旋毛虫抗原基因Ts88的克隆及鉴定

目的　获取旋毛虫具有抗原性的新基因。方法　应用旋毛虫免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库约 3× 10 5重组噬菌斑进行筛选。基因克隆、DNA测序及 5′ -RACE获cDNA全长 ;采用ESEE、DNAstar软件及核苷酸序列数据库 (GenBank)进行cDNA序列分析。结果与结论　免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 3个阳性克隆。其中的Ts88克隆cDNA全长为 196 6bp ,编码 4 84个氨基酸 ,含有一个PWWP功能结构域及多个抗原表位。Ts88cDNA是一个尚未见报道的旋毛虫抗原新基因。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选，并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆PET－28a( )表达载体，IPTG诱导表达后用SDS－PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87；成功构建重组表达质粒PET－28a( )/Ts87。诱导表达该融合蛋白，SDS－PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白，与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87，与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应，PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫成虫期特异性基因的筛选与序列分析

目的　获得旋毛虫成虫期特异性基因序列。方法　应用旋毛虫成虫期特异性探针对成虫cDNA文库进行杂交筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。结果　利用消减杂交 (subtractedhybridization)获得的旋毛虫成虫期特异性探针筛选成虫cDNA文库 ,获得一个长 16 2 9bp的基因。其开放阅读框架由 146 4个核苷酸组成 ,编码 487个氨基酸。序列分析表明 ,该序列是一个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,在 2 0 7～ 2 70位氨基酸间存在两个锌指结构 ,在 5 2～ 6 4,10 8～ 116 ,137～ 16 3,2 2 6～ 2 6 0位氨基酸处存在预测的抗原表位。结论　获得旋毛虫成虫期特异性基因 ,其编码的蛋白具有一定的抗原表位     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子     

自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库

目的　采用自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库并寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。　方法　用感染日本血吸虫后的自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆、测序,对核酸序列进行分析,确定目的基因。　结果　从大陆株日本血吸虫成虫λZAPIIcDNA文库筛到26个阳性克隆,经初步鉴定获3种编码蛋白分子的基因:副肌球蛋白,谷胱甘肽S转移酶,羟基类固醇脱氢酶。　结论　感染日本血吸虫后的自愈水牛血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,可用于寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。     

旋毛虫肌幼虫p45cDNA的克隆及鉴定

目的本研究根据GenBank中旋毛虫45kDa抗原基因的序列设计引物,采用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p45cDNA,并克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析。获得827bp的p45cD-NA。该序列与GenBank中的旋毛虫p45基因序列相比共有1个核苷酸发生改变,二者的同源性为99%,其编码蛋白质由268个氨基酸组成,与45kDa抗原的同源性为99%。将p45cDNA克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3）后,经IPTG诱导表达出约30kDa的重组蛋白。Western-blot检测表明,p45重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有良好的抗原性。     

旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析

目的克隆一个新的旋毛虫基因即亲肌肉抗原(myophilin)并分析其序列同源性,为旋毛虫病疫苗的研制奠定基础。方法检索GenBank旋毛虫基因组数据库,获得旋毛虫亲肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0软件设计引物(上、下游引物分别含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点)。收集云南株旋毛虫肌幼虫,提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收后与克隆载体pMD-19T分别用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物以3︰1的比例与pMD-19T连接,然后转化到DH5a大肠埃希菌感受态细胞中,用Amp抗性培养基培养,阳性克隆提质粒后做PCR及双酶切鉴定,阳性菌液进行测序,测序结果与检索基因核苷酸序列通过DNAMAN软件比较,分析其同源性。结果 RT-PCR扩增出旋毛虫亲肌肉抗原全长基因序列,大小为579bp;亲肌肉抗原基因重组质粒经双酶切得到的片段大小分别为579、2 300和300bp,与预期值相符;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%。结论成功克隆出旋毛虫亲肌肉抗原基因,为旋毛虫病疫苗的研制奠定了基础。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的　筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。　方法　用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清 ,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增 ,采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序 ,与GeneBank中的已知序列进行比对分析。　结果　共获得 2 6个阳性克隆 ,其PCR产物大小约 0 .5～ 3kb。在进行测序的 8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列 (GeneBank登录号为AY3 2 2 14 8)和 1个新基因 (命名为Sj F1,GeneBank登录号为AY2 61995 )。Sj F1编码的蛋白理论分子质量为 13 .45ku ,等电点为 6.2 9,富含α螺旋和随机卷曲 ,含多个蛋白激酶磷酸化位点 ,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个豆蔻酸位点。　结论　Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子 ,该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值 ,有待进一步研究。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的　观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法　将旋毛虫肌幼虫编码 31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠 ,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测 ,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Westernblot分析。结果　IFAT表明 pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应 ,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光。Westernblot检测结果显示 ,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的 31kDa抗原组分 ,而 pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应。结论　旋毛虫DNA疫苗 pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

旋毛虫成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析

目的获取编码旋毛虫5日龄成虫(AD5)期特异性基因完整开放阅读框架(openreadingframe,ORF)cD-NA分子。方法利用地高辛标记的AD5期特异性cDNA片段T671作为探针对AD5cDNA文库进行核酸杂交筛选,将筛选出的阳性克隆进行测序,利用分子生物学软件进行分析。结果获得1个全长1132bp的cDNA分子,该cD-NA含有1个1032bp完整的ORF,该ORF编码1个343个氨基酸残基组成的多肽,其分子量理论推导值为35.1kDa,等电点(isoelectricpoint,IP)为4.8。InterProScan分析显示117～120氨基酸残基(SGYG)为粘多糖结合位点,27～86氨基酸残基为一线虫表皮胶原蛋白N-末端区结构域,153～328氨基酸残基为胶原蛋白螺旋三联体重复区(G-x-y)结构域。SignalPV2.0分析显示,在1～43氨基酸区域为信号肽。Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA分子。但与表皮胶原蛋白同源性较高,大于40％。结论筛选获得一个新的编码AD5期特异性基因的完整ORF的cDNA分子。     

旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的　克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法　根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果　RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论　应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;结果还提示在旋毛虫河南株之间可能存在有遗传多态性     

旋毛虫成囊前期幼虫的收集

目的 探索旋毛虫成囊前期幼虫的收集时间与方法.方法 20只成年大鼠,每只大鼠经口感染3000条旋毛虫脱囊幼虫,分别于第14、15、16、17、18、19、20天将大鼠处死,用人工胃蛋白酶消化肌肉收集旋毛虫.结果 感染后第14、15、16大膈肌均未见旋毛虫,第17、18、19、20天膈肌有旋毛虫的侵入并逐渐增多;第14、15、16天均未收集到旋毛虫,第17、18、19、20天平均每只大鼠分别收集5000、8000、10000、30000条旋毛虫.结论 旋毛虫在感染后第20天是旋毛虫成囊前期幼虫收集的最佳时期.人工胃蛋白酶消化肌肉可以收集成囊前期幼虫.     

旋毛虫排泄分泌抗原对小鼠的保护性免疫

目的比较旋毛虫成虫排泄分泌抗原(ES抗原)、肌幼虫ES抗原、成虫和肌幼虫ES混合抗原对小鼠的免疫保护作用。方法用生理盐水培养法从培养液中提取成虫ES抗原、肌幼虫ES抗原,分别用成虫ES抗原、肌幼虫ES抗原、成虫和肌幼虫ES混合抗原免疫小鼠,同时设佐剂组和对照组,间隔7d共免疫3次。末次免疫后7天,每只小鼠用200条旋毛虫感染期幼虫经口进行攻击感染。感染后7天和30天检查各组小鼠肠道成虫数和肌幼虫数。结果旋毛虫成虫ES抗原组、肌幼虫ES抗原组、成虫和肌幼虫ES混合抗原组的成虫减虫率分别为87.95%、69.48%、84.34%,肌幼虫减虫率分别为74.79%、87.97%、86.87%。成虫ES抗原组、成虫与肌幼虫ES抗原混合组的成虫减虫率均高于肌幼虫ES抗原组(P均<0.05)。肌幼虫ES抗原组、成虫与肌幼虫ES抗原混合组的肌幼虫减虫率均高于成虫ES抗原组(P均<0.01)。结论旋毛虫成虫和肌幼虫ES混合抗原均能诱导小鼠产生抗成虫及肌幼虫较强的免疫力。