恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的　探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法　用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果　重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论　HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 ,HRP2重组蛋白疫苗具有潜在的应用前景     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的用所构建的弓形虫pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答.方法碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1质粒,免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射100ug, 两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.于免疫后第50天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清IgG抗体90天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异.结论 pcDNA3-ROP1质粒DNA免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生IgG抗体.     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB／c小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3－Pf8，PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中pcDNA3－Pf 8，ELISA、T淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用PCR法从上述组织中均检测到pcDNA3－Pf8，ELISA法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达12560，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒pcDNA 3-Pf 8 直接免疫接种, 能特异性地剌激BALB/c 小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答, 其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　观察编码旋毛虫相对分子质量(Mr)31000抗原的DNA疫苗(重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。　方法　通过用阳离子脂质体Lipofectamine2000将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞,G418筛选阳性克隆,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、间接荧光抗体试验(IFAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)对表达产物进行鉴定。　结果　RT PCR结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在876bp处有一条带,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约31000的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。　结论　重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫     

旋毛虫肌幼虫核酸疫苗的构建及其在小鼠体内的表达

目的　构建和表达旋毛虫肌幼虫编码相对分子质量 (Mr) 31000抗原结构基因 (TspE1)的重组质粒。　方法　通过逆转录 聚合酶链反应 (RT-PCR)特异性扩增TspE1基因 ,构建重组质粒 pUC18-TspE1,并将TspE1基因亚克隆入真核表达载体 pcDNA3中。用基因枪免疫小鼠 ,通过苏木素 伊红 (HE)染色及免疫组化观察重组质粒在皮肤组织内的表达情况。　结果与结论　成功构建 pcDNA3-TspE1重组质粒 ,并在小鼠体内表达。     

恶性疟原虫Pf12基因重组质粒DNA接种诱导小鼠的免疫应答

目的　观察重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠所产生的免疫应答 ,分析Pf12基因的抗原性和作为疫苗抗原候选分子的可能性。方法　构建重组质粒VR10 12 -Pf12 ,直接免疫BALB/c小鼠 ,通过NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平、ELISA、体外抑虫试验测定 ,观察其诱导的细胞和体液应答以及体外抑虫效果。结果　重组质粒VR10 12 -Pf12免疫BALB/c小鼠 ,NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平明显高于对照组 (P <0 0 1) ,诱导小鼠产生的抗体水平明显增高 (P <0 0 1) ,免疫血清在体外能抑制恶性疟原虫的生长、发育。结论　重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠产生一定水平的体液和细胞免疫应答 ,其免疫血清在体外对恶性疟原虫的生长、发育有明显的抑制作用。     

不同旋毛虫粗抗原对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤抑制作用观察

目的研究不同旋毛虫抗原对BALB／c小鼠体内的SP2／0骨髓瘤的抑制作用。方法对BALB／c小鼠经腹腔和肌肉注射不同抗原，3d后对小鼠荷瘤，30d后观察小鼠体内肿瘤的大小，检测小鼠机体的免疫状态，评价不同旋毛虫抗原对小鼠体内的肿瘤的抑制作用。结果腹腔注射肌幼虫可溶性粗抗原、成虫可溶性粗抗原和新生幼虫可溶性粗抗原组的抑瘤效果略好于肌肉注射组。肌幼虫ES抗原组的抑瘤效果最好，成虫ES抗原组次之，但比3种虫体抗原组的抑瘤效果好，3种虫体粗抗原组的抑瘤效果间没有明显差别。结论不同的旋毛虫抗原都有一定的抑制肿瘤的作用，腹腔注射肌幼虫ES抗原能够很好的抑制小鼠体内肿瘤的生长。     

细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗体外瞬时表达及对小鼠诱导的免疫应答

目的　检测细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗(pcDNA3 Eg95)体外瞬时表达,探讨其诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。　方法　pcDNA3 Eg95经脂质体转染HeLa细胞瞬时表达。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Eg95抗原信使RNA(mRNA)在HeLa细胞中的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(Westernblot ting)检测Eg95蛋白的瞬时表达情况。pcDNA3 Eg95基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测IgG和IgG2a水平,四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应。　结果　RTPCR检测结果显示,pcD NA3 Eg95瞬时表达组有Eg95抗原基因mRNA表达,ELISA和Westernblotting检测结果表明,可在HeLa细胞中特异性表达Eg95蛋白。用pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫BALB/c小鼠,第3周出现特异性IgG免疫应答,持续升高至第10周,显著高于对照组。从第2周开始,小鼠血清IgG2a应答即为阳性,且长时间(至第10周 )维持较高水平,与pcD NA3空质粒组比较,其差异具有非常显著性意义(P<0.01)。用原核表达的Eg95重组蛋白刺激免疫小鼠脾细胞,有明显的T细胞增殖反应。pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫组刺激指数明显高于pcDNA3空质粒组(P<0.01)。结论　pcDNA3 Eg95基因疫苗可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究

目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB／c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平（ELISA）和体外循异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL－2、IL－4、IL－10、IFN－γ表达水平。结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效介明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL－2和IFN－γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL－4和IL－10 mRNA转录水平在3组中无明显变化。结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫。     

多发性骨髓瘤MUC1-2VNTR基因疫苗诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的观察黏蛋白1两串联重复区（MUC1-2VNTR）基因疫苗诱导BALB／c小鼠体液及细胞免疫应答的效果。方法将含MUC12VNTR的重组质粒peDNA3．1-2VNTR／myc-hisB免疫小鼠,免疫后采用ELISA动态检测血清中抗VNTR特异性抗体的水平,乳酸脱氢酶法检测细胞毒性T细胞（CTL）反应活性,MTS法检测脾淋巴细胞增殖活性。结果重组质粒免疫组小鼠血清中检出了MUC1-2VNTR抗原特异性抗体。用重组质粒免疫BALB／c小鼠后,在效靶比为80：1时可显著地诱导特异性CTL应答。在MUC1-2VNTR抗原肽的刺激下,免疫小鼠脾淋巴细胞得到增殖;与空质粒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论MUC1-2VNTR基因疫苗可诱导小鼠产生特异性细胞及体液免疫应答,对多发性骨髓瘤的疫苗治疗有重要意义。     

旋毛虫肌幼虫特异性抗原的鉴定

目的 寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原。方法 应用SDS—PAGE和Western blot对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原经SDS—PAGE后显示29条蛋白带，分子量范围在112—12kDa之间，其中65、43、42、31、30、20、17、16kDa为主带。112、110、108、102、97、95、65、63、58、55、53、49、45、43、42kDa蛋白组分与并殖吸虫感染的大鼠及患者血清、华支睾吸虫病、血吸虫病及囊尾蚴病患者血清均具有明显的交叉反应带；24—20kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应，而不与其它寄生虫感染的动物或患者血清、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中24—20kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原，可用于旋毛虫病的免疫学诊断及血清流行病学调杏。     

旋毛虫成虫可溶性粗抗原对小鼠的免疫保护作用

本文应用人工感染的方法从大白鼠获得大量成虫。经冻融、超声粉碎、高速离心制备出成虫可溶性粗抗原。将不同剂量的抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化后间隔1周共免疫小白鼠3次。最后一次免疫后间隔1周每鼠攻击感染130条感染性肌幼虫,攻击感染后1周剖检成虫、新生幼虫,攻击感染后35天剖检肌幼虫。试验结果表明,以每只小白鼠免疫200μg成虫可溶性粗抗原所诱导的免疫力最好,诱导成虫减虫率达94.65％,肌幼虫减虫率达95.60％。初步研究表明,旋毛虫成虫可溶性抗原是很好的免疫原。     

旋毛虫感染小鼠膈肌虫荷与血清及肉汁抗体水平的研究

目的观察旋毛虫感染小鼠膈肌虫荷(larvae per gram diaphragm,lpgd)与血清及肉汁抗体水平的关系。方法将32只雄性昆明小鼠随机分成4组(每组8只),每只分别感染50(A组)、100(B组)、300(C组)、500条(D组)旋毛虫幼虫,感染后42d剖杀,收集血清及肉汁,观察膈肌虫荷并用旋毛虫肌幼虫ES抗原ELISA检测血清及肉汁抗体。另将50只小鼠随机分成5组(每组10只),每组分别感染旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)及纳氏旋毛虫(T7),每只感染500条幼虫,感染后42d剖杀,观察感染不同种旋毛虫小鼠的膈肌虫荷与血清及肉汁抗体水平。结果感染旋毛虫的A、B、C、D4组小鼠的膈肌虫荷与血清及肉汁抗体水平均无相关性(P>0.05),但与感染剂量呈正相关(P<0.05),每组小鼠的血清与肉汁抗体水平也均具有相关性(P<0.05)。5种旋毛虫感染小鼠的膈肌虫荷与血清及肉汁抗体水平相比均无相关性(P>0.05),但血清与肉汁抗体水平相比均具有相关性(P<0.05)。旋毛虫感染小鼠的血清及肉汁抗体水平明显高于其他4种旋毛虫(乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫及纳氏旋毛虫)感染小鼠的血清和肉汁抗体水平(P<0.05)。结论旋毛虫肌幼虫ES抗原可用于其他4种旋毛虫(乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫、纳氏旋毛虫)感染小鼠血清及肉汁中抗旋毛虫抗体的检测。     

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以20μg/只的剂量分3次免疫小鼠后，攻击感染旋毛虫肌幼虫200条／只，检查旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染35d的肌幼虫数并计算减虫率，同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果WN10免疫小鼠后获得旋毛虫7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为64．28％和61．21％，均与感染对照组和佐剂对照组差异显著；获得雌虫产新生幼虫的减虫率为16．46％，与感染对照组和佐剂对照组差异不显著；WN10免疫组小鼠在第3次免疫后1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG，在攻击感染旋毛虫9周后仍维持在较高水平。结论 编码旋毛虫新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白可诱导小鼠产生较强的抗旋毛虫保护性免疫。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的　在体外真核细胞 COS7中表达重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87,为旋毛虫病 DNA疫苗的研究奠定基础。　方法　将重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87经脂质体 L ipofectamine介导 ,体外转染真核细胞 COS7,通过细胞免疫组化 ,细胞裂解物的 SDS- PAGE电泳和 Western- blot分析检测表达产物。　结果　重组质粒能够在 COS7中表达出约 38ku的目的蛋白 ,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。　结论　构建的重组质粒可在体外真核细胞 COS7中成功表达。     

旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究

目的　寻找旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)物中的特异性诊断抗原。　方法　应用SDSPAGE和Western印迹对旋毛虫肌幼虫体外培养18、30h后的ES抗原中的蛋白组分进行研究。　结果　旋毛虫肌幼虫培养18、30h后得到的ES抗原组分大致相同,两种ES抗原中主要蛋白带的分子量为112、110、108、97、53、49、45、42、35、23和16kDa。18hES抗原中的102、97、95和53kDa以及30hES抗原中的53、49、45和43kDa均与并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病及囊尾蚴病患者血清发生明显的交叉反应。ES抗原中的23kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应,而不与上述其它寄生虫感染者、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。　结论　旋毛虫肌幼虫ES抗原中的23kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原,可用于旋毛虫病的血清学诊断及血清流行病学调查。     

旋毛虫排泄分泌抗原对小鼠的保护性免疫

目的比较旋毛虫成虫排泄分泌抗原(ES抗原)、肌幼虫ES抗原、成虫和肌幼虫ES混合抗原对小鼠的免疫保护作用。方法用生理盐水培养法从培养液中提取成虫ES抗原、肌幼虫ES抗原,分别用成虫ES抗原、肌幼虫ES抗原、成虫和肌幼虫ES混合抗原免疫小鼠,同时设佐剂组和对照组,间隔7d共免疫3次。末次免疫后7天,每只小鼠用200条旋毛虫感染期幼虫经口进行攻击感染。感染后7天和30天检查各组小鼠肠道成虫数和肌幼虫数。结果旋毛虫成虫ES抗原组、肌幼虫ES抗原组、成虫和肌幼虫ES混合抗原组的成虫减虫率分别为87.95%、69.48%、84.34%,肌幼虫减虫率分别为74.79%、87.97%、86.87%。成虫ES抗原组、成虫与肌幼虫ES抗原混合组的成虫减虫率均高于肌幼虫ES抗原组(P均<0.05)。肌幼虫ES抗原组、成虫与肌幼虫ES抗原混合组的肌幼虫减虫率均高于成虫ES抗原组(P均<0.01)。结论旋毛虫成虫和肌幼虫ES混合抗原均能诱导小鼠产生抗成虫及肌幼虫较强的免疫力。     

旋毛虫成虫可溶性抗原和排泄分泌抗原对小鼠免疫保护作用的比较研究

目的　比较旋毛虫成虫可溶性抗原和排泄分泌抗原对小鼠的免疫保护作用。方法　收集人工感染大鼠小肠内的成虫, 经研磨和冻融制备成虫可溶性抗原。采用体外培养的方法从培养液中提取旋毛虫成虫排泄分泌抗原。分别用两种抗原免疫小鼠, 间隔１ 周共免疫３ 次, 末次免疫后１ 周, 每只小鼠攻击感染１００ 条旋毛虫感染性肌肉幼虫。感染后１ 周检查小鼠小肠内成虫数量和雌虫生殖力, 感染后５ 周检查肌肉幼虫负荷。结果　成虫可溶性抗原诱导的成虫减虫率、新生幼虫减虫率和肌肉幼虫减虫率分别为７９５５ ％ 、６２２５ ％ 和６５０ ％ 。成虫排泄分泌抗原诱导的成虫减虫率、新生幼虫减虫率和肌肉幼虫减虫率分别是９７２７ ％ 、８６６０ ％ 和９００ ％ 。结论　实验结果表明旋毛虫成虫可溶性抗原和成虫排泄分泌抗原均能够诱导宿主产生较强的抗攻击感染的免疫力, 但后者的免疫原性更强。     

免疫血清对旋毛虫感染性幼虫侵入肠上皮细胞及其发育的影响

目的观察旋毛虫感染性幼虫排泄分泌(ES)抗原与旋毛虫感染性幼虫表面抗原免疫鼠血清对幼虫侵入HCT-8肠上皮细胞及其发育的影响。方法将旋毛虫感染性幼虫接种至半固体培养基(RPMI1640培养基+1.75%琼脂糖)+HCT-8细胞中,37℃5%CO2培养12、24、36、72和96h后镜下观察幼虫发育情况;将幼虫接种至含免疫血清的半固体培养基+HCT-8细胞中,培养15min后镜下观察幼虫形态及其对肠上皮细胞的侵入情况,36h后应用间接荧光抗体试验(IFAT)观察幼虫蜕皮,并计数Ⅰ期和Ⅱ～Ⅳ期幼虫。结果幼虫在半固体培养基培养12h可侵入HCT-8细胞单层,36～72h幼虫可蜕皮1～2次,培养96h可见早期成虫。在含ES抗原免疫血清与感染鼠血清条件下培养15min,幼虫头端可见免疫复合物形成的帽样结构,但在含表面抗原免疫血清、正常鼠血清或不含免疫血清条件下培养的幼虫头端则无帽样结构,头端带有帽样结构的幼虫不能侵入HCT-8细胞单层。在含ES抗原与表面抗原免疫血清条件下发育至Ⅱ～Ⅳ期幼虫的百分比(2.25%、2.2%)均明显低于含正常鼠血清条件下培养的幼虫(24.7%)(P0.05)。结论旋毛虫ES抗原免疫血清可阻止幼虫对肠上皮细胞的侵入,ES抗原及表面抗原免疫血清均可阻止部分幼虫的发育(蜕皮)。