基于UHPLC-TOF-MS技术建立金线莲的指纹图谱及金线莲苷的含量测定方法

目的:建立野生、组织培养和种植等14批不同来源金线莲药材的超高效液相色谱-飞行时间质谱(UHPLC-TOFMS)指纹图谱,建立金线莲苷的UHPLC-TOF-MS含量测定方法,为完善金线莲药材的质量标准提供实验依据。方法:依据高分辨质谱提供的精确相对分子质量鉴定化学成分,选择[M+HCOO]-作为专属离子对金线莲苷进行含量测定。采用SPSS22.0软件对各批次药材中化学成分指纹图谱进行相似度考察和聚类分析,评价不同因素对金线莲药材质量的影响。结果:建立了金线莲药材UHPLC-TOF-MS指纹图谱并从中指认出36个化学成分,包括金线莲苷类5个、黄酮类18个、核苷类5个、有机酸类6个、长寿花糖苷C和天麻苷各1个。指纹图谱相似度考察、聚类分析及金线莲苷含量测定结果表明对药材中化学成分种类及含量产生显著影响的因素为产地和栽培时间。金线莲苷质量分数处于4.85%~16.18%。结论:建立的金线莲化学成分指纹图谱及金线莲苷含量测定方法稳定可行,为金线莲药材的质量评价提供了切实可行的检测方法。     

广东金线莲大棚春季种植对不同生长光强的响应

目的:为探究肇庆地区金线莲大棚春季种植所需的最佳光照设置,更好地保护与开发利用地域特色药材金线莲。方法:以肇庆种质金线莲组培苗为材料,根据野生金线莲的自然生长习性,用遮阳网设置3种光照梯度(Ⅰ.1 200~3 500 Lux,Ⅱ.500~2 000 Lux,Ⅲ.200~1 000 Lux)培养条件,研究栽培周期为3~7月份的金线莲生长情况。结果:历经春夏季90 d的栽培过程,金线莲的叶质量指标(叶数、叶面积及叶鲜重)和植株生长质量指标(株高、茎粗、单株鲜重及干重),均以光照强度Ⅲ(200~1 000 Lux)处理的植株显著优于其他两个光照处理(P<0.05或P<0.01)。叶组织结构在光照强度Ⅲ的生长发育最好,栅栏组织中叶绿体分布浓密,金红色的叶脉网纹细胞结构发育明显,海绵组织细胞花色素苷积累丰富。总酚、类黄酮与花色素苷等次生物质的含量呈现光照强度Ⅲ>光照强度Ⅱ>光照强度Ⅰ的趋势,低光照量更有利于金线莲有效物质的积累。结论:在广东肇庆地区3~7月份人工种植金线莲时,建议覆盖2~3层遮阳网(透光率15%~25%)进行严格遮阴,使其生长环境的光照强度维持在200~1 000Lux范围,以促进金线莲健壮生长,提高植株品质的道地性。     

文山野生金线莲总黄酮及多糖含量测定

目的 优选文山野生金线莲种质资源.方法 通过测定不同种金线莲中的总黄酮及多糖含量,并以总黄酮及多糖含量为指标,筛选优质金线莲种质资源.结果 6个野生金线莲样品中总黄酮含量基本相同,多糖含量相差较大,其中2号金线莲(花叶开唇兰Anocetochilus roxburghii,叶片无明显叶脉的"金线莲公")总黄酮含量最高,为43.01(mg/g DW);4号野生金线莲(滇越金线兰Anocetochilus chapaensis)多糖含量最高为112.40 (mg/g DW).结论 花叶开唇兰A.roxburghii及滇越金线兰A.chapaensis是文山野生金线莲中的优良种质资源.     

金线莲原球茎的组培诱导

本文报道了金线莲(Anoectochilus roxburghii)原球茎的诱导方法。除培养基及添加激素等组织培养条件外,不同产地和不同部位的外植体是影响诱导金线莲产生原球茎的关键因素。     

林下栽培金线莲的生药鉴别

目的:对林下栽培的不同品系金线莲进行生药鉴别,为金线莲药材商品的鉴别提供依据。方法:采用生药性状鉴定法、显微鉴定法和SSR分子标记法鉴定四个品系的林下栽培金线莲。结果:可从叶形、叶片大小、叶片脉纹特征等性状特征区分不同品系金线莲;通过(叶)显微构造观察,发现不同品系金线莲上表皮细胞和叶肉薄壁细胞的内含物存在差异;通过SSR分子标记聚类分析表明各品系金线莲遗传相似系数变幅为0.42～1.00,在遗传相似系数约0.74处,可将不同的品系分开;基于6对引物构建了各品系金线莲的DNA指纹图谱。结论:林下栽培的不同品系金线莲在生药性状、显微构造以及遗传特性方面存在差异。本研究所发现的鉴别特征可为市售金线莲的商品鉴别及质量控制提供依据。     

光照强度与栽培模式对金线莲生长及品质影响

目的:探讨不同光照强度和栽培模式下金线莲形态、产量、主要药用成分黄酮和多糖的动态变化规律,确定金线莲适宜栽培模式和最佳采收时间。方法:以一次性成苗有机培养金线莲植株为材料,调节不同光照强度,采用林下仿生栽培和大棚种植2种不同栽培模式下大面积种植,测定不同栽培模式金线莲多糖含量和黄酮含量的变化,分析金线莲栽培过程中活性成分累积规律。结果:光照强度为3000 lx时,植株的株高、叶片大小、茎粗、鲜重和干重均达到最大;两种模式(大棚和林下)栽培苗随着栽培月龄的增长,多糖含量先减少后增加,黄酮含量则逐渐增加。种植6月后,以林下仿生态种植的金线莲在形态和生物量都显著优于大棚种植,多糖含量比大棚种植高2.9 mg,但黄酮含量差异不显著。结论:不同的光照强度和栽培模式对金线莲的生长、黄酮和多糖的变化有显著影响,金线莲的适宜采收期为林下栽培6个月以上。     

不同栽培方式产地蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量差异分析

目的:比较不同栽培方式、产地蒙古黄芪中黄芪甲苷、总黄酮含量差异。方法:采用HPLC、紫外分光光度法分别测定黄芪甲苷、总黄酮含量并对其结果进行方差分析。结果:育苗移栽和种子直播蒙古黄芪中黄芪甲苷平均质量分数分别为0.151%、0.245%,总黄酮平均质量分数分别为0.508%、0.541%。不同产地移栽蒙古黄芪中黄芪甲苷质量分数为0.061%～0.323%,总黄酮质量分数为0.376%～0.903%;不同产地种子直播蒙古黄芪中黄芪甲苷质量分数为0.161%～0.343%,总黄酮质量分数为0.399%～0.825%。结论:不同栽培方式的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量差异有统计学意义(P0.05),且种子直播黄芪大于育苗移栽黄芪,总黄酮含量差异无统计学意义;不同产地蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量差异有统计学意义。其中,育苗移栽蒙古黄芪中山西朔州市产区的黄芪甲苷含量最高,宁夏河川乡产区所含总黄酮含量最高。种子直播蒙古黄芪中,陕西子洲县西庄乡产区的黄芪甲苷含量最高,陕西府谷县产区的黄芪总黄酮含量最高。     

野生与组培金线莲有效成分的比较及RAPD分析

目的 研究人工栽培金线莲替代金线莲野生资源的可行性.方法 比较金线莲组培苗与野生金线莲药材中多糖、氨基酸及总黄酮的量,采用随机扩增多态性DNA (RAPD)技术对金线莲组培苗及野生药材进行了基因组DNA多态性分析.结果 多糖和总黄酮的比较表明,金线莲组培苗与野生品(台湾)的多糖和总酮量相近;总氨基酸比较表明,金线莲组培苗中总氨基酸达9.17％,高于野生品的总氨基酸量;通过随机扩增多态性DNA (RAPD)技术,从中筛选出了能用于鉴别金线莲组培苗的特异性引物.结论 初步证明通过组织培养获得的金线莲组培苗可以代替其野生品,它是解决金线莲资源紧缺的有效途径之一.     

不同植物基原金线莲生药鉴别

目的对福建金线莲Anoectochilus roxburghii、台湾金线莲A.formosanus和滇越金线莲A.chapaensis进行生药学鉴别。方法采用徒手切片、显微观察和数码照相方法,比较分析不同植物基原金线莲的植物形态特征、根、茎、叶的横切面组织构造及其组织特征,金线莲干燥药材粉末特征。结果福建金线莲和台湾金线莲较滇越金线莲植株小,三者叶脉颜色分别为金黄色、银白色和淡红色,是外观鉴别的依据之一;滇越金线莲根木质部束数量较多,且髓部宽广,茎外韧型维管束数量较多;上表皮细胞形状、中脉上下表面形状与细胞色素分布特点是叶横切面的鉴别点;台湾金线莲上表皮细胞形状为类三角形,其他2种植物为类椭圆形;滇越金线莲中脉上表面较平整,其他2种植物微凹;福建金线莲中脉下表面呈半圆形凸出,其他2种植物微凸,福建金线莲红色物质稀少且位于上表面,台湾金线莲红色物质较多且散在,滇越金线莲有红色物质位于上表皮且集中排一列。结论不同植物基原金线莲植物形态和显微存在差异,为建立金线莲质量标准提供依据。     

福建金线莲DALP遗传多样性分析

目的 通过分子标记技术对不同产地野生福建金线莲及近似种的遗传多样性进行分析,了解不同产福建地金线莲及近似种的遗传差异。方法 采用直接扩增片段长度多态性(DALP)分子标记技术,对产多个产地的野生福建金线莲及近似种的18个居群进行多样性检测。结果 筛选出6个引物组合,总共扩增得到355个多态性位点,遗传多态性为100%,平均每组引物扩增所得多态位点为59.2个。其中14个福建金线莲居群多态百分率为95.77%,其平均观测等位基因数(Na)为1.273 4,有效等位基因数(Ne)为1.074 4,Nei’s基因多样性指数(H)为0.056 2,Shannon信息指数(I)为0.096 9,遗传分化系数(Gst)为0.423 0,基因流(Nm)为0.681 9。结论 不同福建金线莲居群之间存在较高的遗传分化、基因交流较小。地理隔离和资源锐减可能是造成福建金线莲居群间基因流动受到限制的原因。     

不同部位与不同采收期蕲艾精油化学成分的GC-MS分析

目的:分析和比较不同部位及不同采收期蕲艾精油含量与化学成分的差异,为蕲艾的综合开发与合理利用提供科学依据。方法:采用水蒸气蒸馏法(SD)提取蕲艾叶、蕲艾花、蕲艾茎及5月至10月不同采收期的蕲艾叶精油,结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析其化学组成。结果:蕲艾叶精油含量显著高于蕲艾花与蕲艾茎,且蕲艾叶精油化学成分种类与相对含量均高于蕲艾花与蕲艾茎。不同采收期蕲艾精油提取率存在较大差异,其中6月蕲艾精油含量最高。经SD-GC-MS分析表明,不同采收期蕲艾精油均检测出含量较高的桉油精、樟脑、冰片和α-蒎烯等。结论:蕲艾叶为蕲艾的最佳药用部位,且6月为蕲艾的最佳采收期。     

不同生长年限苦参不同部位的生物碱含量

目的: 对不同年限苦参药材茎、叶、芦头、侧根、根5个部分总生物碱与5种单体生物碱进行含量测定。 方法: 采用高效液相色谱法分析不同年限苦参药材不同部位中5种指标性生物碱的含量。 结果: 5种指标性生物碱在不同生长年限 苦参不同部位的分布有不同特点,不同部位槐果碱的含量分布叶>茎>侧根>主根>芦头,苦参碱的分布是叶>茎>芦头>侧根>主根,氧化槐果碱的分布是侧根>主根>芦头>茎>叶,槐定碱的分布是侧根>主根>叶>茎>芦头,氧化苦参碱的分布是侧根>主根>芦头>茎>叶。随着生长年限的增加,各指标性生物碱成分含量随之增加,第4年有效成分增加幅度较小,其中主根中5种指标性成分含量依次为一年生13.58 mg·g^-1,两年生20.49 mg·g^-1,三年生27.74 mg·g^-1,四年生31.32 mg·g^-1。 结论: 上述结果为合理开发利用苦参以及苦参的生长年限提供了实验依据。     

不同采收期、加工方法对溪黄草中咖啡酸和迷迭香酸含量的影响

目的: 考察不同采收期和加工方法对溪黄草中咖啡酸、迷迭香酸含量的影响。 方法: 采用HPLC测定咖啡酸、迷迭香酸含量,色谱条件为Dikma Diamonsil C₁₈(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0~17 min,12%A;17~20 min,12%~25%A;20~50 min,25%A),流速1.0 mL·min^-1,检测波长329 nm,柱温室温,进样量20 μL。以咖啡酸、迷迭香酸含量为指标,考察采收期(5~11月份)和干燥方法(烘干、晒干和阴干)对溪黄草药材质量的影响。 结果: 不同采收期对溪黄草茎、叶中咖啡酸含量影响较小,但对迷迭香酸含量的影响较大。3种干燥方法处理后迷迭香酸提取率分别为1.365%,1.790%,1.577%,咖啡酸提取率分别为0.057%,0.053%,0.055%。 结论: 以7月份采收的药材质量最佳,可每年采收2次,采收时间为7月和11月;药材加工方法采用自然晒干为最佳。     

基于非靶向代谢组学的蜘蛛香不同部位差异代谢物分析

目的 研究蜘蛛香不同部位的代谢物差异,促进蜘蛛香资源的综合利用。方法 利用非靶向代谢组学技术,对蜘蛛香的根茎、根和叶3个部位的代谢物进行差异性比较分析。结果 从蜘蛛香的根茎、根和叶中共鉴定出491个代谢物,主要代谢物有挥发油、多糖、氨基酸等。蜘蛛香根茎、根和叶中的代谢物差异显著,根与叶、根茎与叶、根与根茎之间的差异代谢物分别为145、109、122个,根茎和叶中含莪术烯醇、4-羟基肉桂酸、芥子酸胆碱、5-羟基-1-四氢萘酮、4-乙基苯甲醛、松脂醇4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和5-胸苷酸二钠盐较少,而根中较多;根和根茎中含茶碱、芹菜素和阿尔泊酚酸较少,而叶中较多。根茎、根和叶的差异代谢物主要富集在类苯丙酸生物合成通路,氨酰tRNA生物合成通路和丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸代谢通路。结论 蜘蛛香的根茎、根和叶中含有挥发油、多糖、氨基酸等大量的差异代谢物,研究结果可为蜘蛛香不同部位关键代谢物的挖掘和充分利用提供参考。     

HS-SPME-GC-MS联用分析不同栽培品种与蕲艾不同部位的挥发性成分

目的:分析和比较不同栽培品种蕲艾与蕲艾不同部位的顶空固相微萃取的挥发性成分的差异,为蕲艾的综合开发与合理利用提供科学依据。方法:采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)分别提取七尖蕲艾,五尖蕲艾,金艾的叶、籽、茎的挥发性成分,结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析其化学组成,并采用面积归一化法确定各成分的质量分数。结果:相同栽培品种蕲艾叶挥发性成分的种类与质量分数除樟脑外均高于蕲艾籽与蕲艾茎,其中七尖蕲艾叶的挥发性成分的种类与质量分数均高于五尖蕲艾叶及金艾叶。经HS-SPME-GC-MS分析表明,不同栽培品种蕲艾的不同部位均检测出质量分数较高的桉油精,樟脑,侧柏酮,α-蒎烯,1-石竹烯和氧化石竹烯等。结论:七尖蕲艾叶为上述3种栽培品种蕲艾的最佳药用部位,其籽次之。     

黑龙江凤凰山不同海拔及不同采收期辽东楤木叶中2种皂苷类成分含量的比较

目的:比较黑龙江凤凰山地带不同海拔及不同采收期辽东楤木叶中三萜皂苷3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)][β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-刺囊酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯(简写为ECA)和3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯(以下简称为OLA)的含量,了解这一区域采收辽东楤木叶的最佳时间和海拔高度。方法:用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法测试,色谱柱为Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温30℃;流动相为乙腈、水二元梯度系统;进样量10μL,流速1.0 m L·min~(-1);载气流速3.2 L·min~(-1);漂移管温度110℃。结果:两种三萜皂苷在各自测定的范围内均呈良好线性关系(r均为0.999 8),平均加样回收率分别为97.71%,98.06%。各批次供试品中OLA的含量都远高于ECA。从6月初至9月初,两种皂苷含量几乎都呈递增趋势,6月至8月增幅很大,差别显著,8月至9月增幅较小,甚至略减;不同海拔高度条件下同时期的叶中两种皂苷含量没有显著性差异。结论:所用测试方法简单、快捷、重复性好,可为凤凰山地带辽东楤木叶的质量控制提供依据。     

不同产地马齿苋HPLC指纹图谱

目的:建立马齿苋水提液HPLC特征指纹图谱。方法:采用回流提取制备不同产地马齿苋药材供试品溶液,流动相乙腈-甲醇(7:3)-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱,检测波长320 nm,建立马齿苋水提液的HPLC指纹图谱,并进行相似度评价。结果:10种不同产地马齿苋供试品溶液指纹图谱中确定了11个共有峰,5号峰咖啡酸为参照峰,10批样品指纹图谱中12个共有峰的相似度均>0.80。结论:该方法具有较好的重复性和稳定性,所建立的马齿苋HPLC指纹图谱标定了11个共有峰,色谱峰的重叠率较高,说明马齿苋没有明显的地域差异性,该方法将为马齿苋药材质量控制提供可靠依据,为其相关及临床应用研究提供借鉴。     

不同寄主上的桑寄生药材毒性的比较研究

目的： 比较研究不同寄主来源的桑寄生（Taxillus sutchuenensis）药材的毒性。方法： 对6种不同寄主上的桑寄生药材进行急性毒性实验,测定半数致死量（LD₅₀）或最大耐受量（MTD）。并根据寄主来源不同,将98只昆明种小鼠随机分为对照组、沙梨组、李树组、白杨组、柞木组、夹竹桃组和漆树组,除对照组,其余各组小鼠每日ig 7.5 g·kg^-1水提物1次,共4周。测定血清中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）及肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）含量,并观察肝、肾组织病理改变。结果： 夹竹桃上的桑寄生、漆树上的桑寄生毒性明显,LD₅₀及95%可信限分别为109.276 （96.837~122.645） g·kg^-1和77.286（66.891~89.296）g·kg^-1;其余4种寄主上的桑寄生药材未出现死亡。与对照组比较,夹竹桃上的桑寄生能引起Cr指标的升高,并对小鼠肾组织影响较明显;而其他各寄主上的桑寄生组肝、肾功能检测指标差异不明显,对小鼠肝、肾组织损伤也较轻。结论： 寄主为夹竹桃、漆树有毒木类的桑寄生药材有明显的毒性。     

不同产地粉萆薢总皂苷含量测定

目的:建立粉萆薢总皂苷含量测定方法.方法:以薯蓣皂苷元为对照品,高氯酸为显色剂,测定波长408 nm,采用可见分光光度法测定了5个不同产地粉草薢药材总皂苷含量.结果:薯蓣皂苷元线性范围为1.55 ～ 12.42 mg·L-1,r=0.999 5(n=6),加样回收率为100.69％,RSD 2.75％,不同产地粉萆薢总皂苷含量分别为广西玉林2.85％,RSD 1.32％;广西南宁2.76％,RSD 1.16％;浙江临安2.54％,RSD 1.38％;湖北宜昌1.94％,RSD 1.83％;四川崇州0.84％,RSD 1.75％.结论:测定方法简便,准确,重复性好,可作为粉萆薢总皂苷的含量测定.     

川芎不同部位及不同加工方法的川芎饮片中挥发油含量及化学成分对比

目的:以挥发油含量、苯酞类化合物的总相对质量分数为指标,对川芎3种部位,3种不同加工法的川芎饮片进行对比研究。方法:采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,采用GC-MS分析鉴定挥发油所含化学成分,归一化法测定各成分的相对质量分数。结果:川芎3种部位的挥发油含量差别较大,含量高低依次为根茎(1. 12%)须根(0. 75%)地上部分(0. 41%),经GC-MS分析,挥发油中的苯酞类成分的总相对质量分数依次为须根(83. 29%)根茎(44. 5%)地上部分(39. 95%); 3种不同加工方法的川芎饮片中,挥发油质量分数依次为C(0. 87%) A(0. 75%) B(0. 7%),经GC-MS分析,苯酞类成分的总相对质量分数依次为C(79. 14%) A(73. 09%) B(67. 29%)。结论:川芎须根挥发油中苯酞类化合物含量较根茎高,可对其进行适当的资源利用;不同加工方法的川芎饮片挥发油含量及化学成分有显著差异;川芎鲜切饮片中挥发油及苯酞类化合物含量更高,可作为一种川芎饮片的新型加工方式。