基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤中的表达

　　目的　观察基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和血管内皮生长因子(VEGF)在视网膜母细胞瘤(RB)中的表达及其与RB分化程度和视神经浸润的关系。方法　经病理检查确诊的40例RB眼球石蜡标本纳入研究。按照RB细胞中有无菊形团排列以及RB肿瘤细胞是否浸润视神经分为分化型、未分化型以及视神经浸润、视神经无浸润组。其中,分化型15例,未分化型25例;视神经浸润13例,视神经无浸润27例。采用免疫组织化学方法检测其MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,对比分析MMP-2、MMP-9和VEGF表达与肿瘤病理组织分型和视神经是否侵润之间的关系。结果　40例RB中,MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达率分别为52.5%、57.5% 和72.5% 。未分化型RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达均高于分化型RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达,差异有统计学意义(χ²=9.037,9.253,8.095;P＜0.05);有视神经浸润的RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性水平均高于无视神经浸润RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性水平,差异有统计学意义(χ²=11.045,10.243,8.956;P＜0.05)。RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关关系(r=0.126,0.314;P＜0.05)。结论　RB细胞内有MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。MMP-2、MMP-9表达与VEGF表达存在相关性。MMP-2、MMP-9和VEGF的表达水平与视神经浸润存在密切的关系。       

米诺环素对缺氧猴脉络膜视网膜血管内皮细胞表达血管内皮生长因子受体的影响

目的 观察缺氧状态下猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1和VEGFR-2的表达情况及米诺环素的干预效果。方法 培养RF/6A并将细胞分为正常对照组、缺氧对照组、米诺环素低剂量组(0.5 μmol/L）、米诺环素中剂量组（5.0 μmol/L）、米诺环素高剂量组（50.0 μmol/L）。实时定量聚合酶链反应（PCR）和免疫组织化学染色检测VEGFR-1、VEGFR 2的mRNA表达和蛋白表达。结果 实时定量PCR检测结果显示,各组细胞中VEGFR-1 mRNA的表达水平在24（F=0.17）、48（F=1.53）、72 h（F=2.04）各时间点未发生显著变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。72 h后,米诺环素低(t=469)、中(t=20.16)、高(t=17.12)剂量组VEGFR 2 mRNA表达水平与缺氧对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.001）。免疫组织化学检测结果显示,各组均可见表达VEGFR-1、VEGFR-2蛋白的阳性细胞。VEGFR-1蛋白表达水平偏低,染色浅或中度棕色,主要位于内皮细胞胞膜和细胞质中,各组细胞中VEGFR-1蛋白的表达水平在各时间点比较,差异无统计学意义（F _{24 h}=0.251,F _{48 h}=0.340,F_{72 h}=0.589;P＞0.05）;VEGFR-2蛋白表达水平较高,各组内皮细胞胞膜上均可见棕黄色染色物质,细胞质中也见少量表达,缺氧对照组染色强度明显比正常对照组强,并且与米诺环素处理各组间VEGFR-2蛋白表达比较,差异有统计学意义（F_{24 h}=19.147, F_{48 h}=14.893,F _{72 h}=11.984;P＜0.05）。结论 缺氧RF/6A VEGFR-2表达上调,米诺环素对其有一定抑制作用。     

信号转导与转录激活因子3在脉络膜新生血管发生中的可能作用

目的　观察磷酸化信号转导与转录激活因子3（STAT3）在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管（CNV）中的表达,探讨STAT3在CNV中可能的作用。方法　建立激光诱导的大鼠CNV模型,免疫荧光法观察CNV生成早期磷酸化STAT3的表达。建立细胞缺氧模型,细胞培养液中加入Janus激酶2（JAK2）特异性阻断剂AG490后培养1、3、6、12、24 h。流式细胞仪检测视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生指数,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和VEGF的mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HIF-1α蛋白表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养液上清液中血管内皮生长因子（VEGF）的含量。结果　激光光凝后3 d,磷酸化STAT3高表达于大鼠CNV区域。阻断JAK2/STAT3信号转导通路后,缺氧条件下人RPE细胞随时间增生指数明显降低（t=1.472,3.566,2.391,6.420;P=0.054,0.038,0.042,0.016）。随缺氧时间增加,HIF-1α和VEGF mRNA表达逐渐增强。采用AG490阻断JAK2/STAT3信号转导通路后,缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达、HIF-1α蛋白的活化均受明显抑制(t=0.07,0.02,0.01, P＜0.05);细胞培养上清液中VEGF含量显著降低（t=1.330,1.106,2.828,7.742,5.610,6.894,P=0.082,0.063,0.014,0.002,0.016,0.011）。结论　STAT3可能参与了CNV的发生,这一过程部分是通过JAK2/STAT3信号转导通路调控RPE细胞HIF-1α和VEGF表达而实现的。      

川芎嗪对人脐静脉内皮细胞缺氧相关因子表达的影响

目的 观察川芎嗪(TMP)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧相关因子表达的影响.方法 体外培养HUVECs,取2～5代细胞进行实验.将HUVECs分为对照组、氯化钴(CoCl2)缺氧组及50、100、200 μmol/L TMP药物处理组.对照组不作任何处理.CoCl2缺氧组利用150 μmol/L的CoCl2干预HUVECs 4 h;50、100、200 μmol/L TMP药物处理组在CoCl2干预HUVECs 4 h后,再加入不同浓度TMP继续培养8h.分别提取各组细胞RNA和总蛋白,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脯氨酰羟化酶2(PHD2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的表达.结果 实时RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,CoCl2缺氧组PHD2mRNA表达下降(t=3.734),HIF-1α和VEGF mRNA表达升高(t=4.589、3.926),差异均有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 μmol/L TMP药物处理组分别与CoCl2缺氧组比较,PHD2 mRNA表达均升高(t=3.286、3.617、3.886),差异有统计学意义(P＜0.05);HIF-1α mRNA表达均无明显变化(t=1.025、0.726、-1.386),差异无统计学意义(P＞0.05);VEGF mRNA表达均有所下降,但50 μmol/L TMP药物处理组与之差异无统计学意义(t=1.696,P＞0.05),100、200 μmol/L TMP药物处理组与之差异有统计学意义(t=2.974、3.492,P＜0.05).Western blot检测结果显示,与对照组比较,CoCl2缺氧组PHD2蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=3.122,P＜0.05);HIF-1α及VEGF蛋白表达均有不同程度升高,差异有统计学意义(t=3.778、3.257,P＜0.05).50、100、200 μmol/L TMP药物处理组分别与CoCl2缺氧组比较,PHD2蛋白表达均升高(t=2.813、3.026、3.078),差异有统计学意义(P＜0.05);HIF-1α、VEGF蛋白表达均有所下降,但50 μmol/L TMP药物处理组与之差异无统计学意义(t=2.056、1.986,P＞0.05),100 μmol/L TMP药物处理组(t=3.058、2.976)及200 μmol/L TMP药物处理组(t=3.828、3.136)与之差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TMP能上调缺氧HUVECs中PHD2 mRNA和蛋白的表达,下调HIF-1α蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表达.     

吲哚美辛对脉络膜黑色素瘤细胞增生活性的影响及作用机制

目的　观察环氧化酶抑制剂吲哚美辛（IN）对脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1增生活性的影响并探讨其作用机制。方法　体外培养OCM-1细胞,采用25、50、100、200、400 μmol/L IN对OCM-1细胞进行干预,应用四氮唑化合物（MTT）法检测不同浓度IN对OCM-1细胞增生活性的影响;侵袭实验检测IN对OCM-1细胞侵袭力的影响;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IN对OCM-1细胞内血管内皮生长因子（VEGF）及凋亡抑制因子（survivin） mRNA表达的调节作用;免疫荧光化学检测OCM-1细胞内VEGF、survivin蛋白的定位及表达,酶联免疫吸附测定（ELISA）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测IN对OCM 1细胞内VEGF、survivin蛋白表达的影响。结果　不同浓度IN对OCM 1细胞的增生及侵袭均有明显的抑制作用,其抑制率呈浓度-时间依赖性（MTT: 24 h：F=19.642,P＜0.01;48 h：F=136.597,P＜0.01;72 h：F=582.543,P＜0.01;侵袭实验：F=54.225,P＜0.01）。免疫荧光化学检测结果显示：VEGF、survivin 2种因子在OCM-1细胞内均呈阳性表达且多数表达于细胞胞浆内;RT-PCR检测结果显示：100、200、400 μmol/L IN可抑制OCM-1细胞内survivin mRNA的表达（F=16.679,P＜0.01）,但对细胞内VEGF mRNA的表达无抑制作用。ELISA法测出未用药组、100、400 μmol/L IN作用OCM-1细胞24 h后,细胞内survivin的浓度分别为（787.33±47.37）、（257.00±26.21）、（123.33±8.02） pg/ml;Western blot进一步验证了IN可抑制OCM-1细胞内survivin蛋白的表达,但对VEGF的表达无抑制作用。结论　IN能够抑制OCM-1细胞的增生及侵袭,其机制可能与其下调OCM-1细胞内survivin因子的表达有关。     

Toll样受体4及相关炎性细胞因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 观察糖尿病大鼠视网膜中Toll受体4（TLR4）、炎性细胞因子的表达水平以及视网膜中白细胞聚集与视网膜通透性改变。方法 Brown Norway大鼠120只,剔除自然死亡14只,随机分为实验组和对照组,每组均为53只大鼠。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型;对照组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。建模后4周行定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测,观察大鼠视网膜中TLR4的基因及蛋白表达,酶联免疫吸附试验测定大鼠视网膜匀浆上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎性细胞水平;吖啶橙眼底血管造影观察视网膜中白细胞密度;伊凡思蓝（EB）检测视网膜通透性。结果 对照组、实验组大鼠视网膜TLR4 mRNA、蛋白表达量比较,差异均有统计学意义（F=1.606、0.789,P＜0.05）;视网膜匀浆上清液中MCP-1、IL-1β、TNF-α表达量比较,差异均有统计学意义（F=24.622、5.758、4.829,P＜0.05）。实验组、对照组大鼠视网膜中白细胞密度分别为（6.2±0.5）×10^-5、(2.2 ±0.3）×10^-5个细胞 /像素2,实验组大鼠视网膜中白细胞密度较对照组显著增加,差异有统计学意义（F=2.025,P＜0.05）。实验组、对照组大鼠视网膜EB渗漏量分别为（23.41±4.47）、（13.22±3.59） ng/mg,实验组大鼠视网膜EB渗漏量较对照组增加,差异有统计学意义（F=21.08,P＜0.05）。结论 糖尿病大鼠视网膜中TLR4及炎性细胞因子表达均显著提高;视网膜中白细胞密度和视网膜渗漏量增加。     

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子蛋白激酶C信号通路的影响

 目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2+）蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响。方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2+浓度。比较各组细胞内Ca2+浓度差异。结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）。结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。     

白藜芦醇对糖尿病视网膜血管病变的作用

目的 观察白藜芦醇对糖尿病视网膜血管病变的作用。方法 健康Sprague-Dawley雄性大鼠45只，随机分为白藜芦醇治疗组、治疗对照组及正常对照组，每组15只大鼠。白藜芦醇治疗组、治疗对照组大鼠股静脉注射链脲佐菌素（STZ）溶液建模，正常对照组大鼠股静脉注射等量无菌生理盐水。白藜芦醇治疗组、治疗对照组大鼠给予高脂饲料喂养。白藜芦醇治疗组每天以75 mg/kg的剂量灌胃白藜芦醇2次，治疗对照组每天以等体积无菌水灌胃2次；均正常摄食、摄水。持续治疗4个月后，各组大鼠经股静脉采血2 ml,采集房水50 μl。检测空腹血糖、房水葡萄糖、血浆胆固醇及血浆甘油三酯水平。利用伊凡思蓝（EB）测定各组大鼠视网膜血管通透性。分离大鼠视网膜，观察各组大鼠视网膜血管中周细胞数量的变化；提取总蛋白，采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果 持续治疗4个月后，3组大鼠空腹血糖、房水葡萄糖、血浆总胆固醇及血浆甘油三酯水平比较，治疗对照组较正常对照组明显升高；白藜芦醇治疗组与治疗对照组比较，除血浆总胆固醇无明显差异外，其余指标均明显降低；3组间各指标差异均有统计学意义（F=152.809、65.230、3.861、15.059，P＜0.05）。3组大鼠视网膜血管通透性比较，治疗对照组较正常对照组高，白藜芦醇治疗组较治疗对照组低；3组间差异有统计学意义（F=11.626，P＜0.05）。3组大鼠视网膜血管中周细胞数量比较，治疗对照组较正常对照组明显减少，白藜芦醇治疗组较治疗对照组明显增加；3组间差异有统计学意义（F=43.284，P＜0.05）。3组大鼠视网膜VEGF表达水平比较，治疗对照组较正常对照组明显升高，白藜芦醇治疗组较治疗对照组明显降低；3组间差异有统计学意义（F=14.017，P＜0.05）。结论 白藜芦醇能通过降低空腹血糖、房水葡萄糖及血浆甘油三酯水平，抑制VEGF高表达而改善糖尿病视网膜血管的结构和功能异常。     

瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的 观察瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化损伤的影响。方法 体外培养的人RPE细胞随机分为正常对照组和胰岛素抵抗组。分别加入 0、10、100 ng/ml瘦素干预24、48、72 h。2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧（ROS）的产生情况;免疫细胞化学法检测细胞内8-羟基-2′-脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）的表达量;蛋白质免疫印迹法检测细胞浆中8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGGl）的表达量。结果 干预后24、48、72 h,正常对照组、胰岛素抵抗组RPE细胞ROS（正常对照组：F=37.136、37.178、49.634;胰岛素抵抗组：F=9.822、28.881、71.150）、8-OHdG表达量（正常对照组：F=88.643、390.920、1039.276;胰岛素抵抗组：F=273.311、299.155、82.237）均随瘦素浓度增加而增加,hOGGl的表达量（正常对照组：F=470.062、1073.113、295.456;胰岛素抵抗组：F=240.032、592.389、527.760）随瘦素浓度的增加而递增,差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组、胰岛素抵抗组在相同浓度瘦素干预下,随干预时间延长,胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量呈现高于正常对照组的趋势。干预后24 h,胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量与正常对照组比较,差异无统计学意义（F=23.392,P＞0.05）;干预后72 h,胰岛素抵抗组PRE细胞hOGGl表达量低于正常对照组,差异有统计学意义（F=129.394,P＜0.05）。在相同浓度瘦素干预下,随干预时间延长,RPE细胞hOGG1表达量呈现先升高后降低的趋势。干预后48 h,正常对照组（F=83.673、268.000、373.492）、胰岛素抵抗组（F=49.021、304.293、294.293）RPE细胞hOGGl表达量均高于干预后24、72 h RPE细胞hOGGl表达量,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 正常状态及胰岛素抵抗状态下瘦素能引起人RPE细胞氧化损伤,随着瘦素浓度的增加、作用时间的延长氧化损伤的程度呈加重趋势;氧化损伤的修复随着时间的延长呈先强后弱的趋势,随着瘦素浓度的增加而呈增强的趋势。     

抗血管内皮生长因子单克隆抗体bevacizumab对实验性脉络膜黑色素瘤生长的影响

目的 观察并探讨抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体bevacizumab对人眼脉络膜黑色素瘤（CM）细胞系OCM-1细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其机制。方法　OCM-1细胞植入18只雌性裸鼠腋周皮下,建立移植肿瘤模型后随机分成空白对照组（A组）、阴性对照组（B组）、注药治疗组（C组）。A组未作处理;B组腹腔注射生理盐水0.2 ml;C组以5 mg/kg剂量腹腔注射生理盐水稀释的bevacizumab溶液0.2 ml。连续用药14 d,期间观察肿瘤生长情况。14 d后处死裸鼠,称量肿瘤重量并计算抑瘤率;免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织增生细胞相关核抗原（ki67）、凋亡抑制因子（survivin）表达情况;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析各组VEGF和survivin mRNA水平的表达。结果　C组肿瘤体积、重量分别为（598.86±321.81） mm3 、（0.66±0.15）g,A、B组肿瘤体积、重量分别为（1 715.15±278.16）mm3、（1.54±0.39）g和（1 750.23±206.36） mm³、（1.54±0.31） g,C组与A、B组肿瘤体积、重量比较,差异均有统计学意义（F=34.53,8.69;P=0.00,0.01）;C组抑瘤率为57.14%,A、B组抑瘤率分别为5.31%、6.25%。A、B、C组,ki67增生指数分别为（51.85±1.32）%、（46.30±1.39）%、27.90±0.90）%,C组与A、B组比较,ki67增生指数差异有统计学意义（H=15.17,P=0.00）。C组survivin mRNA表达为0.49±0.02,A、B组survivin mRNA表达分别为（0.82±0.05）、（0.61±0.05）,C组与A、B组比较,survivin mRNA表达差异有统计学意义（F=15.17,P＜0.05）。C组VEGF mRNA表达为（0.32±0.08）,A、B组VEGF mRNA表达分别为（0.73±0.07）、（0.80±0.04）,C组与A、B组比较,VEGF mRNA表达差异有统计学意义（F=12.05,P＜0.05）。结论　Bevacizumab能够抑制OCM-1裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与抑制VEGF活性,下调survivin表达,抑制细胞增生有关。     

低氧诱导人视网膜血管内皮细胞中乙酰肝素酶和血管内皮生长因子相关性研究

目的 观察人视网膜血管内皮细胞（HREC）低氧模型中乙酰肝素酶（Hpa）、血管内皮生长因子(VEGF)和RNA 聚合酶-Ⅱ (Pol-Ⅱ)的表达变化,探讨低氧性视网膜新生血管形成中Hpa和VEGF的相关性及可能机制。方法 使用低氧模拟剂氯化钴（CoCl2）造成HREC低氧模型,分为4组,分别为正常对照组、低氧诱导组、磷酸甘露戊糖硫酸盐（PI-88）组和空白对照组。低氧诱导组为含CoCl2 100 μmol/ml的培养液培养48 h;PI-88组为含CoCl2 100 μmol/L和Hpa竞争性抑制剂PI 88 5 μg/ml的培养液干预48 h;空白对照组为等量PBS干预HREC 48 h。免疫荧光染色法观察正常对照组和低氧诱导组HREC中Hpa、VEGF以及Pol Ⅱ的表达。蛋白质免疫印迹（Western blot）检测各组间Hpa和VEGF蛋白表达变化。 结果免疫荧光染色结果显示,低氧诱导组HREC细胞质内Hpa荧光和VEGF荧光均较正常对照组增强;PI-88组细胞质内VEGF荧光较低氧诱导组减弱。低氧诱导组细胞核内Hpa较正常对照组明显增强,且分布与Pol-Ⅱ相吻合。Western blot检测结果显示,与正常对照组比较,低氧诱导组Hpa蛋白和VEGF蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义（Hpa：F=-4.005,P＜0.05;VEGF：F=-4.063,P＜0.05）;PI-88组VEGF蛋白表达较低氧诱导组VEGF蛋白表达降低,差异有统计学意义（F=5.963,P＜0.05）。结论 低氧诱导的HREC中,Hpa的表达增高,导致VEGF的增加,促进了视网膜新生血管形成。     

加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞增生的抑制作用

背景 黄斑区脉络膜新生血管(CNV)是致盲率较高的眼病之一,以往的主要治疗方法是光动力学疗法和玻璃体腔抗血管内皮生长因子(VEGF)药物注射,但均存在一定的不良反应.研究认为,加减驻景方的应用对相关病变有治疗效果. 目的 探讨加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞(RCVECs)增生的影响. 方法 10只SD大鼠给予0.525 g/ml加减驻景方药液20 ml/kg灌胃3d,于末次给药后2h无菌条件下采集腹主动脉血,制备加减驻景方含药血清.将培养的RCVECs分为4个组,空白对照组细胞用常规培养液进行培养,氯化钴组在培养液中添加100 μmol/L氯化钴100μl以制备细胞缺氧模型,空白血清+氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％空白血清,含药血清+氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％含药血清.细胞培养后24 h采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的增生情况;采用逆转录PCR和Western blot技术检测各组细胞中缺氧诱导因子-lα(HIF-lα)基因和蛋白的相对表达量.结果 培养的RCVECs生长良好,呈梭形.100 μmol/L氯化钴作用后成功建立了缺氧细胞模型.MTT法检测显示,空白对照组、氯化钴组、含药血清+氯化钴组和空白血清+氯化钴组吸光度(A)值分别为0.659±0.051、0.757±0.553、0.683±0.037和0.731±0.038,其中氯化钴组A值明显高于空白对照组和含药血清+氯化钴组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).空白对照组、氯化钴组、含药血清+氯化钴组和空白血清+氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(HIF-1αmRNA:F=3.100,P＜0.05;VEGF mRNA:F=3.420,P＜0.05;HIF-1α蛋白:F=470.600,P=0.000;VEGF蛋白:F=146.700,P=0.000),其中氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组和含药血清+氯化钴组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 加减驻景方含药血清可能通过抑制RCVECs分泌HIF-1α和VEGF的机制而抑制缺氧状态下RCVECs的增生.     

双靶点干预对糖尿病大鼠视网膜中血管内皮生长因子和结缔组织生长因子基因表达的影响

目的 观察糖尿病大鼠视网膜中以及双靶点干预后血管内皮生长因子（VEGF）和结缔组织生长因子（CTGF）mRNA表达变化。方法 Sprague-Dawley大鼠48只,随机分为正常对照组（CON1组）和糖尿病（DM）组。经鼠尾静脉注射链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型。建模后8、10、12周取大鼠视网膜标本行逆转录实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测VEGF、CTGF mRNA表达变化。根据上述结果,选取相同条件的大鼠60只,随机选择50只大鼠依照上述方法建立糖尿病大鼠模型;10只大鼠为正常对照组（CON2组）。建模后第10周,将糖尿病大鼠随机分为双靶点干预组、ranibizumab单靶点干预组、CTGF小发夹RNA（shRNA)单靶点干预组、DM未干预组。干预1周后取各组大鼠视网膜标本,行实时定量RT-PCR检测VEGF、CTGF mRNA表达变化。结果 建模后第8周,DM组大鼠视网膜CTGF mRNA水平显著增高且一直持续到第12周,与CON1组比较,差异均有统计学意义（t=-2.49、-2.67、-2.42,P＜0.05）;第8周时DM组大鼠视网膜VEGF mRNA水平与CON1组比较,差异无统计学意义（t=-0.443,P=0.669）;第10周时显著上调且一直维持到第12周,与CON1组比较,差异有统计学意义（t=-2.35、-2.57,,P＜0.05）。 Ranibizumab单靶点干预组大鼠视网膜VEGF mRNA表达水平较DM未干预组显著降低,差异有统计学意义（t=-3.44,P＜0.05）,与CON2组比较,差异无统计学意义(t=-1.37,P＞0.05);CTGF mRNA表达显著高于DM未干预组,差异有统计学意义（t=2.48,P＜0.05）。CTGF shRNA单靶点干预组大鼠视网膜CTGF、VEGF mRNA表达均较DM未干预组显著降低,差异有统计学意义（t=0.23、-2.92,,P＜0.05）。双靶点干预组大鼠视网膜VEGF、CTGF mRNA表达均下调,与DM未干预组比较,差异均有统计学意义（t=-6.09、-5.11,,P＜0.001）;与CON2组比较,差异无统计学差异（t=-1.16、1.139,,P＞0.05）。结论 早期DM大鼠视网膜内VEGF、CTGF基因表达即升高,且CTGF升高较VEGF早。Ranibizumab结合CTGF shRNA双靶点干预能同时降低VEGF、CTGF基因在DM大鼠视网膜中的表达。     

17β-雌二醇对高氧诱导的鼠视网膜新生血管形成的影响

目的 观察并探讨17β-雌二醇对高氧诱导的鼠视网膜新生血管形成的影响及机制。方法 48只新生Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组和实验组,每组各24只。对照组大鼠分娩完成后与新生鼠一起正常饲养;实验组大鼠分娩完成后立即与新生鼠一起置于高氧环境饲养。对照组和实验组又再分为磷酸盐缓冲液（PBS）干预组（对照组1、实验1）和雌二醇干预组（对照组2、实验组2),每组各12只大鼠。对照组1和实验组1大鼠分别每日皮下注射PBS 0.1 ml;对照组2和实验组2大鼠分别每日皮下注射雌二醇 1 μg。每日观察鼠的发育情况。出生后7、14 d逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测视网膜血管内皮生长因子(VEGF)、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA的含量。出生后14 d时行苏木精 伊红（HE）染色观察视网膜新生血管生长情况;免疫组织化学染色观察VEGF蛋白的表达;透射电子显微镜观察视网膜超微结构变化。结果出生后14 d各组大鼠标本中突破内界膜的内皮细胞数比较,差异有统计学意义（F=10.7,P＜0.05）。其中,实验组1较对照组1明显增多,差异有统计学意义（q=4.28,P＜0.05）。实验组2较实验组1明显减少,差异有统计学意义（q=5.16,P＜0.05）。实验组2与对照组1比较,差异无统计学意义（q=0.25,P＞0.05）。出生后14 d各组大鼠VEGF蛋白表达比较,差异有统计学意义（F=10.7,P＜0.05）。其中,实验组1与对照组、实验组2比较,差异有统计学意义（q=5.41,4.35,P＜0.05）。视网膜超微结构显示,实验组1神经节细胞肿胀,细胞质淡染,线粒体空泡形成;其他各组视网膜超微结构正常。出生后7、14 d各组大鼠视网膜VEGF、HIF-1 mRNA表达比较,差异均有统计学意义（F=14.7,16.1,13.4,17.5;P=0.001,0.005,0.003,0.009）。其中,出生后7 d,对照组2 VEGF表达高于对照组1,实验组2VEGF表达高于实验组1,组间比较,差异均有统计学意义（q=5.22,4.32;P＜0.05）。出生后14 d,对照组2 VEGF表达高于对照组1,实验组2 VEGF、HIF-1表达低于实验组1,组间比较,差异均有统计学意义（q=3.72,5.12,4.08;P均＜0.05）。结论雌二醇对VEGF mRNA具有双重调控作用,高氧条件下促进视网膜VEGF表达和视网膜血管发育;正常氧条件下通过HIF-1α-VEGF系统抑制视网膜新生血管形成。雌二醇在一定程度上可保护缺氧造成的视网膜超微结构损害。     

血管内皮生长抑制因子在糖尿病视网膜病变大鼠中的表达

目的 观察血管内皮生长抑制因子（VEGI）及其相关因子在糖尿病（DM）大鼠外周血、玻璃体液及视网膜组织中的表达,探讨VEGI在糖尿病视网膜病变（DR）发病机制中的作用。方法 70只6周龄雄性Wistar大鼠,随机分为空白对照组（10只）,DM 1、3、6个月组（各20只）。DM大鼠模型建立后,分别于1、3、6个月时取大鼠外周血、玻璃体液、全眼球。酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子样配体1/血管内皮生长抑制因子251（TL1A/VEGI 251）、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）在血清及玻璃体液浓度,石蜡切片免疫组织化学法检测各因子在视网膜组织中的表达,苏木素 伊红（HE）染色评价各组大鼠DR进程。比较空白对照组和DM实验组间大鼠血清、玻璃体液及视网膜组织中TL1A、VEGF、TNF-α、IL-1β的表达差异。结果 分析采用单因素方差分析、独立样本t检验和最小显著差法检验。结果 空白对照组、DM 1、3、6个月组大鼠血清TL1A浓度分别为（92.09±2.05）、（118.36±8.30）、（85.90±7.51）、（78.90±4.88） ng/L,组间血清TL1A浓度比较,差异有统计学意义（F=77.405,P＜0.05）。从空白对照组到DM 1、3、6个月组,大鼠血清TNF-α、IL-1β浓度均呈升高趋势,4组间血清TNF-α、IL-1β浓度比较,差异有统计学意义（F=3.508、15.416,P＜0.05）。VEGF浓度在DM 1个月时升高,DM 3个月时下降,DM 6个月时再次升高,但4组间VEGF浓度比较,差异无统计学意义（F=1.242,P＞0.05）。各组大鼠玻璃体液TL1A浓度分别为（91.50±8.18）、（67.03±6.74）、（47.44±4.92）、（46.01±4.62） ng/L,组间TL1A浓度比较,差异有统计学意义（F=114.777,P＜0.05）。从空白对照组到DM 1、3、6个月组,大鼠玻璃体液VEGF、TNF-α、IL-1β浓度均呈升高趋势,4组间VEGF、TNF-α、IL-1β比较,差异有统计学意义（F=8.816、4.392、3.635,P＜0.05）。免疫组织化学检测结果显示,DM 1、3个月组大鼠视网膜TL1A表达吸光度［A,旧称光密度（OD）］值均较空白对照组降低（t=6.851、6.066,P＜0.05）,但DM 6个月组与空白对照组的TL1A表达A值比较,差异无统计学意义（t=1.401,P＞0.05）;DM各组大鼠视网膜VEGF和TNF-α表达A值均较空白对照组显著升高（t_VEGF=-4.709、-16.406、-9.228,P＜0.05;t _TNF-α=-4.703、-6.583、-17.762,P＜0.05）;DM 1、6个月组大鼠视网膜IL-1β表达A值均较空白对照组显著升高（t=-4.108、-3.495,P＜0.05）,但DM 3个月组与空白对照组IL-1β表达A值比较,差异无统计学意义（t=-0.997,P＞0.05）。HE染色结果显示,空白对照组与DM 1个月组大鼠视网膜组织结构基本正常;DM 3个月组大鼠视网膜组织水肿,细胞排列紊乱;DM 6个月组大鼠视网膜组织明显水肿,神经节细胞核染色加深,内丛状层可见大量新生血管,内核层细胞排列紊乱、水肿,可见大量脂肪空泡,视网膜各层结构不清晰。结论 VEGI可能通过与VEGF、TNF-α、IL-1β等因子的相互作用参与DR的发生发展过程。     

黄芩素对缺氧诱导的视网膜神经胶质细胞中脯氨酸羟化酶2表达的抑制作用

背景 脯氨酸羟化酶2(PHD2)是缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)降解酶,能够调控缺氧诱导的新生血管形成过程中血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)等多种促血管生成因子的表达.黄芩素对PHD2有抑制作用,了解其对缺氧诱导的视网膜神经胶质细胞中PHD2表达的抑制作用有助于了解相关新生血管性眼病的机制及其防治. 目的 观察PHD2在缺氧诱导的视网膜神经胶质细胞中的表达变化,探讨黄芩素对PHD2过表达的抑制作用及其意义. 方法 将出生48 h以内SPF级SD乳鼠用体积分数10％水合氯醛麻醉后以颈椎脱臼法处死,分离双侧视网膜后采用组织块培养法分离培养鼠视网膜神经胶质细胞,采用兔抗羊胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对神经胶质细胞进行鉴定.将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2组和CoCl2+黄芩素组,其中正常对照组细胞进行常规培养,CoCl2组细胞培养液中添加200 μmol/L CoCl2以制备缺氧细胞模型,CoCl2+黄芩素组细胞培养液中添加200 μmol/L CoCl2和50 μmol/L黄芩素溶液.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞增生情况;采用免疫荧光染色法检测各组鼠视网膜神经胶质细胞中PHD2和VEGF的表达及其定位;采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中PHD2和VEGF mRNA的相对表达量;采用Western blot法定量检测各组细胞中PHD2和VEGF蛋白的表达量. 结果 各组鼠视网膜神经胶质细胞增生值(吸光度,A值)总体比较差异有统计学意义(F=132.05,P=O.00),其中CoCl2组鼠视网膜神经胶质细胞增生值明显高于正常对照组和CoCl2+黄芩素组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).免疫荧光检测显示,正常对照组细胞中PHD2和VEGF均呈弱表达,CoCl2组细胞中PHD2和VEGF均呈强阳性表达,CoCl2+黄芩素组细胞中PHD2和VEGF表达较CoCl2组减弱.正常对照组、CoCl2组和CoCl2+黄芩素组细胞中PHD2 mRNA相对表达量分别为0.366±0.034、0.894±0.015和0.445 ±0.017,PHD2蛋白相对表达量分别为131.27±2.61、140.12±4.29和133.14±2.11,VEGF mRNA相对表达量分别为1.346±0.008、3.465±0.048和2.264±0.073,VEGF蛋白相对表达量分别为532.25±19.92、601.13±10.21和537.34±5.96,组间总体比较差异均有统计学意义(PHD2:F=905.89、43.18,均P＜0.01;VEGF:F=27.13、185.79,均P＜0.01),其中CoCl2组PHD2和VEGF mRNA及蛋白相对表达量均明显高于正常对照组和CoCl2+黄芩素组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 体外低氧环境促进鼠视网膜神经胶质细胞增生,同时诱导视网膜神经胶质细胞中PHD2和VEGF的表达上调.黄芩素可有效抑制低氧环境下PHD2过表达引起的神经胶质细胞的增生和相关促血管生成因子的表达,PHD2有望成为缺氧性视网膜血管新生疾病的防治靶点.     

胰岛素对正常糖和高糖浓度下牛视网膜微血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨胰岛素、糖浓度及其两者的联合作用对牛视网膜微血管内皮(BRE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 对照实验研究.采用选择性培养方法,培养BRE细胞,传代后分别在正常糖(5 mmol/L)或高糖(30 mmol/L)浓度下培养3 d,甘露醇平衡渗透压,血清饥饿12 h,给予或不给予100 nmol/L胰岛素作用24 h.实时荧光定量检测VEGF mRNA表达水平;人脐静脉血管内皮细胞增殖法、免疫荧光检测法、免疫印迹法检测VEGF蛋白表达水平.采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析,胰岛素、糖浓度及其交互作用对BRE细胞的VEGF mRNA和VEGF蛋白表达水平的影响,采用2×2析因设计定量资料方差分析,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 胰岛素或高糖浓度可以显著提高BRE细胞的VEGFmRNA(F=5.67,9.04;均P<0.05)和VEGF蛋白(F=5.50,5.57;均P<0.05)表达水平,但胰岛素联合高糖浓度的作用较其单独作用减弱.结论 高糖浓度下可以降低胰岛素诱导的VEGF表达水平,因此,VEGF可能不是胰岛素治疗导致的糖尿病视网膜病变短期恶化的主要因素.     

CD147、基质金属蛋白酶-2和血管内皮生长因子在氧诱导视网膜病变大鼠中的表达

目的 观察CD147、基质金属蛋白酶（MMP）-2和血管内皮生长因子（VEGF）在氧诱导视网膜病变大鼠中的表达。方法 84只新生Wistar大鼠纳入研究。将其随机分为高氧组和对照组。每组42只大鼠。高氧组建立氧诱导视网膜病变模型;对照组不做任何处理。大鼠7、14日龄时,取眼球行视网膜铺片,观察视网膜血管形态。大鼠14日龄时,取眼球行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的内皮细胞核数。大鼠12、14、16日龄时,取眼球行免疫组织化学染色,检测大鼠视网膜组织中CD147、MMP-2和VEGF的表达。采用双因素相关分析法分析CD147表达与MMP-2、VEGF表达的相关性。结果 大鼠7日龄时,对照组大鼠视网膜血管呈放射状分布,血管径较粗;高氧组大鼠视网膜血管收缩,大面积无血管区,仅见少量小面积的血管网。大鼠14日龄时,对照组大鼠视网膜血管发育较好,网格规整;高氧组大鼠视网膜血管增生、纡曲、扩张,并在灌注区与非灌注区交界处形成新生血管丛、渗出、出血。大鼠14日龄时,对照组、高氧组突破内界膜的内皮细胞核数分别为（1.30±1.26）、（19.70±3.56）个;两组比较,差异有统计学意义（t=21.813,P＜0.01）。免疫组织化学染色结果显示,对照组大鼠视网膜各层可见CD147、MMP-2、VEGF有少量表达;高氧组大鼠视网膜各层可见CD147、MMP-2、VEGF有大量表达。大鼠12、14、16日龄时,两组大鼠视网膜各层中CD147（t=5.612、11.390、6.355）、MMP-2（t=4.122、8.047、4.422）、VEGF（t=4.955、12.176、5.110）表达比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）。相关性分析发现,CD147的表达与MMP-2、VEGF的表达均呈正相关(r=0.755、0.820,P＜0.01）。 结论 CD147、VEGF、MMP-2在氧诱导视网膜病变大鼠中有大量表达。