氧化应激及抗氧化物在年龄相关性黄斑变性中的作用

氧化应激反应直接参与了年龄相关性黄斑变性(aged-related macular degeneration,AMD)的病理过程,其中以抗氧化剂、抗氧化酶为主组成的抗氧化防御系统对预防AMD的发生发展极为重要.现就氧化应激及抗氧化物在AMD发生发展及防护中的作用机制作一综述.     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

miR-22-3p对蓝光暴露下大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

目的　探讨miR-22-3p对蓝光暴露下的大鼠视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用及机制。方法　取36只清洁级SD大鼠, 将12只SD大鼠随机分为2组:对照组与蓝光暴露组,每组6只。对照组采用正常的12 h明暗循环饲养;蓝光暴露组大鼠先进行暗适应24 h,随后采用复方托吡卡胺散瞳,将大鼠暴露在蓝光（光照强度1500 lux）下2 h;另取24只大鼠随机分为4组:对照组、蓝光暴露组、AAV-miR22组、AAV-miR22&PTEN组,每组6只。对照组采用正常的12 h明暗循环饲养,其余3组均接受蓝光暴露处理,AAV-miR22组注射1 μL含 2.5×10⁹ vg(基因组拷贝数)的AAV-7m8-miR-22-3p,AAV-miR22&PTEN组注射1 μL含2.5×10⁹ vg的AAV-7m8-miR-22-3p&PTEN,对照组与蓝光暴露组向大鼠玻璃体内注射1 μL生理盐水,注射结束使用氧氟沙星眼膏预防感染。取大鼠眼球组织行HE染色,在光学显微镜下观察检测神经节细胞层（GCL）、GCL至外核层 (ONL)的厚度,其中包含有内丛状层（IPL）、内核层(INL)、外丛状层（OPL）;采用NeuN免疫荧光组织化学染色标记RGC,计数视网膜上NeuN标记的阳性细胞数;TUNEL染色检测细胞凋亡;采用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染阴性对照、miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor至RGC-5细胞,转染48 h后测定miR-22-3p表达量,转染成功即可采用Western blot检测PTEN蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR检测miR-22-3p表达,Western blot检测PTEN、p-Akt、Akt与Nrf2蛋白表达情况;双荧光素酶报告实验在酶标仪上测定荧光素酶活性。结果　HE染色结果证实:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织萎缩,视网膜GCL、GCL至ONL厚度变薄（P<0.05）。另外,NeuN免疫荧光组织化学染色发现:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织RGC数减少（P<0.05）。实时荧光定量PCR实验结果显示:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织内miR-22-3p相对表达量降低（P<0.05）。Western blot检测结果显示:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织内PTEN蛋白的表达水平升高,Nrf2蛋白的表达水平和p-Akt/Akt蛋白表达比值均降低（均为P<0.05）;miR-22-3p能够负向调控PTEN蛋白在RGC内的表达水平（P<0.05）。HE染色结果显示:过表达miR-22-3p能够缓解蓝光诱导的大鼠视网膜萎缩,并且能够提高大鼠视网膜GCL、GCL至ONL厚度。NeuN免疫荧光组织化学染色结果证实:过表达miR-22-3p能够通过靶向抑制PTEN表达提高蓝光暴露大鼠视网膜上RGC数。TUNEL实验结果证实:miR-22-3p能够通过抑制PTEN表达缓解蓝光诱导的大鼠视网膜RGC凋亡。结论　miR-22-3p能够通过靶向抑制PTEN的表达,激活PI3K/Akt/Nrf2通路,缓解蓝光诱导的大鼠RGC凋亡。     

内窥镜下睫状体冷凝术与睫状体光凝术对难治性青光眼患者的治疗效果对比

目的　比较内窥镜下睫状体冷凝术（endoscopic cyclocryotherapy, ECC）及内窥镜下睫状体光凝术（endoscopic cyclophotocoagulation, ECP)治疗难治性青光眼的效果及安全性。方法　收集2014年6月至2019年8月我院就诊的难治性青光眼患者36例（36眼）,按手术方式分成2组,其中ECP组22例,ECC组14例。记录术前及术后1周、6个月两组患者的最佳矫正视力、Goldmann眼压、并发症等情况,对两种治疗方法有效性及安全性进行比较。结果　末次随访时,两组患眼视力改善率间差异无统计学意义（P>0.05）。ECC组患眼术后1周和6个月眼压从术前（48.37±9.42）mmHg（1 kPa=7.5 mmHg）分别下降至（21.35±8.18）mmHg和（17.79±4.68）mmHg, ECP组患眼术后眼压从术前（45.71±6.16）mmHg分别降至（19.49±5.83）mmHg及（18.63±5.01）mmHg,两组患眼术后1周、6个月眼压均明显低于术前,差异均有统计学意义（均为P＜0.01）,但术后1周、6个月两组间眼压比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）。术后1周手术成功率ECC组（57.1%）低于ECP组（72.7%）(P<0.05),术后6个月两组手术成功率（ECC组为78.6%,ECP组为77.3%）差异无统计学意义(P>0.05)。两组均未出现晶状体脱位及持续性低眼压等严重并发症。结论　ECC和ECP在治疗难治性青光眼方面均有较好的效果及安全性。     

Bax、Bcl2在丙烯醛诱导的ARPE19细胞凋亡中的作用

目的观察Bax、Bcl2蛋白在丙烯醛诱导的体外培养ARPE19细胞凋亡中的作用。方法 将培养的ARPE19细胞置于含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基中,于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育;用不同浓度(50μmolL-1、100μmolL-1)丙烯醛处理对数期培养的ARPE19细胞24h,设不加药的空白对照组,用流式细胞仪检测丙烯醛诱导ARPE19细胞的凋亡情况,Westernblot检测ARPE19细胞中Bax、Bcl2蛋白的表达情况。结果 流式细胞仪显示,早期在空白对照组中细胞凋亡率为2.97%,50μmolL-1丙烯醛处理组中为4.67%,100μmolL-1丙烯醛处理组中为50.07%;晚期凋亡细胞在空白对照组中细胞凋亡率为1.66%,50μmolL-1丙烯醛处理组中为2424%,100μmolL-1丙烯醛处理组中为6.77%。Westernblot显示空白对照组的Bax/Bcl2蛋白表达的比值为02939,50μmolL-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl2蛋白表达的比值为1.3892,100μmolL-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl2蛋白表达的比值为1.4961。结论 丙烯醛可以通过激活凋亡蛋白Bax及抑制抗凋亡蛋白Bcl2的表达来导致ARPE19细胞凋亡。     

线粒体DNA损伤与视网膜色素上皮细胞关系的研究进展

线粒体 DNA （mtDNA） 是线粒体内具有遗传效应的双股闭环 DNA 分子, 对细胞及其功能具有重要作用。视网膜色素上皮 （RPE） 细胞活动亦由大量线粒体参与。因 RPE 细胞代谢活跃, 当发生氧化应激时可引起线粒体及 mtDNA 损伤; 当线粒体及 mtDNA 损伤无法及时修复而使损伤积累, 可引起 RPE 及线粒体功能障碍, 并诱发启动细胞凋亡, 进而引发某些眼病, 如年龄相关性黄斑变性等。现就 mtDNA 与 RPE 细胞的功能关系、 mtDNA 损伤修复及检测方法作一综述。     

光学相干断层扫描与视网膜电图检测大鼠视网膜光化学损伤

目的 比较频域光学相干断层成像（SD—OCT）检测与闪光视网膜电图（f-ERG）检测在蓝光诱导大鼠视网膜光损伤中的敏感性及其相互关系。方法 建立蓝光诱导大鼠视网膜光损伤模型,分别于照射后1d、3d、7d和14d,以SD—OCT测量视网膜外核层厚度,以f-ERG测量各波的反应振幅,分析大鼠外核层厚度与f-ERG各波反应振幅的关系。结果 蓝光照射后1d、3d、7d和14d大鼠平均视网膜外核层厚度依次为（36．54±3．82）μm、（27．07±2．70）μm、（25．37±2．32）μm和（19．54±1．79）μm,与对照组比较,在3d、7d和14d两组差异有统计学意义（F=8．992,8．838,9．183,P〈0．05）;ERG-a波振幅依次为（268．25±41．12）μv,（178．21±32．70）μv,（153．28±48．23）μv,（144．28±33．57）μv;ERG—b波振幅依次为（608．41±61．61）μv,（489．29±85．94）μv,（463．36±58．47）μv,（390．05±48．94）μv。与对照组相比,各波振幅明显降低,差异均有统计学意义（ERG-a波：F=a4．239,b9．443,b10．187,b10．872,aP〈0．05,bP〈0．01;ERG-b波：F=a3．976,b10．391,b10．787,b11．320,aP〈0．05,bP〈0．01;）。大鼠视网膜外核层厚度与f-ERG各波振幅均具有明显的正相关性（ERG-a：r=0．201,0．247,0．338,0．672,P〈0．05;ERG-b：r=0．131,0．278,0．345,0．578,P〈0．05）。结论 蓝光照射大鼠与对照组相比,f-ERG各波的反应振幅明显较对照组降低,可较早地反映光照导致视网膜功能受损;视网膜外核层厚度明显变薄,与前者具有明显相关性,两者分别从形态学及功能学共同揭示蓝光照射在活体大鼠视网膜中的改变。     

蓝光诱导氧化应激反应参与视网膜色素上皮细胞凋亡机制研究

目的 研究氧化应激反应参与蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,hRPE)凋亡的作用机制及其与时间的关系.方法 用LED蓝光光源建立蓝光损伤体外培养的hRPE细胞模型,蓝光辐射强度为(4.0±0.5) mW·cm-2,并将细胞分为光照时间0h(正常对照组)、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、12 h组.透射电镜观察细胞的超微结构,流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内活性氧水平,WesternBlot技术检测Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达情况.结果 各光照组细胞均有不同程度的胞浆减少、空泡状改变、线粒体肿胀、微绒毛减少或脱落.正常对照组、光照1h、2h、3h、4h、5h、6h、12 h的细胞凋亡率分别为(5.30±0.64)％、(5.90±0.89)％、(6.80±0.98)％、(7.70±0.76)％、(9.60±1.10)％、(11.45 ±2.60)％、(14.90±1.60)％及(23.90±1.20)％,与正常对照组比较,光照4h后细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).正常对照组、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h组hRPE细胞生成的ROS相对量分别为(12.90±1.18)％、(20.09±0.63)％、(23.91±1.47)％、(29.14±1.94)％、(34.30±1.84)％、(38.97±1.68)％、(44.08±0.83)％、(57.76±2.80)％,光照0.5h后细胞产生的ROS明显升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).Caspase-3及Bax在3h后轻微上调,而5～6h后表达上调较明显,Bcl-2的表达则在3h后下调明显,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 蓝光可通过产生的氧化应激反应激活细胞凋亡系统导致细胞损伤,光照持续3h时细胞可能出现了损伤但不明显,光照5～6h后出现了较为明显的细胞凋亡.     

眼内窥镜引导简化硅油取出的方法

目的 利用眼内窥镜的优点,探讨简化玻璃体腔硅油取出的方法。方法 回顾82例(97眼)内窥镜引导下的无晶状体眼或联合白内障摘除术的硅油取出术的病例,记录其手术时间和术中并发症,随访27～60个月,观察其术后1 d、1周、1个月、6个月的视力、眼压、角膜内皮细胞密度、视网膜脱离复发率、硅油残留率和其他并发症。结果 手术时间15.6～46.3 min,平均(20.6±8.3)min,术中未见明显并发症。术前最佳矫正视力(best corrected visual acuity, BCVA)为(2.04±0.58)LogMAR,术后1 d、1周、1个月、6个月的BCVA为(1.92±0.79)LogMAR、(0.94±0.57)LogMAR、(0.98±0.61)LogMAR、(0.96±0.69)LogMAR,术后1 d视力与术前比较,差异无统计学意义(P>0.05),但术后1周、1个月、6个月与术前视力比较,差异有统计学意义(P<0.05);术前眼压为(17.65±1.33)mmHg,术后1 d、1周、1个月、6个月眼压为(9.21±3.81)mmHg、(13.57±2.93)...     

组织因子靶向肽对激光诱导小鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用

目的　探讨组织因子靶向肽（tissue factor targeting peptide,TF-TP）对激光诱导C57BL/6小鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）形成的影响。方法　选取36只清洁级C57BL/6雌性小鼠分为3组:正常对照组、激光组和TF-TP给药组。激光光凝后第1天开始,TF-TP给药组每隔1 d应用5 μL微量进样器给予小鼠玻璃体内注射 1 μL 浓度为100 mg·L^-1的TF-TP,共3次。通过FFA评价各组小鼠CNV渗漏情况;采用组织病理学方法观察光凝后14 d各组小鼠CNV中央最大厚度;采用免疫组织化学法测定视网膜脉络膜组织中CD34的表达;通过Western blot检测小鼠RPE-脉络膜复合物中TF蛋白的表达。结果　激光组小鼠在光凝后14 d,视网膜光斑处可见明显荧光渗漏点,造影晚期呈弥漫性荧光扩散,总渗漏率为69.79%。TF-TP给药组小鼠视网膜光斑处可见轻度荧光渗漏,造影晚期可见渗漏处高荧光点但无扩散,总渗漏率为55.21%。TF-TP给药组的渗漏率低于激光组,差异有统计学意义（P=0.037）。TF-TP给药组CNV中央最大厚度为（60.02±2.48）μm,明显低于激光组（115.89±5.04）μm,差异有统计学意义（P＜0.05）。TF-TP给药组视网膜脉络膜组织中CD34表达的A值为0.09±0.03,明显低于激光组（0.16±0.01）,差异有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组、激光组、TF-TP给药组TF蛋白的相对表达量分别为0.14±0.01、0.40±0.02、0.22±0.03。TF-TP给药组TF蛋白的相对表达量明显低于激光组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　TF-TP可以减小激光诱导的小鼠CNV厚度,降低视网膜脉络膜组织中CD34以及RPE脉络膜混合物中TF蛋白的表达,抑制小鼠CNV的形成。