保护性免疫血清及单克隆抗体筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　为寻找有效的抗日本血吸虫感染疫苗候选抗原分子。方法　用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,再用同法免疫鼠脾细胞制备的单克隆抗体对所获阳性克隆进行再筛选 ,并对免疫筛选的阳性克隆的cDNA插入片段进行PCR扩增。结果　兔免疫血清确定 12个阳性克隆 ,其中 6个克隆与 2株以上的单抗呈阳性反应 :PCR扩增cDNA插入片段大小约 40 0bp～ 1 4kb左右。结论　已筛选到与致弱尾蚴免疫兔血清及同法免疫制备单抗产生特异反应的阳性克隆 ,获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。     

紫外线致弱童虫免疫家兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因。　方法　用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cD?鄄NA文库 ,对阳性重组子进行克隆、测序 ,利用软件对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出 6种蛋白分子基因 :3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) ,丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin) ,线粒体编码蛋白 ,肌球蛋白 (myosin)部分重链基因以及两个未知新基因。　结论　紫外线致弱疫苗免疫血清筛选cDNA文库为寻找新的抗血吸虫病疫苗提供了又一途径。     

紫外线致弱尾蚴免疫猪血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 寻找紫外线致弱日本血吸虫尾蚴中起免疫保护作用的候选抗原分子,为血吸虫疫苗研究提供新的候选靶位抗原.方法用紫外线照射致弱尾蚴免疫猪血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,测定用于筛选的cDNA文库滴度,选用最佳滴度的cDNA文库用于筛库.结果测得最佳cDNA文库的滴度为1.89×109 ρfu/mL,经3轮筛选,致弱尾蚴组分别获得20个、10个阳性克隆,经3轮筛选获7个阳性克隆;对照尾蚴组获15个和9个阳性克隆,经3轮筛选获3个阳性克隆;无尾蚴感染组未获阳性克隆.结论获得的阳性克隆可能为寻找编码抗日本血吸虫感染的抗原基因提供了材料与方向.     

蒿甲醚预防日本血吸虫病诱导的兔特异抗体相关靶抗原编码基因的筛选

目的寻找应用蒿甲醚预防血吸虫后,引起免疫保护作用的抗原分子,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法感染血吸虫7天后的家免口服蒿甲醚,收集血清,用蒿甲醚预防后的免疫免血清筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫 cDNA 文库,并对阳性克隆的插入基因片段进行 PCR 扩增及测序分析。结果经三轮筛选,获8个阳性克隆。测序分折所获的这8个序列,其中5个序列分别与日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Sj GAPDH)基因同源,其余3个序列为日本血吸虫28kD 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj.GST)基因。结论 Sj.GAPDH 和 Sj.28kDGST 可能是蒿甲醚杀伤血吸虫后,引起对再感染起免疫保护作用的抗原分子。     

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后，将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示，插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0．8～2．0kb之间，选取其中4个经DNA测序分析，发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因，分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase-like gene，并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子，这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

日本血吸虫肌动蛋白轻链基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因,为寻找日本血吸虫新的候选疫苗奠定基础。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果发现xzw00081克隆的cDNA序列为日本血吸虫新基因并获得GenBank登录号(AY225851)。该cDNA序列与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,核苷酸水平的同源性为84%;氨基酸水平的同源性为86%;编码蛋白的理论相对分子质量为1053888,等电点为696;抗原表位可能位于氨基酸序列158～184处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因长374bp,编码88个氨基酸,与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的　从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因 ,为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。　方法　构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。　结果　获得了 1个日本血吸虫新基因 ,全长 14 3 9bp ,编码 44 3个氨基酸 ,与肝片形吸虫微管蛋白基因具有 79%的同源性。编码蛋白的理论分子质量为 7.2 198ku ,等电点为 9.12 ;抗原表位可能位于cDNA序列 3 73～ 3 96处。　结论　表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

旋毛虫成虫cDNA文库免疫筛选及序列分析

目的　为获得旋毛虫成虫抗原基因。　方法　应用免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行免疫筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。　结果　免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 9个阳性克隆。对其中的Ts87进行测序 ,又采用 5′ RACE ,获取全长为 1172bp的cDNA片段 ,该基因编码 3 47个氨基酸。序列分析表明 ,克隆Ts87是个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,存在预测的抗原表位。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原新基因。     

东方田鼠天然抗体相关的日本血吸虫抗原基因筛选和克隆

目的　研究东方田鼠对日本血吸虫感染天然抵抗力的蛋白分子基因。　方法　用未感染日本血吸虫的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫 c DNA文库 ,将阳性重组子克隆及测序。利用软件和互联网对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出编码东方田鼠天然抵抗力相关的 7种蛋白分子基因 :三磷酸甘油醛脱氢酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、 2 2 .6 k Da膜相关抗原、副肌球蛋白、细胞色素 C及组织蛋白酶 B。　结论　东方田鼠对日本血吸虫的天然抵抗力可能有许多蛋白分子参与。     

日本血吸虫(中国大陆株)基因工程疫苗的研究

本文报道应用PCR技术或RT－PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库或成虫mRNA中扩增到Sj28GST、C－Sjparamyosin、H-Sj23、Sj14、Sj22．6和Sj．TPI6个编码日本血吸虫中国大陆株抗原的基因，并把它们克隆入适合载体中，在大肠杆菌系统和蚕核型多角体病毒（BmNPV）系统中进行表达．免疫学检测证明这6种基因重组抗原都具有较好的抗原性。我们进一步应用4种比较成熟的基因重组抗原Sj26GST、Sj28GST、C－Sj．paramyosin和H－Sj23进行3批绵羊试验和1批黄、水牛田间试验，评估这几种重组抗原在绵羊和黄、水牛中的免疫保护效果，rSj26GST和rSj28GST分别获得62．1％和50.4％－68.5％的显著保护；n－paramyosin获得42.9％－55．3％、r－C－paramyosin获得44．2％－47．1％的显著保护，r－H－Sj23为51．2％－66．1％的显著保护．各组免疫后的粪便虫卵数和组织虫卵数也有不同程度的减少．用r－C－Sjparamyosin、r－Sj28GST和r－H－Sj23免疫典、水牛在血吸虫重疫区田间试验的结果表明，减虫率水牛高于黄牛，显示上述试验的3种日本血吸虫重组分子抗原有希望成为家畜日本血吸虫病的候选疫苗抗原．     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

Protective immunity induced by phage displayed mitochondrial related peptides of Schistosoma japonicum

New antigens and strategies are necessary for vaccine development against schistosomiasis japonica. Using a pool of 43 high titred anti-SWA sera from individuals residing in an Schistosoma japonicum endemic area of China, we have cloned a S. japonicum gene by cDNA library screening. The recombinant Sj338 protein has 44-46% identity to a mitochondrial precursor receptor protein of humans and rats. Immunization of mice with the recombinant Sj338 conferred 27-32% (p<0.01) reduction in worm burdens following cercarial challenge. In an effort to identify protective epitopes in Sj338 and increase the level of protection, we screened a random 12-mer peptide library constructed in M13 using a polyspecific anti-Sj338 rabbit serum. After five rounds of biopanning, we identified 30 reactive clones consisting of 11 distinct peptide sequences. These clones shared limited primary sequence homology with the recombinant Sj338 protein. Anti-sera raised against these phage clones recognized recombinant Sj338 and SWAP by Western blot. In murine vaccination experiments using whole recombinant phage without adjuvant, four of these clones demonstrated worm reductions of 11.6-25.1% (p=ns - 0.05) compared to M13 vaccinated animals. Animals vaccinated with all four of these phage demonstrated 34.2% (p<0.01) worm reduction compared to controls vaccinated with M13 clone. These data suggest that mimotope peptides are potential vaccine candidates for S. japonicum.