旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的　克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。　 方法　大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。　 结果　SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。　结论　旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。     

旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析

目的克隆一个新的旋毛虫基因即亲肌肉抗原(myophilin)并分析其序列同源性,为旋毛虫病疫苗的研制奠定基础。方法检索GenBank旋毛虫基因组数据库,获得旋毛虫亲肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0软件设计引物(上、下游引物分别含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点)。收集云南株旋毛虫肌幼虫,提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收后与克隆载体pMD-19T分别用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物以3︰1的比例与pMD-19T连接,然后转化到DH5a大肠埃希菌感受态细胞中,用Amp抗性培养基培养,阳性克隆提质粒后做PCR及双酶切鉴定,阳性菌液进行测序,测序结果与检索基因核苷酸序列通过DNAMAN软件比较,分析其同源性。结果 RT-PCR扩增出旋毛虫亲肌肉抗原全长基因序列,大小为579bp;亲肌肉抗原基因重组质粒经双酶切得到的片段大小分别为579、2 300和300bp,与预期值相符;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%。结论成功克隆出旋毛虫亲肌肉抗原基因,为旋毛虫病疫苗的研制奠定了基础。     

旋毛虫ES抗原基因的克隆和序列分析

目的　完成旋毛虫ES抗原 (Excretory -secretoryAntigen)中 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因的克隆和测序 ,并与已发表的该两种基因的相关序列比较、分析。方法　通过RT -PCR ,从旋毛虫幼虫总RNA中扩增得到特异性片段 ,利用TA克隆将PCR产物克隆入 pUC -T载体中并进行测序及同源性比较。 结果　RT -PCR扩增得到 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,序列分析表明 ,其核苷酸序列与已发表的 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原的同源性均为 99%。结论　成功提取了旋毛虫幼虫的总RNA ,并用PT -PCR方法克隆了 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,这为两基因的表达及在医学、兽医学中应用研究奠定了基础。     

河南猪株旋毛虫18S rRNA基因的同源性序列分析

目的通过分析18SrRNA基因序列同源性,对河南猪株旋毛虫进行分子鉴定及分类。方法收集河南猪株旋毛虫成虫,提取总RNA,反转录合成cDNA,经特异引物扩增获得18SrRNA基因片段。将此目的基因与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌感受态细胞,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行序列测定及分析,构建系统发育树。结果构建的重组质粒酶切片段大小分别为2 700和1 800bp,与预期值相符。根据18SrRNA碱基序列构建系统发生树,河南猪株旋毛虫与虫株Trichinella nativa(AY487254.1)的亲缘关系较近,同源性为99.1%。结论河南猪株旋毛虫归属于T2。     

日本血吸虫组织蛋白酶L2基因扩增及克隆

目的　体外扩增日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L2 (SjCL2 )的编码区基因序列 ,将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中 ,为进一步对其进行功能研究奠定基础。方法　用TRIZOL分离日本血吸虫成虫RNA ,RT -PCR扩增目的基因 ,将扩增产物定向克隆到真核表达载体 pcDNA3中。 结果　RT -PCR特异性扩增出SjCL2编码区基因序列 ,其片段大小为1kb左右 ,经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pcDNA -SjCL2中含有所扩增的基因序列。 结论　RT -PCR扩增的SjCL2编码区基因序列与预期长度相符合 ,成功构建了含SjCL2编码区基因的真核表达质粒pcDNA -SjCL2。     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.     

日本血吸虫Calpain序列分析及DNA疫苗体系的构建

目的　探讨日本血吸虫疫苗候选分子 -钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)在抗日本血吸虫感染的保护性作用及其保护性免疫机制。方法　从日本血吸虫成虫中提取RNA ,用RT -PCR扩增Calpain含多个B ,T细胞表位的片段 ,引物中包含BamHI和EcoRI的酶切位点 ,PCR扩增产物经纯化后TA克隆 ,转化的阳性TA克隆经PCR筛选后 ,液体培养大肠杆菌并回收质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,目的基因亚克隆到真核表达质粒pVAC载体 ,构建 pVAC -Cal pain真核表达体系 ,转化的阳性亚克隆经PCR筛选 ,液体培养大肠杆菌并回收pVAC -Calpain质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定被亚克隆的Calpain基因。 结果　RT -PCR从日本血吸虫RNA中扩增了 4 5 3bp的Calpain基因 ,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定Calpain基因被克隆到真核表达质粒 pVAC载体。 结论　日本血吸虫疫苗候选分子Calpain的DNA疫苗体系的建立将有助于解析这个疫苗候选分子抗日本血吸虫感染的保护性免疫作用及保护性免疫机制。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列，比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因，并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp，编码442个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因；序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建

目的　扩增SjCL2基因 ,构建巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2 ,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法　运用RT -PCR技术 ,从日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因 ;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒 ;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果　利用RT -PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约 1Kb大小的SjCL2基因 ,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB中。 结论　成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2质粒     

旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的　观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法　将旋毛虫肌幼虫编码 31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠 ,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测 ,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Westernblot分析。结果　IFAT表明 pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应 ,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光。Westernblot检测结果显示 ,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的 31kDa抗原组分 ,而 pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应。结论　旋毛虫DNA疫苗 pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

旋毛虫成虫cDNA文库免疫筛选及序列分析

目的　为获得旋毛虫成虫抗原基因。　方法　应用免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行免疫筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。　结果　免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 9个阳性克隆。对其中的Ts87进行测序 ,又采用 5′ RACE ,获取全长为 1172bp的cDNA片段 ,该基因编码 3 47个氨基酸。序列分析表明 ,克隆Ts87是个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,存在预测的抗原表位。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原新基因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子     

应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究

目的 对我国猪源旋毛虫地理株进行鉴定和分类。 方法 根据旋毛虫rDNA扩展片段V区（expansion segment V region,ESV）和内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）ITS1和ITS2基因序列合成5对特异性引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T. nativa,T2）、布氏旋毛虫（T. britovi,T3）、伪旋毛虫（T. pseudospiralis,T4）及纳氏旋毛虫（T. nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用多重PCR对我国6个猪源旋毛虫地理株（河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津）进行鉴定,并观察影响多重PCR扩增的因素。 结果 我国6个猪源旋毛虫地理株多重PCR扩增结果显示,均具1条与T1相同的条带（173 bp）。应用多重PCR对单条旋毛虫幼虫、不同保存条件的旋毛虫幼虫及含幼虫的新鲜小鼠肌肉提取液进行扩增,均得到173 bp的特异性条带。 结论 经多重PCR鉴定我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。     

ISSR-PCR对我国旋毛虫7个地理株的分子鉴定

目的探讨对不同种和地理株旋毛虫进行分子鉴定。方法利用简单重复序列区间-PCR(inter simple sequencerepeat-PCR,ISSR-PCR)标准引物对5种旋毛虫及我国旋毛虫7个地理株基因组DNA进行扩增,并观察影响扩增效果的因素。结果5种旋毛虫均分别扩增出了各自的特异性条带:旋毛虫(T1)2条(950bp和850bp),乡土旋毛虫(T2)1条(850bp),布氏旋毛虫(T3)3条(1 300bp、950bp和700bp),伪旋毛虫(T4)1条(600bp),纳氏旋毛虫(T7)有4条带(1 700bp、1 450bp、1 050bp、900bp)。我国有6个猪源旋毛虫地理株均扩增出了与T1相同的2个特异性条带(950bp、850bp)。此外,T1、河南株、云南株、哈尔滨株、黑龙江同江株还扩增出了另外2条弱带(500bp和400bp);但湖北株和天津株则无这2条弱带,湖北株扩增出了1 350bp的条带,天津株扩增出了1 600bp的条带。非猪源的广西株与T1相比,缺少950bp的条带。对1条旋毛虫肌幼虫,在80%酒精保存24w的肌幼虫,在10%甲醛、0.2%叠氮钠及0.05%柳硫汞溶液保存9 w的肌幼虫,应用ISSR-PCR均可扩增出其特异性条带。结论ISSR-PCR用于旋毛虫种的分子鉴定具有良好的稳定性和敏感性;我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1,其中云南株、河南株、哈尔滨株及黑龙江同江株可归为一类,湖北株和天津株可归为另一类,来自果子狸的广西株分类地位待定。     

旋毛虫成虫期特异性基因的筛选与序列分析

目的　获得旋毛虫成虫期特异性基因序列。方法　应用旋毛虫成虫期特异性探针对成虫cDNA文库进行杂交筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。结果　利用消减杂交 (subtractedhybridization)获得的旋毛虫成虫期特异性探针筛选成虫cDNA文库 ,获得一个长 16 2 9bp的基因。其开放阅读框架由 146 4个核苷酸组成 ,编码 487个氨基酸。序列分析表明 ,该序列是一个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,在 2 0 7～ 2 70位氨基酸间存在两个锌指结构 ,在 5 2～ 6 4,10 8～ 116 ,137～ 16 3,2 2 6～ 2 6 0位氨基酸处存在预测的抗原表位。结论　获得旋毛虫成虫期特异性基因 ,其编码的蛋白具有一定的抗原表位