基于叶绿体DNA序列和ISSR分子标记的菘蓝不同种质遗传变异分析

目的 对47个菘蓝种质进行序列变异和遗传多样性分析，开展其遗传分化和遗传结构研究。方法 采用试剂盒提取法提取菘蓝基因组DNA，用2条叶绿体DNA（cp DNA）序列和5条简单重复序列（ISSR）引物进行扩增并测序，通过软件Chromas、Mega 7.0、DanSP5、GenALEx对得到的序列进行校正、拼接及序列特征分析，利用软件PERMUT、PopGen1.31进行遗传多样性参数和遗传结构分析，最后利用NTSYS软件得到47个菘蓝种质的非加权组平均法（UPGMA）聚类树状图。结果 菘蓝47个种质的129个样本被成功扩增和测序，2个cp DNA序列经拼接后长度为1 412 bp，共有377个多态性变异位点，单倍型数为36个，Fu and Li''s D*检验在P<0.01水平上显著；基于cp DNA的核苷酸多样性（Pi）、平均遗传多样性（H_S）和总遗传多样性（H_T）分别为0.119 89、0.787和0.891，遗传分化系数遗传分化系数（Gst）、核苷酸分化系数（Nst）和群体间遗传分化指数（Fst）分别为0.117、0.468和0.488，基因流（Nm）值为0.615；基于ISSR的多态位点百分率（PPB）、香农（Shannon）信息多样性指数(I)、Nei''s基因遗传多样度指数(H)和Gst平均值为78.85%、0.334 8、0.218 6和0.754 4，Nm值为0.162 8。结论 菘蓝在物种水平上遗传多样性较高，具有丰富的单倍型类型，不同种质居群间遗传分化较明显，且基因交流不频繁，遗传变异主要存在于居群间，种群近期积累了较多的低频基因突变，推测其历史上曾经历了显著的区域扩张。     

基于叶绿体DNA条形码的披麻草药材及其混伪品的分子鉴定

目的 分析trnV-atpE、psaC-ndhE序列变异特点,并通过该序列鉴别披麻草不同基原植物与其混伪品。方法 分别提取披麻草3种基原植物及其混伪品的总DNA,以trnV-atpE、psaC-ndhE为DNA条形码候选序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。采用DnaSP、MEGA软件统计其片段长度、鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比、变异位点个数、简约信息位点、插入或缺失位点,并计算样品K2-P（Kimura 2-parameter）遗传距离和构建邻接法（NJ）系统发育树。结果 trnV-atpE、psaC-ndhE序列长度分别为373~381、491~534 bp,简约信息位点分别为18、15个。trnV-atpE和psaC-ndhE序列中披麻草3种基原植物最大遗传距离均小于与混伪品之间的最小遗传距离。基于2个序列构建的NJ系统发育树显示,披麻草与其混伪品能明显区分。结论 综合分析序列特点和种内、种间变异性,trnV-atpE和psaC-ndhE序列均可将披麻草3种基原植物与其混伪品区分开。     

慢性胃炎不同病理阶段中医舌象与舌苔菌群的关联性分析＊

目的 探讨慢性胃炎不同病理阶段舌苔菌群与中医舌象之间的关联性。方法 采集不同病理阶段的慢性胃炎患者90例（炎症组30例，单纯性萎缩组30例，萎缩伴肠化组30例），观察记录患者舌象，采集舌苔样本，用16S rRNA基因测序技术对舌苔菌群进行测序，然后用Spearman相关分析、Mantel Test分析、MaAsLin分析等方法进行关联分析。结果 ①慢性胃炎不同病理阶段与舌象特征（红舌、腻苔）具有一定相关性（P < 0.05）；②舌苔整体特征（苔色、厚苔、腻苔、滑苔等）与舌苔菌群之间具有强相关性（P < 0.01），舌体整体特征（舌色、齿痕舌、裂纹舌、点刺舌等）与舌苔菌群之间无明显相关性（P > 0.05）；③特定舌象特征与菌群的关联关系：腻苔与蓝细菌、绿弯菌门和酸杆菌门呈正相关关系，相关系数分别为0.00689、0.00492和0.00181，与Saccharibacteria呈负相关关系，相关系数为-0.0371；滑苔与绿弯菌门、蓝细菌、螺旋菌门呈正相关关系，相关系数分别为0.02379、0.01962和0.02366。结论 慢性胃炎不同病理阶段与舌苔特征有相关性，特定的舌苔菌群结构可以反映特定的舌苔特征。     

淡豆豉中产γ-氨基丁酸微生物对产毒黄曲霉菌的拮抗作用和毒素合成关键基因mRNA表达的影响

目的 考察从淡豆豉Sojae Semen Praeparatum（SSP）炮制过程中分离的15株产γ-氨基丁酸微生物对产毒黄曲霉菌的拮抗能力并筛选出具有抑制产毒黄曲霉菌生长和降解黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）的高效拮抗菌,探究高效拮抗菌发酵产物对黄曲霉毒素（aflatoxins）合成关键基因mRNA表达量的影响。方法 运用平板对峙法与十字交叉法检测15株产γ-氨基丁酸微生物及其发酵产物对产毒黄曲霉标准株（简称：产毒标准株）生长的影响,超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry,UPLC-MS/MS）检测15株菌对AFB₁的降解效果,考察其对产毒黄曲霉菌的拮抗能力并筛选出高效拮抗菌;针对高效拮抗菌发酵产物分别运用菌丝干重法检测其对产毒标准株菌丝生长的影响,实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测其对黄曲霉毒素合成关键基因（aflR、aflD、aflM、aflP）mRNA表达的影响。结果 15株菌及其发酵产物对产毒标准株的生长抑制率分别在15.88%～56.05%和25.74%～52.12%,对AFB₁降解率在2.74%～57.87%,表明它们对产毒黄曲霉菌均有一定的拮抗作用,并筛选出具有高效拮抗作用的黑曲霉菌Aspergillus niger（JC2）和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（Xd1）。当高效拮抗菌发酵产物加入量为2 000 µL时,JC2和Xd1对产毒标准株菌丝生长的抑制率分别为73.82%和63.34%,且能明显抑制黄曲霉毒素合成关键基因aflR、aflD、aflM、aflP的mRNA表达。结论 淡豆豉炮制中存在既能产γ-氨基丁酸又能明显抑制产毒标准株生长和产毒的拮抗菌,其拮抗作用可能通过抑制产毒标准株菌丝生长和毒素合成关键基因的mRNA表达。     

骨碎补内生菌Lecanicillium sp. GZWMJZ-847中3个新3-氢化萘特特拉姆酸衍生物

目的 研究骨碎补内生蜡蚧菌Lecanicillium sp. GZWMJZ-847的次级代谢产物和抑菌活性。方法 采用大米培养基对菌株Lecanicillium sp. GZWMJZ-847发酵;采用凝胶柱色谱、正反相硅胶色谱等方法对化合物进行分离纯化;采用核磁共振谱、质谱、NMR计算等方法确定化合物的化学结构;采用营养肉汤稀释法测试化合物对病原细菌及酵母菌的抑菌活性、平板法测试化合物对病原霉菌的抑菌活性。结果 从菌株的发酵产物中分离鉴定了3个新的和3个已知的3-氢化萘特特拉姆酸衍生物,包括蜡蚧特特拉姆酸A（1）、蜡蚧特特拉姆酸B（2）、蜡蚧特特拉姆酸C（3）、Sch 210971（4）、Sch 210972（5）、Sch 213766（6）。化合物1和4～6对4株人体革兰阳性病原菌和1株植物革兰阴性病原菌具有抑制作用,最小抑菌浓度（minimun inhibitory concentration,MIC）为7.8～125 mmol/L。化合物6对油菜菌核病菌和小麦赤霉病菌表现出一定的抑制作用,半数抑制浓度分别为（22.05±0.62）、（55.54±1.72）μg/mL。结论 蜡蚧特特拉姆酸A～C（1～3）为新的3-氢化萘特特拉姆酸衍生物,骨碎补内生菌Lecanicillium sp. GZWMJZ-847产生的3-氢化萘特特拉姆酸对人体病原菌和植物病原菌可表现出抑制作用。     

西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1的克隆及表达分析

目的 克隆西洋参PqDELLA1基因,进行生物信息学分析,并探讨其在西洋参抗根腐病中的表达模式。方法 根据已获得的西洋参转录组数据,设计PqDELLA1基因全长扩增引物,利用无缝克隆的方法获得全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）;采用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线Blastp、DNAMAN和MEGA 6.0等软件对序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测PqDELLA1基因的组织表达及诱导表达模式。结果 扩增得到西洋参PqDELLA1基因,其cDNA序列为1743 bp,编码580个氨基酸;PqDELLA1蛋白相对分子质量为63 910,理论等电点为5.01,不含信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞核,与番茄SlDELLA蛋白氨基酸相似度最高。qPCR结果显示PqDELLA1基因在叶中表达量最高,其次为茎,根中最少;该基因的表达受根腐病病原菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）的诱导,接种后5 d内持续升高后降低。结论 首次克隆出西洋参PqDELLA1基因并进行了生物信息学和表达特性分析,发现该基因可响应F. solani的侵染,为后续解析其参与西洋参抗病反应的分子机制提供参考。     

白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究

目的 分离、纯化经通体结香技术诱导的白木香木质部真菌,筛选能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株。方法 采用组织块分离法分离、纯化菌株,通过形态学特征结合内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定真菌;将真菌菌液接种到白木香树4个月后进行功能验证;依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版沉香项下薄层色谱、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定及特征图谱方法分析菌株诱导效果。结果 从白木香木质部中分离出48株真菌,优势菌株为镰刀菌;经刺盘孢菌属（Colletotrichum sp.）、黑曲霉Aspergillus niger、渐进绿木霉Trichoderma paraviridescens诱导的沉香薄层色谱斑点与对照药材一致;经镰刀菌属（Fusarium sp.）、黑曲霉、渐进绿木霉诱导的沉香浸出物质量分数均大于10%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;经可可毛二孢菌Lasiodiplodia theobromae、黑曲霉、渐进绿木霉等6株菌诱导的沉香特征图谱与对照药材一致,沉香四醇质量分数均大于0.1%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 从白木香木质部分离出的内生真菌可诱导沉香形成,其中黑曲霉和渐进绿木霉能够较快速诱导白木香结香,结香所得的树脂品质符合《中国药典》2020年版标准。     

17种毛茛科藏药材的分子鉴别＊

目的 毛茛科的多种植物是民族药的基原，本研究以ITS2序列作为DNA条形码对17种毛茛科藏药材进行鉴定，为药材的安全使用提供可靠的检测方法。方法 从四个省份采集或购买17种毛茛科藏药材样本，分布于8个属。采用试剂盒法提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列后，将扩增产物进行双向测序。利用CodonCode Aligner（v.9.0.1）软件进行序列拼接，将拼接后的序列在NCBI网站进行在线比对。在GenBank数据库中下载相关物种的rDNA序列（包含完整的ITS2区域）。上述序列经过CodonCode Aligner（v.9.0.1）软件剪切后，采用BLAST方法进行比对，然后再采用两种评估ITS2序列的鉴定能力。第一种是系统聚类树法（Tree-based method），用MEGA（v.5.0）软件构建NJ系统聚类树（Neighbour-Joining tree）；第二种是遗传距离法（Distance-based method），用TaxonGap（v.2.4.1）软件分析物种的种内与种间变异关系。结果 29份试验样本的ITS2序列测序成功率为100%，与93条数据库中下载的ITS2序列合并后，长度为213-230 bp，比对长度为244 bp，变异位点数72.1%。BLAST结果表明，29条ITS2序列可以将全部物种鉴定到属。系统聚类分析结果表明，ITS2序列能够成功鉴别8个物种；遗传距离分析结果表明，ITS2序列能够成功鉴别7种毛茛科药材。两种方法总共可以鉴别9种药材，它们是露蕊乌头（Aconitum gymnandrum）、草玉梅（Anemone rivularis）、多小叶升麻（Cimicifuga foetida var. foliolosa）、短尾铁线莲（Clematis brevicaudata）、长花铁线莲（Clematis rehderiana）、甘青铁线莲（Clematis tangutica）、腺毛黑种草（Nigella glandulifera）、拟耧斗菜（Paraquilegia microphylla）和芸香叶唐松草（Thalictrum rutifolium），鉴定效率为52.9%。结论 ITS2序列可以快速、准确地识别和鉴定部分毛茛科藏药材，为原植物和药材的分子鉴定提供依据。     

山药种质资源核糖体rDNA-ITS区序列分析

目的 分析14种山药DioscoreaeRhizoma种质ITS序列,为山药种质资源分子鉴别和进化关系研究提供依据。方法 PCR克隆扩增ITS序列并进行双向测序,Clustal X（v1.83）软件进行序列比对,Mega(V4.1)计算序列核苷酸比例及遗传距离,并构建邻接树（Neighbor-joining,NJ）和最大简约树（Maximum parsimony,MP）。结果 14种山药种质ITS序列全长为558～594 bp,其中ITS1长度为141～165 bp,ITS2长度为146～158 bp;ITS序列存在大量的转换、颠换,转化/颠换比率为5.347,ITS1和ITS2序列均显示102个变异位点;14种山药种质K2-P遗传距离为0～0.517 2;薯蓣Dioscoreaopposita、褐苞薯蓣Dioscoreapersimilis、日本薯蓣Dioscorejaponica关系亲密,组成单一支系;参薯Dioscoreaalata与山薯Dioscoreafordii关系亲密,聚为另一分支,并位于发育树基部。结论 ITS序列系统树为澄清山药类资源进化关系奠定了基础,序列中丰富的变异位点为多基原山药鉴别提供了科学依据。     

天龙复方制剂治疗甲型流感

目的：观察天龙复方制剂治疗甲型流感的临床疗效。方法：采集流感样患者的鼻咽拭子标本,采用斑点免疫渗滤法快速检测出甲型流感病毒核蛋白抗原阳性者,再经实时定量PCR方法测定甲型流感病毒核酸,阳性者为甲型流感确诊患者。将确诊的58例甲型流感患者随机分为中药组（25例,给予天龙复方制剂）;对照组（25例,给予乙酰氨基酚对症治疗）;达菲组 ;疗程3 d,比较3组患者的发热持续时间、临床疗效及治疗前后的甲型流感病毒核酸扩增Ct值。结果：中药组的有效率明显高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,中药组与达菲组比较无差异。中药组和达菲组的发热持续时间均比对照组减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,而中药组与达菲组比较无明显差异。中药组和达菲组治疗后的甲型流感病毒核酸扩增Ct值均较治疗前增高,差异均具有统计学意义（P<0.05）,但两组之间比较,差异无统计学意义。结论：天龙复方制剂对甲型流感患者具有退热、减轻症状和减少流感病毒载量的作用。     

乌头霜霉病病原物分子检测方法的建立

目的:建立乌头霜霉病病原菌快速分子检测方法,为乌头种苗检疫及栽培环境土壤安全性评价提供依据。方法:使用真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA,采用真菌核糖体内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4,对病原菌的r DNA-ITS区间序列进行扩增,将聚合酶链式反应(PCR)产物回收纯化并进行序列测定,并将测得的ITS序列同Gene Bank中搜索到的相关ITS序列进行比较,运用DNAMAN比对出特异序列片段,利用特异序列片段通过Primer Premier 5.0设计并筛选特异性引物,建立乌头霜霉病病原菌快速PCR检测方法。结果:从Primer Premier 5.0设计的8对引物中筛选出了灵敏度高、特异性强的引物对L1A/L1B,该引物能够从乌头霜霉病病原菌DNA扩增出670 bp的具有检测价值的明亮条带,利用该引物也能够检测出乌头种苗、成株以及栽培土壤是否存在乌头霜霉病原菌。结论:筛选出的引物对L1A/L1B能够快速、简便、有效地检测出乌头霜霉病病原菌,建立的方法能用于对乌头种苗霜霉病的提前检测或检疫。     

金莲花白粉病病原菌鉴定

目的:明确导致药用金莲花Trollius chinensis Bge.白粉病发生的病原种类及其分类学地位。方法:田间调查观察病害发生及为害特征;借助光学显微镜观察白粉菌闭囊壳、子囊、子囊孢子、附属丝等的显微形态特征;核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)-内转录间隔区(ITS)扩增引物ITS1/PM6用于白粉菌分子鉴定,扩增序列用MegaX软件中的邻接法(NJ)构建系统发育树。结果:白粉病每年7月中旬至9月上旬在成株期金莲花茎秆、叶柄及叶片上发生,造成金莲花及种子严重减产,甚至植株早衰死亡。金莲花白粉菌闭囊壳聚生,暗褐色,近球形,直径60~100μm,壁细胞不规则多角形,有凸起;闭囊壳内子囊单个,内含8个浅褐色、卵圆形的子囊孢子;附属丝多根,聚生于闭囊壳一侧,菌丝状,浅褐色,有隔膜,近等粗,直径4~6μm。金莲花白粉菌rDNA-ITS序列与叉丝单囊壳属白粉菌Podosphaera fuliginea(MF543026、AB046986)同源性最高,分别为98.88%、98.73%,与叉丝单囊壳属其他多个种的序列也有较高的同源性(96.00%~98.03%)。根据上述同源菌株的rDNA-ITS序列构建系统发育树,供试金莲花白粉菌与叉丝单囊壳白粉菌P.fuliginea聚为一支。结论:结合田间病害发生、为害特征及病菌闭囊壳、子囊、附属丝等的显微形态特征,将金莲花白粉病菌鉴定为叉丝单囊壳P.fuliginea。     

牛奶菜属植物及其近缘植物的ITS2、rbcL序列分析

目的 分析ITS2、rbcL序列在牛奶菜属植物及其近缘植物间的鉴别能力,并对牛奶菜属植物及其近缘植物的系统进化进行初步分析.方法 采用直接测序法测定所分析样品的ITS2、rbcL序列,获得的序列采用软件CodonCode Aligner人工校正,Contig软件拼接,用MEGA 4.0软件分析比对并进行遗传距离等分析,用NJ法对比对的序列构建系统分支树.结果 ITS2、rbcL序列对牛奶菜属植物及其他所分析样品有较好的鉴别能力,且鉴别能力ITS2优于rbcL;南山藤属、匙羹藤属植物与牛奶菜属植物间的亲缘关系非常相近.结论 条形码ITS2、rbcL序列能很好地区分牛奶菜属植物,且鉴别能力ITS2优于rbcL;建议将南山藤属、匙羹藤属等小属植物归入牛奶菜属内.     

不同生物源农药对内蒙古地区蒙古黄芪白粉病的田间防效研究

目的:探究不同生物源农药对蒙古黄芪白粉病的防治效果,为内蒙古地区蒙古黄芪生态种植专用生物源农药的选择提供依据。方法:在内蒙古自治区呼和浩特市和林格尔县,以清水为空白对照、25%多菌灵为阳性对照,选择市售、农业中白粉病防治效果较好的11种生物源农药(1.5%苦参•蛇床素、0.5%小檗碱、哈茨木霉菌+枯草芽孢杆菌、80%硫磺、几丁聚糖、0.3%丁子香酚、5%氨基寡糖素、大蒜素、0.5%大黄素甲醚、碳酸氢钠、解淀粉芽孢杆菌),施药3次,以病叶率、病情指数为考察指标,研究不同药剂对蒙古黄芪白粉病的防治效果。结果:给药前不同组别间病叶率差异无统计学意义,表明试验田各组别蒙古黄芪白粉病发病情况基本一致;在第3次给药7 d后,与空白对照相比,1.5%苦参•蛇床素、80%硫磺、25%多菌灵和碳酸氢钠组的蒙古黄芪病叶率显著降低(P<0.05),表明防治效果较好,其中1.5%苦参•蛇床素、80%硫磺与阳性对照防治效果相当,三者间防治效果差异无统计学意义;12种药剂中80%硫磺、1.5%苦参•蛇床素、25%多菌灵的平均防治效果为49.26%、33.95%、39.78%,防治效果较好,三者间防治效果差异无统计学意义。结论:1.5%苦参•蛇床素、80%硫磺可成为内蒙古地区蒙古黄芪白粉病专用生物源农药。     

一测多评法测定板蓝根中6种化学成分的含量

目的建立板蓝根Isatis indigotica中(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷6种不同类成分的一测多评方法。方法采用HPLC法,以(R,S)-告依春为内参物,建立了(R,S)-告依春与胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷和直铁线莲宁B的相对校正因子,并考察相对校正因子的耐用性和重现性。比较外标法和一测多评法对新疆软紫草中6种成分的测定结果。结果各相对校正因子重复性良好,一测多评法测定结果与外标法测定结果无显著差异。结论建立同时测定6种成分的一测多评法控制板蓝根的质量准确、可靠。     

不同产地菘蓝ISSR分析与鉴定

目的应用ISSR-PCR标记技术探讨不同产地菘蓝的遗传多样性,为其种质鉴定及育种提供参考。方法对采自全国不同地区的菘蓝及其变异类型的23份样本进行ISSR-PCR分析,采用NTSYS-pc软件计算Jaccard遗传相似系数,按非加权配对算术平均法(UPGMA)建立所研究类群的系统聚类图。结果 10条引物共扩增出109个条带,其中多态性条带为88条,占总扩增条带数的80.7%,菘蓝种质具有较丰富的遗传多样性。从聚类分析图可以看出,所研究样本聚为3支,第1支包括绝大多数样本,第2支为一被毛变异类型,第3支相距最远,从相似度0.62处即被分开,表明为一独立类群。结论 ISSR标记可以为菘蓝的种质资源鉴定、遗传关系分析及栽培育种提供分子生物学依据。     

营养元素对菘蓝生长特性的影响

目的 阐明不同营养元素对菘蓝生长的影响,明确其营养需求,为菘蓝的精准施肥提供理论依据。方法 以菘蓝幼苗为研究对象,采用水培法研究元素种类和浓度对其生长特性的影响,观察缺素处理菘蓝幼苗的典型特征,测定不同处理菘蓝生长和生理指标。结果 元素氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）、锌（Zn）对菘蓝幼苗生长具有关键作用。菘蓝对不同营养元素的需求程度不一,低浓度Zn、硼（B）,中浓度N、K、Mg、Fe、Mn,高浓度P、Ca、Cu对菘蓝生长有显著促进作用。结论 N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn元素对菘蓝生长影响较大,尤其是K、N、Fe、P元素。     

柴胡及其伪品的DNA条形码鉴定研究

目的鉴定河北中药材市场柴胡的真伪。方法对从河北中药材市场采购的28份柴胡药材的ITS2序列进行PCR扩增,同时从Gen Bank下载7个样本序列。采用Codon Code Aligner软件进行序列拼接,采用软件MEGA 6.0分析比对,计算其种间、种内的K2P距离以及各序列的变异位点并进行聚类分析。结果 28份样品中有21份为柴胡,3份为黑柴胡,4份为伪品。结论 ITS2序列能够作为柴胡药材鉴别的有效方法之一,对药材市场的规范和临床用药安全具有重要意义。