血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 血小板源性生长因子(PDGF)可以影响人晶状体上皮细胞(LECs)的增生过程,而LECs可终生表达PDGF-α受体(PDGFR-α),PDGFR-α活化后与PDGF结合能促进细胞的DNA合成.反义寡核苷酸(ASODN)技术沉默PDGFR-α基因表达可抑制增生性玻璃体视网膜病变(PVR)过程中视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,并诱导细胞凋亡,但通过该技术是否能够抑制LECs的增生鲜见报道. 目的 研究PDGFR-α沉默对LECs增生的影响,为防治晶状体后囊膜混浊(PCO)提供实验依据.方法 用含胎牛血清的改良型α-MEM培养液体外培养人LECs系SRA01/04细胞株并传代,转染前1d用无抗生素的培养基培养细胞至30％ ～ 50％融合后将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板,接种24 h后采用脂质体进行LECs转染,按照转染物的不同分为空白对照组(不加PDGFR-α ASODN的空白脂质体)、PDGFR-α错义寡核苷酸(MSODN)组(含PDGFR-α ASODN和脂质体)、0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组(含0.5 μmol/L PDGFR-αASODN和脂质体)和1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组(含1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN和脂质体).转染24 h后倒置显微镜下观察各组人LECs的形态学变化,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组LECs中PDGFR-αmRNA的表达;用MTT比色法检测各组细胞的增生(A490)值,计算转染物对LECs的抑制率;采用流式细胞仪分析各组LECs的细胞周期. 结果 转染后24 h,空白对照组及PDGFR-α MSODN组LECs生长良好,细胞呈多边形,数目多;而PDGFR-α ASODN组细胞呈圆形,细胞数目明显减少.RT-PCR检测表明,空白对照组及PDGFR-α MSODN组PDGFR-α mRNA在LECs中的表达较强,而在PDGFR-α ASODN组中的表达强度明显减弱,以1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组更为明显.空白对照组、PDGFR-α MSODN组、0.5μmol/L PDGFR-αASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值分别为0.661±0.036、0.655 ±40.016、0.529±0.030和0.441 ±0.039,其中0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值明显低于空白对照组和PDGFR-α MSODN组,总体比较差异有统计学意义(F=34.08,P＜0.01).空白对照组、PDGFR-αMSODN组、0.5 μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数分别为(47.73±1.18)％、(49.48±1.09)％、(53.31±1.30)％和(59.98±0.95)％,总体比较差异有统计学意义(F=68.41,P＜0.01),其中0.5 μmoL/L PDGFR-αASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 PDGFR-α沉默能抑制人LECs的增生.     

靶向PDGFR-α mRNA的RNA干扰抑制实验性增生性玻璃体视网膜病变

目的：观察血小板源性生长因子-α受体( platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-α) mRNA的RNA干扰抑制实验性增生性玻璃体视网膜病变( proliferative vitreoretinopathy, PVR)的效果。方法：选择PDGFR-α shRNA/lip2000比值1∶1、1∶2、1∶3(其中PDGFR-α shRNA分别为2μg、3μg和4μg)制备复合物转染至人视网膜色素上皮细胞( human retinal pigment epithelium,HRPE)中,24h后分别取0.1mL注射到家兔玻璃体腔。选取健康成年有色家兔40只随机分为平衡盐溶液(balanced salt solution, BSS)组(N组),含lipofectamineTM2000的HRPE细胞稀释液组( A组),取最佳转染效率的1.0、1.5与2.0μmol/L含PDGF-α受体的shRNA及lipofectamineTM2000的HRPE细胞稀释液组( B、C和D组),每组8眼,右眼为实验眼。间接眼底镜观察PVR程度,免疫组织化学染色进行切片着色情况观察及组织病理学观察眼底改变。结果：PDGFR-α shRNA/lip2000比值1∶2时,HRPE细胞最佳转染效率;B组、C组和D组PVR程度、组织病理学改变、免疫组织化学染色PDGFR-α浓度低于A组,D组比B组和C组更低。结论：PDGF-α受体mRNA的RNA干扰对实验性PVR形成有抑制作用。     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

PDGFR-α反义寡核苷酸抑制兔晶状体上皮细胞增殖的实验研究

目的: 观察血小板源性生长因子受体α反义寡核苷酸( platelet - derived growth factor receptor -α antisenseoligonucleotide,PDGFR-α ASODN) 对体外培养兔晶状体上皮细胞 N/N1003A 增殖的影响,并探讨其作用机制。方法: 使用阳离子脂质体 LipofectamineTM2000 将 PDGFR -α ASODN 转染入 N/N1003A 细胞,MTT 法分析细胞的增殖活性,RT-PCR 法检测 PDGFR-αmRNA 的表达,透射电镜观察细胞超微结构改变,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡率。结果: PDGFR-α ASODN 处理后,N/N1003A 细胞增殖明显受到抑制( P<0.05) ,PDGFR-α mRNA 表达明显下调( P<0. 05) ,均呈剂量依赖性; 透射电镜观察到细胞出现典型的凋亡特征; 细胞凋亡率显著升高( P<0. 05) ,同时细胞阻滞于 G1期。结论: PDGFR -α ASODN 可沉默兔晶状体上皮细胞中PDGFR-α基因表达,抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,为应用 PDGFR-α ASODN 预防后囊膜混浊的形成提供实验依据。     

shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.     

三氧化二砷对表皮生长因子诱导的视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响

背景 细胞因子失衡所导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞的异常增生和迁移是增生性玻璃体视网膜病变( PVR)的主要病理变化之一.三氧化二砷(As2O3)是中国传统中药中的有效成分,可有效抑制肿瘤细胞的增生和迁移.但As2O3对细胞生长因子引起的RPE细胞增生和迁移的影响尚未明确. 目的 探讨As2O3对表皮生长因子(EGF)诱导的ARPE-19细胞增生和迁移的影响.方法 用无血清培养基对RPE细胞系ARPE-19细胞进行培养,将终浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L的As2O3分别加入到无血清培养基和含10 mg/L EGF的ARPE-19细胞培养液中作用24 h和48 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各培养组ARPE-19细胞活性的吸光度(A)值,以探讨As2O3对细胞的药物毒性作用,并筛选安全、有效的As2O3作用浓度.用10 mg/L EGF加入培养基诱导ARPE-19细胞迁移,分别在培养板中加入0、0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3 作用24 h和48 h,并通过划痕试验和Transwell试验检测As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞迁移的影响.结果 MTT法检测发现不同浓度As2O3组作用24 h和48 h后,无血清培养组细胞A值随As2O3浓度的升高而逐渐下降,总体差异有统计学意义(F浓度=38.269,P=0.000;F时间=0.874,P=0.358).与空白对照组(0μmol/LAs2O3组)比较,0.5～ 5.0 μmol/L As2O3组ARPE-19细胞A值的差异均无统计学意义(P＞0.05).对含10 mg/LEGF组的ARPE-19细胞,药物对细胞A值的影响呈现浓度和时间依赖性(F浓度=152.155,P=0.000;F时间=51.649,P=0.000).与对照组比较,0.5～2.0μmol/L As2O3加入24 h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(P＞0.05),而0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3加入10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞中作用24h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(F浓度=2.215,P=0.126;F时间 =2.230,P=0.155).5.0 ～20.0 μmol/L As2O3作用于EGF诱导的ARPE-19细胞中作用后,细胞A值明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),5.0～20.0 μmol/L As2O3作用24 h后,对EGF诱导的ARPE-19细胞增生抑制率分别为12％、32％、37％;作用48 h后细胞抑制率分别为39％、44％和53％.划痕试验结果显示,0.5～2.0 μmol/L As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞的横向迁移具有抑制作用.Transwell试验结果表明,0.5～2.0 μmol/L As2O3对10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞纵向迁移有明显的抑制作用,0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3作用12h对ARPE-19细胞的抑制率分别为22％、33％和46％. 结论 As2O3在一定浓度范围内对ARPE-19细胞无毒性作用,2.0 μmol/L以下浓度的As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞增生无明显影响,但可影响细胞的迁移能力,5.0 μmol/L以上浓度的As2O3可明显抑制ARPE-19细胞的增生.     

PDGF-α受体反义寡核苷酸对体外视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)对体外人视网膜色素上皮(humanretinal pigment epithelium,HRPE)细胞增殖和凋亡的作用。方法:使用阳离子脂质体lipofectamineTM2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至细胞株HRPE细胞,MTT法检测对HRPE细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞;流式细胞仪检测HRPE细胞的周期和凋亡率。结果:PDGFR-αASODN转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)。结论:沉默PDGFR-α基因表达可显著抑制HRPE细胞的增殖,并能诱导其凋亡。     

缺氧条件下1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞的促增生和抗凋亡作用

背景 1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种具有生物活性的脂质,是细胞内重要的信使分子,参与多种生物过程的调节,如细胞增生、迁移、分化、凋亡等.缺氧不仅是脉络膜新生血管(CNV)的关键始发因素,也是许多眼部疾病的病理基础,而视网膜色素上皮(RPE)细胞也参与缺氧后新生血管的形成,缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响尚不清楚. 目的 观察缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响,从而揭示S1P在CNV中的作用机制.方法 体外培养人RPE细胞株并进行传代,3～5代的RPE细胞分为6个组,空白对照组细胞进行常规培养,缺氧组细胞用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h,不同浓度S1P干预组(0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L)用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h后加入相应浓度的S1P,采用WST-1试剂盒检测各组细胞的吸光度(A)值;采用Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况,计算并比较各组细胞的凋亡率.结果 培养的细胞生长良好,可见细胞质内的色素颗粒.WST-1试剂盒检测显示,空白对照组细胞增生值(A值)为0.91 ±0.08,缺氧组为0.37±0.09,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组分别为0.46±0.08、0.52±0.09、0.61 ±0.06和0.70±0.10,各组间的差异有统计学意义(F=21.104,P=0.000),不同浓度S1P组A值均明显高于缺氧组,且随S1P浓度的升高而增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05);不同浓度的S1P组细胞存活率均明显高于缺氧组.Hoechst染色显示,空白对照组RPE形态正常,可见少数凋亡细胞;缺氧组可见大量凋亡细胞,细胞核呈淡蓝色,染色质浓缩;S1P干预后凋亡细胞数较缺氧组减少,随着S1P浓度的增加,凋亡细胞数逐渐减少.空白对照组凋亡率为(1.21±0.08)％,缺氧组为(8.99±0.09)％,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组的细胞凋亡率分别为(6.60±0.08)％、(5.95±0.09)％、(4.81±0.06)％和(3.96±0.10)％,6个组间细胞凋亡率的总体差异有统计学意义(F=25.070,P=0.000),与缺氧组比较,各S1P组细胞凋亡率均明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05),且随S1P的浓度升高其凋亡率逐渐降低.结论 缺氧条件下S1P对人RPE细胞的增生有促进作用,对细胞凋亡有抑制作用.     

活血散结中药复方含药血浆对PDGF干预下兔RPE细胞增殖的影响

目的：观察活血散结中药复方含药血浆对血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)干预下兔RPE细胞增殖的影响。

方法：酶消化法获取RPE原代细胞,进行RPE细胞的原代培养和传代; 制备活血散结中药复方含药血浆; 选取第4代兔RPE细胞为实验细胞,PDGF低、中、高剂量(5、10、20μg/L)干预48h后,CCK-8法检测并选取适宜细胞实验干预浓度; 建立PDGF干预下RPE细胞增殖模型。实验分组为空白对照组(DMEM)、正常血浆组、PDGF(10μg/L)组、PDGF(10μg/L)+AG1296(10μmol/L)组、PDGF(10μg/L)+10%含药血浆组,PDGF(10μg/L)+20%含药血浆组,分别加入相应处理因素干预24h后,Transwell法测定兔RPE细胞迁移力; 而干预48h后,CCK-8法测定兔RPE细胞的细胞活力OD值。

结果：10%和20%浓度的活血散结中药复方含药血浆能有效抑制PDGF干预下RPE细胞的细胞活力、细胞迁移。

结论：活血散结中药复方含药血浆能够抑制PDGF干预下兔RPE细胞增殖,这可能是其有效治疗增殖性玻璃体视网膜病变的机制之一。     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.     

全反式视黄酸对诱导为神经元样细胞的脐带间充质干细胞分化和凋亡的影响

目的 观察不同浓度全反式视黄酸(ATRA)在诱导脐带间充质干细胞(MSC)向神经元样细胞分化中对细胞形态、增殖、凋亡的作用并筛选其最适诱导浓度.方法 实验研究.取生长良好的第3代脐带MSC接种于24孔培养板,细胞贴壁后培养基更换为含ATRA的DMEM/F-12培养液.ATHA终浓度分别为0 μmol/L(对照组,A组)、0.25 μmol/L(B组)、0.5 μmol/L(C组)、1.0 μmol/L(D组)、2.0 μmol/L(E组)、4.0 μmoL/L(F组),诱导后1 h、24 h观察细胞形态,并应用MTT法监测ATBA的细胞毒性.另取对照组和经各浓度ATRA诱导24 h后的细胞应用Annexin-V/PI联合流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率和双标染色后的细胞着色情况,综合上述指标确定ATRA诱导脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的最适浓度.根据资料性质,对不同浓度ATRA作用24 h后各组间A值、细胞凋亡率进行比较,采用单因素方差分析,并应用t检验进一步进行两两比较;对照组和ATRA诱导组之间神经元样细胞阳性表达率的比较采用配对资料的t检验.结果 与对照组相比,ATRA(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L)对MSC形态、细胞增殖、细胞凋亡均无明显影响(t=0.72,1.32;P>0.05);高浓度(4.0 μmoL/L)加入后即刻可见部分细胞浮起,24 h后无贴壁细胞;≥1.0 μmol/LATRA诱导24 h后能极显著抑制细胞增殖(t=8.8,18.9,22.1;P<0.01),且随ATRA浓度增加,抑制作用越明显.诱导24 h后,2.0 μmol/L组细胞回缩较1 h更明显,大部分细胞由长梭形回缩至类圆形,细胞质内出现粗大颗粒,部分细胞漂浮;1.0 μmoL/L组中仅有少数细胞有形态改变;Annexin-V/PI联合FCM检测显示≥1.0 μmol/L组细胞凋亡率与对照组间差异有统计学意义(t=9.88,19.95,31.6l;P<0.01).结论 0.5 μmol/L ATRA是诱导脐带MSC向神经元样细胞转化的最佳剂量,≥1.0 μmol/L能明显抑制MSC的增殖,增加细胞凋亡率并诱导细胞发生明显损伤.     

姜黄素、丹参单体和苦参碱抑制IL-1β诱导下兔RPE细细胞增生的体外实验研究

背景 增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是临床上常见的致盲眼病.视网膜色素上皮(RPE)细胞是PVR发生和发展中的关键细胞,研究中药对体外培养RPE细胞的作用及原理对于防治PVR并揭示其发病机制具有重要意义. 目的 研究姜黄素、丹参单体、苦参碱对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的兔RPE细胞增生的抑制效果.方法 取第3～4代体外培养的有色兔RPE细胞,采用透射电子显微镜鉴定细胞结构.采用MTT法检测2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L IL-1β培养后24、48和72 h RPE细胞的增生率;并检测5、10、20 μg/ml姜黄素和丹参单体IH763-4以及100、200、400 μg/ml苦参碱对IL-1β诱导RPE细胞增生的抑制率.采用线性回归分析计算各药物的半数抑制率(IC50)剂量.结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,形态更加狭长.免疫细胞化学染色结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质表达呈阳性.透射电子显微镜下可见细胞顶端有大量的微绒毛,细胞间可见连接复合体.不同质量浓度IL-1β组培养后24、48、72 h细胞增生率总体比较差异均有统计学意义(F时间=30.33,P=0.00;F浓度=9.37,P=0.00);组内相邻培养时间点间细胞增生率比较差异均有统计学意义(均P＜0.05),同一培养时间点相邻质量浓度IL-1β组间细胞增生率比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).10.0μ,g/LIL-1β培养72 h后细胞增生率达峰值.不同质量浓度姜黄素、丹参单体和苦参碱不同培养时间点细胞抑制率总体比较差异均有统计学意义(姜黄素:F时间=128.75,P=0.00;F质量浓度=334.05,P=0.00.丹参单体:F时间=39.32,P=0.00;F质量浓度=165.57,P=0.00.苦参碱:F时间=267.76,P=0.00;F质量浓度=912.34,P=0.00).3种药物对RPE细胞的抑制作用均呈明显的剂量和时间依赖性,组内相邻培养时间点间细胞抑制率比较差异均有统计学意义(均P＜0.05),相邻质量浓度药物组间细胞抑制率的比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).培养后24、48及72 h,姜黄素的IC50分别为26.77、19.01和9.45 μg/ml,丹参单体的IC50分别为33.72、23.47和12.56μg/ml,苦参碱的IC50分别为570.96、352.25和97.50 μg/ml. 结论 IL-1β可促进RPE细胞增生,10.0 μg/L IL-1β促增生作用最显著;姜黄素、丹参单体、苦参碱均可抑制IL-1β诱导的RPE细胞增生,其抑制作用均呈时间和剂量依赖性,其中姜黄素抗增生作用最强.     

转染Zn2+诱导表达反义bcl-2基因对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的:观察转染Zn2 诱导表达的反义bcl-2 基因对人视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法:培养的正常RPE细胞与转染反义bcl-2 RPE细胞采用免疫组化,克隆形成试验、MTT,流式细胞仪,TUNEL分别予以观察。结果:转染后RPE细胞细胞骨架角蛋白表达阳性;硫酸锌诱导表达的安全剂量为160μmol/L;诱导表达反义bcl-2 RPE大部分细胞bcl-2 表达为阴性,部分弱阳性;在第10d细胞克隆形成率分别为(4.65±0.043)%与(4.85±0.085)%(P >0.05),诱导表达反义bcl-2 的RPE生长曲线在5d后表现为低增生率(P <0.01);柔红霉素作用后G2期细胞由9.9%增加至30.4%;180μg/L柔红霉素作用反义bcl-2转染组TUNEL阳性细胞可见典型凋亡小体。结论:转染可诱导表达的bcl-2 基因的RPE细胞可以进行细胞凋亡的后续研究。     

大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体的构建及其对大鼠RPE细胞中Slit2基因的下调作用

背景 年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人致盲的首要原因.目前,AMD的治疗方式在取得显著疗效的同时亦有一定的不足,寻找新的有效治疗靶点是当前的研究热点. 目的 构建大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,筛选有效干扰序列以用于大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中Slit2基因沉默,为大鼠相关体内实验奠定基础.方法 设计2条大鼠Slit2基因siRNA序列,退火形成DNA,连接形成慢病毒干扰载体并进行测序鉴定.采用三质粒共转染293T细胞法收获慢病毒(Lv-rSlit2-siRNA),用药物筛选法测定病毒悬液滴度.将大鼠RPE细胞分为空白对照组、空病毒组、Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组,根据分组分别用仅有病毒的载体和不同序列的Lv-rSlit2-siRNA载体转染细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定各组细胞中Slit2 mRNA及蛋白的表达以确定Slit2基因的敲减率,筛选有效干扰序列.采用0、100、200和400μmol/L CoCl2孵育大鼠RPE细胞以制备缺氧细胞模型并转染筛选Lv-rSlit2-siRNA2干扰序列,采用实时荧光定量PCR法和ELISA法测定大鼠RPE细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)表达变化及细胞上清液中VEGFA质量浓度.结果 成功构建2条大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,病毒滴度分别为5×108 TU/ml和3×108 TU/ml,转染病毒后72 h于荧光显微镜下观察RPE细胞慢病毒转染率均在70％以上.Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2 mRNA相对表达量分别为0.67±0.09和0.23±0.11,明显低于空白对照组的1.03±0.31和空病毒组的0.92 ±0.07;Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2蛋白相对表达量分别为0.62±0.07和0.49±0.02,明显低于空白对照组的1.00±0.10和空病毒组的0.95±0.11,差异均有统计学意义(均P＜0.01).0、100、200和400 μmol/L CoCl2作用后,空白对照组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA的相对表达量明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=127.998,P＜0.01;F分组=69.663,P＜0.01),不同浓度CoCl2作用后各组大鼠RPE细胞中VEGFA蛋白相对表达量均明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=17.059,P＜0.01;F分组=91.791,P＜0.01).100、200和400 μmol/LCoCl2作用后Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA表达量及蛋白质量浓度均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体构建成功并筛选出有效干扰重组序列,其能有效下调大鼠RPE细胞中Slit2基因的表达,并抑制缺氧环境下VEGFA在大鼠RPE细胞中的表达.     

灯盏花素通过调节Bcl-2和Bax表达拮抗高糖诱导的RPE细胞损伤

目的:探讨灯盏花素对高糖环境下人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响。方法:常规培养RPE细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L)、灯盏花素低浓度组(30mmol/L葡萄糖+1μmol/L灯盏花素)和灯盏花素高浓度组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L灯盏花素)。细胞划痕实验观察RPE细胞的迁移性,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平变化,Hoechst染色法观察凋亡细胞比例,Western blot分析各组Bcl-2和Bax的变化。结果:细胞划痕实验结果显示,灯盏花素低浓度组和灯盏花素高浓度组RPE细胞形态较高糖组改善,细胞迁移性较高糖组增加;CCK-8结果显示,用1、10μmol/L浓度的灯盏花素处理后,RPE细胞存活率分别提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%,与高糖组(40.63%±4.72%)比较有差异(P<0.05);2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光探针染色结果显示,灯盏花素抑制了RPE细胞内ROS水平;Hoechst染色法显示,1、10μmol/L灯盏花素处理后发生凋亡的RPE细胞数量逐渐减少;Western blot结果显示,灯盏花素增强了Bcl-2蛋白的表达,降低了Bax蛋白的表达。结论:灯盏花素可以抑制高糖诱导的RPE细胞氧化损伤和凋亡的发生,为糖尿病视网膜病变的治疗靶点研究提供了理论支持。     

α-平滑肌肌动蛋白在PVR增生膜中的表达以及PDGF对其在人RPE细胞中表达的影响

目的 探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)增生膜中的表达以及血小板源性生长因子(PDGF)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达α-SMA的影响.方法 通过免疫荧光实验和免疫组化法对14例PVR患者视网膜表面增生膜(PRM)中α-SMA的表达进行定性及定量分析;用外源性PDGF-BB处理体外培养的人RPE细胞,并通过免疫荧光实验检测PDGF-BB对RPE细胞表达α-SMA的影响.结果 免疫组织化学结果显示:α-SMA在14例不同级别的PRM中均有表达,主要分布在胞浆中,但其表达的程度有差异.α-SMA阳性细胞在PVR/C级PRM膜中比率为35/80,在PVR/D级PRM膜中的比率为50/60.免疫荧光定量分析结果显示:α-SMA在C级PRM膜和D级PRM膜中的平均荧光强度分别为12.31和23.09,二者差异有统计学意义(P＜0.01).外源性的PDGF-BB(50 μg·L-1)能显著促进人RPE细胞中α-SMA的表达(50 μg·L-1 PDGF-BB处理前后平均荧光强度分别为10.08和17.23),差异有统计学意义(P＜0.05),这种促进作用在培养基中有血清存在时明显增强.结论 α-SMA在PVR增生膜中广泛表达,其表达量与PVR病变程度有关,提示α-SMA可作为检测PVR病变程度的一个潜在因子;PDGF促进d-SMA的表达,这提示PDGF在PVR发病中有重要作用,为临床上PVR的预防和治疗提出新的思路.     

整合素连接激酶对视网膜色素上皮细胞生长、凋亡和分泌功能的影响

背景 玻璃体视网膜手术后视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生和移行是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)发生的主要病理机制,干预RPE细胞的生物学行为对于PVR的靶向治疗有重要意义. 目的 观察整合素连接激酶(ILK)对RPE细胞生长、凋亡及分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响. 方法 用低糖DMEM培养基常规培养和传代人RPE D407细胞系,选择50代以内的细胞进行实验.应用特异性敲减ILK的小干扰RNA(siRNA) (ILK-siRNA)与100μl无血清培养基和RPE细胞共培养的方式转染RPE细胞作为实验组,应用非特异性siRNA转染RPE细胞作为对照组,分别将24孔板置于37℃、体积分数5％ CO2孵箱中孵育.转染48 h后,应用MTT比色法检测各组RPE细胞活力;应用流式细胞仪检测RPE细胞的生长周期及细胞凋亡情况;采用Western blot法检测并比较各组RPE细胞中cyclin D1和caspase-3表达水平的变化;应用ELISA法检测并比较各组RPE细胞分泌VEGF水平的变化. 结果 转染siRNA 48 h后,MTT法检测见实验组和对照组RPE细胞活力分别为(43.69±0.89)％和(73.95±1.20)％,实验组比对照组降低了40.92％,差异有统计学意义(t=49.524,P=0.000).流式细胞术检测发现,实验组处于G1期的细胞数为(83.30±1.26)％,对照组为(47.10±0.93)％;实验组S期细胞数量显著减少,为(12.63±0.92)％,对照组为(36.25±1.21)％;实验组G2期细胞数量显著减少,为(4.07±1.40)％,对照组为(16.65±1.53)％,两组间G1、S、G2期细胞比例的差异均有统计学意义(t=56.624、-38.130、-14.860,均P=0.000).实验组的细胞凋亡率为(15.18±1.22)％,对照组为(2.20±0.15)％,二者间差异有统计学意义(t=25.742,P=0.000).Western blot 检测结果示,实验组cyclin D1的表达量明显降低,而caspase-3的表达量则明显增高.ELISA法检测结果示,实验组RPE细胞的VEGF分泌量为(1314.49±147.23) ng/L,比对照组的(3251.27± 113.87) ng/L降低了59.6％,差异有统计学意义(t=-31.217,P=0.000).结论 体外培养的RPE细胞敲减ILK后导致细胞增生活力下降,凋亡增加,且RPE细胞分泌VEGF的功能受到抑制,有望为PVR的靶向防治提供理论基础.     

PDGF-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响,为治疗后发性白内障提供实验依据.方法 体外培养人晶状体上皮细胞SRA01/04,用脂质体将合成的血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)处理SRA01/04,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡;Hoechst33258荧光染料染色法分析细胞凋亡;RT-PCR检测PDGF-α受体的表达.结果 PDGFR-αASODN作用于SRA01/04细胞24 h～72 h,SRA01/04细胞增殖受抑制,且72 h时对细胞的抑制作用最明显,与低浓度药物组比较,高浓度药物组对细胞的抑制作用增强(P＜0.05);实验组细胞凋亡率分别为(3.22±0.25)％、(5.29±0.27)％,与对照组(0.75±0.67)％和错义寡核苷酸组(1.46±0.60)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组G1期细胞分布率分别为(53.31±1.30)％、(59.98±0.95)％,与对照组(47.73±1.18)％和错义寡核苷酸组(49.48±1.09)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组PDGF-α受体在SRA01/04中表达下调.结论 PDGF-α受体沉默能抑制人晶状体上皮细胞的增殖,诱导其凋亡.     

辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

背景有多种因素参与年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病,其中视网膜色素上皮（RPE）细胞的氧化应激损伤与AMD的发病密切相关。实验和临床研究表明,辅酶Q10是一种强抗氧化剂,探讨其对人RPE细胞的氧化应激损伤是否有保护作用对于AMD的防治有重要的临床意义。目的探讨辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。方法体外培养人RPE细胞,分为正常对照组（单纯培养基培养）、不同浓度（0．01、1、100μmol／L）辅酶Q10预处理组和单纯叔丁基过氧化氢（TBHP）处理组,其中各浓度辅酶Q10预处理组以辅酶Q10预处理后暴露于TBHP,光学显微镜下观察各组RPE细胞的形态;用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组RPE细胞活性的变化;AnnexinV—FITC／PI染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;TBARS法检测细胞的脂质过氧化水平;用DCFH—DA荧光法检测细胞内活性氧簇（ROS）水平;实时定量PCR法检测RPE细胞中促凋亡基因FasmRNA的表达;Westernblot法检测细胞中Fas蛋白的表达。结果单纯TBHP处理组RPE细胞贴壁数量较正常对照组明显减少,而0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组贴壁细胞数较单纯TBHP处理组增加,高浓度辅酶Q10预处理组细胞形态的改善和细胞存活的数目更接近正常对照组。与单纯TBHP处理组比较,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组RPE细胞吸光度（A450）值明显增高（0．52±0．10VS．0．25±0．03、0．59±0．06VS．0．25±0．03）,差异均有统计学意义（P=0．041、0．002）;RPE细胞的凋亡率明显下降[（72．1±6．6）％VS．（91．7±2．3）％、（69．0±4．4）％VS．（91．7±2．3）％],差异均有统计学意义（P=0．032、0．004）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组的细胞脂质过氧化水平依次降低,与单纯TBHP处理组比较差异均有统计学意义（P=0．047、0．030、0．015）,与单纯TBHP组相比,0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平逐渐下降,I;xmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平明显低于单纯TBHP处理组（5．25±0．90 vs11．39±2．30、7．91±0．80VS．11．39±2．30）,差异均有统计学意义（P=0．028、0．007）;与单纯TBHP处理组相比,辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量均有不同程度的下降,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量的差异均有统计学意义（P=0．049、0．008）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中Fas蛋白表达量均明显下降,差异均有统计学意义（P=0．001、0．000、0．000）。结论辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞具有保护作用,其作用在一定范围内呈浓度依赖性,这种保护作用可能与减少细胞的氧化应激损伤和抑制细胞凋亡有关。     

增生性玻璃体视网膜病变中细胞因子的作用

细胞因子与PVR形成密切相关。HGF通过自分泌或旁分泌方式作用于RPE和神经胶质细胞,导致RPE活化和胶质细胞迁移;通过活化磷脂酰肌醇3激酶促使神经胶质细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)。PDGF-AA通过与含有α亚基PDGFR作用促进PVR形成,但表达PDGFβ受体的细胞不能诱导PVR发生。肌样成纤维细胞聚集是PVR中导致牵拉性视网膜脱离的重要因素,其α平滑肌肌动蛋白的表达依赖于TGF-β2RⅡ及TGF-β1在增生膜中的表达。IL-6是PVR形成的危险因素,是视网膜脱离术后PVR复发的重要预测指标。TNF-α可与RPE表面TNF受体作用并通过MAPK通路诱导RPE细胞高表达α1与α5型整合素,进而促进RPE在PDGF介导下的细胞转移。MCP-1可能在PVR早期起重要作用。