR GreenⅠQ-RT-PCR)检测大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)mRNA基因表达的方法。方法:以Trizol一步法提取大鼠脑组织总RNA,以Oligo(dt)18为引物逆转录产生cDNA,利用SYBRGreenⅠ荧光染料法实时检测NGF mRNA的表达水平。通过熔解曲线分析NGF mRNA检测的特异性,以管家基因β-actin为内参照对NGF进行定量分析。结果:建立的大鼠NGF mRNA SYBR GreenⅠ实时检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立实时RT-PCR检测NGF mRNA基因表达的方法。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法.方法 根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100 copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为101.35％和113.28％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒.     

中国地鼠线粒体基因组与微卫星遗传标记的研究

中国地鼠在生物医学研究中占有重要的地位,但中国地鼠的分子遗传标记研究尚少。本研究运用生物信息学和比较基因组学等方法分析了中国地鼠的线粒体基因组的碱基组成、基因组结构、基因进化等特征,为中国地鼠应用于人类疾病动物模型提供基因组数据。建立了中国地鼠近交系遗传质量控制体系,为中国地鼠种质资源科学评估、合理开发利用奠定了基础。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.