PDGFR-α反义寡核苷酸抑制兔晶状体上皮细胞增殖的实验研究

目的: 观察血小板源性生长因子受体α反义寡核苷酸( platelet - derived growth factor receptor -α antisenseoligonucleotide,PDGFR-α ASODN) 对体外培养兔晶状体上皮细胞 N/N1003A 增殖的影响,并探讨其作用机制。方法: 使用阳离子脂质体 LipofectamineTM2000 将 PDGFR -α ASODN 转染入 N/N1003A 细胞,MTT 法分析细胞的增殖活性,RT-PCR 法检测 PDGFR-αmRNA 的表达,透射电镜观察细胞超微结构改变,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡率。结果: PDGFR-α ASODN 处理后,N/N1003A 细胞增殖明显受到抑制( P<0.05) ,PDGFR-α mRNA 表达明显下调( P<0. 05) ,均呈剂量依赖性; 透射电镜观察到细胞出现典型的凋亡特征; 细胞凋亡率显著升高( P<0. 05) ,同时细胞阻滞于 G1期。结论: PDGFR -α ASODN 可沉默兔晶状体上皮细胞中PDGFR-α基因表达,抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,为应用 PDGFR-α ASODN 预防后囊膜混浊的形成提供实验依据。     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 血小板源性生长因子(PDGF)可以影响人晶状体上皮细胞(LECs)的增生过程,而LECs可终生表达PDGF-α受体(PDGFR-α),PDGFR-α活化后与PDGF结合能促进细胞的DNA合成.反义寡核苷酸(ASODN)技术沉默PDGFR-α基因表达可抑制增生性玻璃体视网膜病变(PVR)过程中视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,并诱导细胞凋亡,但通过该技术是否能够抑制LECs的增生鲜见报道. 目的 研究PDGFR-α沉默对LECs增生的影响,为防治晶状体后囊膜混浊(PCO)提供实验依据.方法 用含胎牛血清的改良型α-MEM培养液体外培养人LECs系SRA01/04细胞株并传代,转染前1d用无抗生素的培养基培养细胞至30％ ～ 50％融合后将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板,接种24 h后采用脂质体进行LECs转染,按照转染物的不同分为空白对照组(不加PDGFR-α ASODN的空白脂质体)、PDGFR-α错义寡核苷酸(MSODN)组(含PDGFR-α ASODN和脂质体)、0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组(含0.5 μmol/L PDGFR-αASODN和脂质体)和1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组(含1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN和脂质体).转染24 h后倒置显微镜下观察各组人LECs的形态学变化,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组LECs中PDGFR-αmRNA的表达;用MTT比色法检测各组细胞的增生(A490)值,计算转染物对LECs的抑制率;采用流式细胞仪分析各组LECs的细胞周期. 结果 转染后24 h,空白对照组及PDGFR-α MSODN组LECs生长良好,细胞呈多边形,数目多;而PDGFR-α ASODN组细胞呈圆形,细胞数目明显减少.RT-PCR检测表明,空白对照组及PDGFR-α MSODN组PDGFR-α mRNA在LECs中的表达较强,而在PDGFR-α ASODN组中的表达强度明显减弱,以1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组更为明显.空白对照组、PDGFR-α MSODN组、0.5μmol/L PDGFR-αASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值分别为0.661±0.036、0.655 ±40.016、0.529±0.030和0.441 ±0.039,其中0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值明显低于空白对照组和PDGFR-α MSODN组,总体比较差异有统计学意义(F=34.08,P＜0.01).空白对照组、PDGFR-αMSODN组、0.5 μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数分别为(47.73±1.18)％、(49.48±1.09)％、(53.31±1.30)％和(59.98±0.95)％,总体比较差异有统计学意义(F=68.41,P＜0.01),其中0.5 μmoL/L PDGFR-αASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 PDGFR-α沉默能抑制人LECs的增生.     

PDGF-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响,为治疗后发性白内障提供实验依据.方法 体外培养人晶状体上皮细胞SRA01/04,用脂质体将合成的血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)处理SRA01/04,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡;Hoechst33258荧光染料染色法分析细胞凋亡;RT-PCR检测PDGF-α受体的表达.结果 PDGFR-αASODN作用于SRA01/04细胞24 h～72 h,SRA01/04细胞增殖受抑制,且72 h时对细胞的抑制作用最明显,与低浓度药物组比较,高浓度药物组对细胞的抑制作用增强(P＜0.05);实验组细胞凋亡率分别为(3.22±0.25)％、(5.29±0.27)％,与对照组(0.75±0.67)％和错义寡核苷酸组(1.46±0.60)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组G1期细胞分布率分别为(53.31±1.30)％、(59.98±0.95)％,与对照组(47.73±1.18)％和错义寡核苷酸组(49.48±1.09)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组PDGF-α受体在SRA01/04中表达下调.结论 PDGF-α受体沉默能抑制人晶状体上皮细胞的增殖,诱导其凋亡.     

靶向PDGFR-α mRNA的RNA干扰抑制实验性增生性玻璃体视网膜病变

目的：观察血小板源性生长因子-α受体( platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-α) mRNA的RNA干扰抑制实验性增生性玻璃体视网膜病变( proliferative vitreoretinopathy, PVR)的效果。方法：选择PDGFR-α shRNA/lip2000比值1∶1、1∶2、1∶3(其中PDGFR-α shRNA分别为2μg、3μg和4μg)制备复合物转染至人视网膜色素上皮细胞( human retinal pigment epithelium,HRPE)中,24h后分别取0.1mL注射到家兔玻璃体腔。选取健康成年有色家兔40只随机分为平衡盐溶液(balanced salt solution, BSS)组(N组),含lipofectamineTM2000的HRPE细胞稀释液组( A组),取最佳转染效率的1.0、1.5与2.0μmol/L含PDGF-α受体的shRNA及lipofectamineTM2000的HRPE细胞稀释液组( B、C和D组),每组8眼,右眼为实验眼。间接眼底镜观察PVR程度,免疫组织化学染色进行切片着色情况观察及组织病理学观察眼底改变。结果：PDGFR-α shRNA/lip2000比值1∶2时,HRPE细胞最佳转染效率;B组、C组和D组PVR程度、组织病理学改变、免疫组织化学染色PDGFR-α浓度低于A组,D组比B组和C组更低。结论：PDGF-α受体mRNA的RNA干扰对实验性PVR形成有抑制作用。     

体外传代培养对人视网膜色素上皮细胞免疫调控能力的影响

目的:研究体外传代培养对人类视网膜色素上皮(human reti-nal pigment epithelialium,HRPE)细胞免疫调控能力的影响。方法:建立HRPE细胞与异体淋巴细胞共培养系统,采用流式细胞术检测原代及传代HRPE细胞(第1、2、3、4、5、6代)Fas表达以及诱导异体淋巴细胞凋亡能力的差异。结果:HRPE与淋巴细胞体外共培养时,HRPE细胞Fas表达随着传代逐渐减弱,Fas表达与传代代数呈负相关(阳性细胞率r=-0.859,P<0.01;平均荧光强度r=-0.880,P<0.01),HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡随着传代逐渐减弱,淋巴细胞凋亡率与传代代数呈负相关(r=-0.838,P<0.01),共培养时传代HRPE细胞Fas表达迅速下降,至第3代与第4代间Fas表达差异无统计学意义(P>0.05),共培养时传代HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡率迅速下降,至第3代与第4代间淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:体外传代培养的HRPE细胞,传代数越大细胞变异越大,第3代后细胞的免疫调控能力明显下降。     

c-FLIP反义寡核苷酸诱导胚胎型横纹肌肉瘤细胞凋亡的研究

目的探讨c-FLIP反义寡核苷酸(c-FLIPantisenseoligodeoxynucleotide,c-FLIP-ASODN)对c-FLIP的表达调控及诱导人胚胎型横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞凋亡的作用。方法以脂质体为载体,将c-FLIP-ASODN及对照序列分别转染RD细胞,分别通过WesternBlotting、RT-PCR方法检测ASODN对c-FLIP蛋白和mRNA表达量的调控,用流式细胞术测定ASODN干预前后RD细胞凋亡率的变化。结果与对照序列相比,Western印迹显示,转染了c-FLIP-ASODN的RD细胞其FLIPS和FLIPL的表达量分别下降为空白对照组的51%和57%;RT-PCR检测表明c-FLIP-ASODN能抑制c-FLIPmRNA的表达;诱导凋亡48h后,转染c-FLIP-ASODN的RD细胞凋亡率升高(29.3±6·3)%.结论c-FLIP-ASODN可有效转染RD细胞,下调c-FLIPmRNA表达,从而诱导RD细胞的凋亡,成为眼眶RD基因治疗的新靶向。     

腺病毒转导的胞嘧啶脱氨酶基因联合5-氟胞嘧啶对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究毒性基因联合前体药物对人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium, HRPE）细胞增殖的抑制作用，探讨防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的有效方法。 方法 分别将不同浓度胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)基因、5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5-FC)加入第3 代体外培养的HRPE培养液中，以x-半乳糖甘酶(x-galactosidae, X-gal)与基因乳糖操纵子(lac operon,Lac Z)标记CD基因，通过检测HRPE阳性感染率衡量腺病毒的转导效率。甲基四唑盐比色法(methylthiazolyl-terazollium,MTT)检测细胞的增殖抑制率。 结果 CD基因对HRPE的转染率呈剂量依赖性。CD基因转染阳性的HRPE细胞可将5-FC转变为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)，有效抑制体外培养的HRPE细胞增殖。本研究中所用的毒性基因联合前体药物治疗系统对RPE细胞生长无明显的旁观效应。 结论 腺病毒载体作为高效载体，可选择性将目的基因转入细胞中。为药物防治PVR形成提供了新思路。 （中华眼底病杂志，2003，19：168-171）     

人类视网膜色素上皮细胞体外培养的转分化

目的:研究人类视网膜色素上皮细胞(human retinal pig-ment epithelium,HRPE)体外培养的转分化现象。方法:倒置显微镜观察体外培养HRPE细胞形态变化;采用免疫细胞化学染色方法检测HRPE细胞角蛋白及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化。结果:HRPE细胞体外培养时形态由上皮细胞特征变化成为间质样细胞;细胞角蛋白表达与传代代数呈负相关(r=-0.831,P<0.001),α-SMA表达与传代代数呈正相关(r=0.456,P=0.002);角蛋白18表达高密度组较低密度组强(t=2.591,P=0.027);而α-SMA表达高密度组较低密度组弱(t=2.938,P=0.015)。结论:HRPE细胞体外培养转分化主要是体内外环境差异引起。     

腺伴随病毒介导的脑源性神经营养因子对体外培养的鼠视网膜神经节细胞转染及生长特性的影响

目的 探讨重组腺伴随病毒载体介导的脑源性神经营养因子(rAAV-BDNF)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(RGCs)转染及其生长活性的影响.方法 实验研究.(1)应用rAAV-BDNF对体外培养2 d的RGCs进行转染;(2)应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测外源性BDNF基因在RGCs细胞mRNA水平的表达情况;(3)应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法,对细胞培养液中BDNF含量进行检测;(4)对rAAV-BDNF转染细胞、未转染细胞及加入BDNF的培养细胞进行MTT比色分析;(5)应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪,检测rAAV-BDNF转染细胞、未转染细胞及加入BDNF培养细胞的凋亡比率.结果 (1)RT-PCR检测结果:转染细胞表达外源性BDNF基因,而未转染细胞不表达BDNF基因.(2)ELISA法检测结果:rAAV-BDNF转染细胞的培养液中BDNF含量:转染7 d后为(616.1±40.0)ng/L,转染14 d后为(1075.1±48.7)ng/L.(3)MTT比色结果:转染3和6 d后,rAAV-BDNF转染细胞与未转染细胞间的吸光度(A)值差异无统计学意义(t=1.084,1.582;P=0.284,0.120);转染9 d后,转染细胞的A值高于未转染细胞(t=4.854,P=0.000).(4)流式细胞仪检测结果:rAAV-BDNF转染细胞和加入BDNF培养细胞的凋亡率明显低于未转染细胞的凋亡率,差异有统计学意义(P=0.015,0.017).结论 rAAV-BDNF可有效转染体外培养的鼠RGCs,转染细胞可在转录水平和翻译水平表达外源性BDNF基因,且生长活性改善,凋亡细胞减少.这为青光眼视神经保护的基因治疗提供了理论和技术支持.     

p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞氧化损伤中的作用及机制

目的：研究p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)氧化损伤过程中的作用及机制。

方法：将转染p75 NTR受体的RPE细胞作为实验组,未转染的RPE细胞作为对照组。BrdU检测法检测细胞增殖活性; PI/Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率; 激光显微镜观察细胞内ROS的表达情况; 流式细胞仪检测细胞内ROS、线粒体标志物、细胞色素C表达水平; Western blot法检测细胞中Fas蛋白、裂解Caspase-3、VEGF165蛋白的表达水平。

结果：随着p75 NTR受体转染时间的延长,实验组RPE细胞的增殖活性呈逐渐降低趋势,各转染时间点的RPE细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P<0.05); 实验组各转染时间点的RPE细胞增殖活性均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着转染时间的延长,实验组RPE细胞凋亡率呈逐渐增加趋势,各转染时间点的RPE细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.01); 实验组各转染时间点的RPE细胞凋亡率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。实验组ROS荧光信号明显强于对照组。流式细胞仪检测结果显示,实验组RPE细胞中ROS、细胞色素C水平均明显高于对照组,线粒体标志物水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot 法检测结果表明,实验组细胞内Fas蛋白、Caspase-3、VEGF₁₆₅蛋白的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。

结论：p75 NTR受体高表达可导致RPE细胞线粒体发生损伤,同时促进细胞凋亡,最终导致脉络膜新生血管的形成,表明p75 NTR受体可能是导致RPE细胞发生损伤的因素之一。     

两种磁性纳米颗粒介导人sFIt-1基因片段转染的比较

目的:比较羧甲基化葡聚糖(carboxymethylated dextran,CMD)与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)纳米磁颗粒作为基因载体对可溶性血管内皮生长因子受体-1(solublefms-like tyrosinekinase-1,sFIt-1)胞外第2-3区sFIt-1(2-3)基因片段转染的差异。方法:通过磁颗粒载体将构建的真核表达质粒pcDNA3.1/sFIt-1(2-3)的基因片段转染入人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中,检测各组的转染效率和对细胞增殖能力及凋亡的影响。实验分为CMD磁颗粒(CMD-MAG)组、PEI磁颗粒(PEI-MAG)组、单纯PEI组和未转染对照组,用第3~5代处于对数生长期的HUVEC为转染对象。在相同外界磁场条件下分别以N/P(聚合物中的氨基基团与DNA中磷酸基团的摩尔比)为10,15,20,25,30的PEI/DNA/CMD-MAG复合物、PEI/DNA/PEI-MAG复合物转染HUVEC,并以不加磁场下单纯PEI/DNA复合物转染的和未经转染的HUVEC作为对照。24h后倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪检测以上述不同方法转染了增强型绿色荧光蛋白质粒(pcDNA3.1-EGFP)的细胞绿色荧光表达百分率以反映目的基因片段sFIt-1(2-3)的转染率;RT-PCR法和Westernblot法检测转染pcDNA3.1/sFIt-1(2-3)后sFIt-1(2-3)mRNA和蛋白的表达。通过MTT法观测各组细胞的生长情况,计算各组细胞的相对增殖百分率;通过Ho-echst染色法观察各组细胞的凋亡百分率,以此对比不同磁颗粒载体转染后对细胞的影响。结果:在N/P为20时,各组GFP的转染率最高,且CMD磁颗粒组各N/P时转染率均高于其他组;转染pcDNA3.1/sFIt-1(2-3)后24h,CMD-MAG组sFIt-1(2-3)的mRNA和蛋白的表达均明显高于其他组;CMD磁颗粒转染组细胞增殖能力与对照组无明显差异,而PEI磁颗粒组、PEI组转染组细胞增殖能力均明显降低;CMD磁颗粒转染组约有5%细胞发生凋亡,PEI磁颗粒组凋亡细胞百分数约为20%~30%,PEI组约为50%。结论:CMD纳米磁颗粒可作为载体实现目的基因片段的高效率转染;在转染率和细胞毒性等方面CMD纳米磁颗粒均优于PEI纳米磁颗粒,可作为sFIt-1基因片段转染和眼底新生血管性疾病基因治疗的载体。     

HSP47 siRNA对体外培养HTCF细胞生物学行为及TGF-β1表达水平的影响

目的:探究热休克蛋白47(HSP47)siRNA对体外培养人眼Tenon囊成纤维(HTCF)细胞生物学行为及转化生长因子-β1(TGF-β1)表达水平影响。方法:体外培养HTCF细胞,并分为:空白对照组、空载体组和转染组;转染组根据HSP47基因序列设计并合成干扰siRNA序列,构建载体并导入HTCF细胞中;空载体组导入空白载体。采用RT-PCR和蛋白质印迹实验检测细胞中HSP47 mRNA和蛋白的表达情况,采用克隆形成实验、流式细胞术、Transwell法及划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移,蛋白质印迹实验检测增殖、凋亡、侵袭、迁移蛋白和TGF-β1的表达情况。结果:相比空载体组,转染组HSP47 mRNA和蛋白的表达、克隆形成率、细胞愈合率、侵袭细胞数目、Ki67、N-cadherin、TGF-β1蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05),但细胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平均无差异(P>0.05)。结论:HSP47 siRNA可以通过抑制TGF-β1蛋白的表达降低HTCF细胞的增殖、侵袭及迁移能力,但对HTCF细胞的凋亡无明显影响。     

抗PDGFR-α抗体对铁锈诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖过程的作用

目的：观察抗血小板源性生长因子受体α（PDGFR-α）抗体对铁锈诱导的人视网膜色素上皮细胞（hRPE）增殖活性的影响。方法：采用细胞体外培养技术,用铁锈建立hRPE细胞增殖分化模型。设置空白组、铁锈组、抗PDGFR-α抗体（1,10,50,100μg/mL）处理组,分别作用0,12,24,48h后采用MTT比色法测定hRPE细胞的抑制率。结果：加入抗PDGFR-α抗体后hRPE细胞增殖活性在一定浓度范围内随着抗体浓度增加而下降,而50μg/mL抗PDGFR-α抗体为抑制hRPE细胞增殖的最佳浓度,其抑制率为42.44%。结论：抗PDGFR-α抗体可以抑制hRPE细胞的增殖活性。     

抗PDGFR-ɑ抗体对铁锈诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖过程的作用

目的:观察抗血小板源性生长因子受体ɑ(PDGFR-ɑ)抗体对铁锈诱导的人视网膜色素上皮细胞(hRPE)增殖活性的影响。方法:采用细胞体外培养技术,用铁锈建立hRPE细胞增殖分化模型。设置空白组、铁锈组、抗PDGFR-ɑ抗体(1,10,50,100μg/mL)处理组,分别作用0,12,24,48h后采用MTT比色法测定hRPE细胞的抑制率。结果:加入抗PDGFR-ɑ抗体后hRPE细胞增殖活性在一定浓度范围内随着抗体浓度增加而下降,而50μg/mL抗PDGFR-ɑ抗体为抑制hRPE细胞增殖的最佳浓度,其抑制率为42.44%。结论:抗PDGFR-ɑ抗体可以抑制hRPE细胞的增殖活性。     

CTGF反义寡核苷酸对人晶状体上皮细胞转分化的探讨

目的:探讨结缔组织生长因子反义寡核苷酸对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)合成CTGF与α-SMA表达的影响。方法:测定CTGF反义寡核苷酸对体外培养HLECs的转染率;应用CTGF反义寡核苷酸直接转染第3代HLECs进行细胞生长曲线的测定;采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测细胞CTGF和α-SMAmRNA水平。结果:直接导入法反义寡核苷酸进入较慢,但72h未出现细胞毒性。CTGF-ASON直接导入法培养细胞72h后可见对细胞增殖抑制作用。直接导入法处理48h后,TGF-β1刺激能显著增加CTGF以及α-SMAmRNA的表达,但却可被CTGF-ASON直接导入法所抑制,而错义寡核苷酸却没有这种作用。结论:CTGF反义寡核苷酸直接转染HLECs能抑制TGF-β1诱导的CTGF与α-SMA表达上调,提示阻断CTGF可能是防治后发性白内障的有效手段。     

TNF-α对培养视网膜微血管内皮细胞与周细胞PDGF-B/PDGFR-β表达的作用

目的:研究TNF-α对内皮细胞与周细胞PDGF-B/PDGFR-β表达的作用。方法:常规剂量100μg/L以及大剂量2450μg/LTNF-α作用于培养的视网膜微血管内皮细胞、周细胞,通过免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测PDGF-B/PDGFR-β表达。结果:内皮细胞组大剂量TNF-α组,PDGF-B表达显著下调,8h表达开始出现下调,在12h,PDGF-B的表达量为原来的39%;在人视网膜微血管周细胞组,与对照组相比,常规TNF-α剂量组PDGFR-β表达并未出现显著改变;大剂量TNF-α组,与对照组相比,PDGFR-β表达在12h下调为45%。结论:TNF-α可引起内皮细胞与周细胞PDGF-B/PDGFR-β表达降低。     

miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的：探讨miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响,并初步研究其分子机制。

方法：选择人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19细胞),将细胞分为7组：空白对照组(不处理)、无义miRNA组(转染mimic NC)、miRNA-147模拟物组(转染miRNA-147 模拟物)、抑制剂阴性对照组(转染shRNA NC)、VEGF抑制剂组(转染VEGF抑制剂)、miRNA-147模拟物+空载病毒载体组(转染miRNA-147模拟物和空载体)和miRNA-147模拟物+VEGF过表达组(转染miRNA-147模拟物和VEGF过表达)。使用RT-qPCR检测各组细胞miRNA-147及VEGF mRNA表达水平; 双荧光素酶实验验证miRNA-147与VEGF靶向关系; Western blot检测VEGF蛋白表达水平; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期的改变; 细胞划痕实验检测细胞迁移。

结果：与空白对照组和无义miRNA组相比,miRNA-147模拟物组miRNA-147表达水平显著升高,VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与抑制剂阴性对照组相比,VEGF抑制剂组VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与miRNA-147模拟物+空载病毒载体组相比,miRNA-147模拟物+VEGF过表达组VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告显示VEGF是miRNA-147的靶基因。转染miRNA-147 模拟物和VEGF抑制剂均可降低ARPE-19细胞增殖和迁移水平,促进细胞凋亡(P<0.05)。转染VEGF过表达可逆转miRNA-147 mimic对ARPE-19细胞增殖、迁移和凋亡的影响(P<0.05)。

结论：miRNA-147可通过靶向VEGF抑制ARPE-19细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。     

miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍及血管生成

目的：明确miR-519d-3p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能障碍与血管生成的影响,并阐明其对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控机制。

方法：通过5、30mmol/L葡萄糖分别诱导HRMEC建立正常(NG)和高糖(HG)细胞模型。将HRMEC分为对照组(HG细胞模型转染阴性对照模拟物)、甘露醇组(对照组加入25mmol/L甘露醇)、miR-519d-3p过表达组(HG细胞模型转染miR-519d-3p模拟物)、miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组(HG细胞模型共转染miR-519d-3p模拟物和HIF-1α过表达载体)。实时荧光定量PCR法检测各组miR-519d-3p的表达情况。Western blotting法检测各组HIF-1α蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验检测miR-519d-3p和HIF-1α的结合位点情况。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡情况。ELISA法检测各组细胞外液炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6蛋白的表达情况。小管形成实验检测各组新生毛细血管管腔样结构形成情况。

结果：与NG相比,HG细胞模型中miR-519d-3p表达显著减少,而HIF-1α蛋白表达显著增加(均P<0.01)。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组中HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可以与HIF-1α 3''-非编码区(3''-UTR)中“GCACUUU”序列特异性结合。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著增加,细胞凋亡率显著减少,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著减少,新生毛细血管管腔样结构数量显著减少(均P<0.01)。与miR-519d-3p过表达组比较,miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著减少,细胞凋亡率显著增加,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著增加,新生毛细血管管腔样结构数量显著增加(均P<0.01)。对照组和甘露醇组中上述各指标比较无差异(均P>0.05)。

结论：高糖诱导HRMEC模型中miR-519d-3p表达下调,而HIF-1α蛋白表达上调。HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因,miR-519d-3p靶向HIF-1α增加细胞增殖并降低细胞凋亡和炎症反应,从而减轻高糖诱导的HRMEC功能障碍并抑制血管生成。     

反义c-myc基因转染抑制人晶状体上皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导的反义cmyc基因(AdASmyc)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEB3)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法将AdASmyc转染HLEB3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA倍体法);采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法、Western免疫印迹法检测细胞cmycmRNA及其蛋白产物表达的变化。结果AdASmyc成功转染后,HLEB3逐渐变圆、脱壁。转染后24~96h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);凋亡细胞比例(转染48h为1833%,转染96h为2693%)明显升高,与相应对照组(48h为319%,96h为175%)比较,差异均有统计学意义(P<001);细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染48h为(6050±759)%,转染96h为(8190±860)%]增加和S期细胞比例[转染48h为(2840±338)%,转染96h为(1675±897)%]下降,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);RTPCR法和Western免疫印迹法检测发现cmycmRNA及其蛋白产物水平特异性下调。结论AdASmyc可成功转染HLEB3,并特异性抑制cmyc基因的表达,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。