过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞内年龄相关性黄斑病变易感因子2表达的影响

目的 研究过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞内年龄相关性黄斑病变易感因子2（age-related maculopathy susceptibility 2,ARMS2）转录和蛋白水平的影响,初步探讨ARMS2基因在氧化应激中对视网膜色素上皮细胞的作用.方法 实验研究.选用ARPE-19细胞,以浓度为0、100、300、500、700μmol/L的H2O2作用一定时间后,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测各浓度组H2O2作用2 h和4 h后ARPE-19细胞生长情况;采用Realtime-PCR（SYBR Green法）和细胞免疫荧光法检测ARMS2的转录及蛋白水平变化.组间比较均采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异法,H2O2浓度与细胞活性的关系采用曲线估计分析.结果 五个浓度的H2O2作用ARPE-19细胞4 h后,吸光度值分别为0.531±0.037、0.370±0.017、0.371±0.016、0.330±0.006和0.297±0.012,差异有统计学意义（F=6.782,P=0.007）.曲线估计分析显示H2O2浓度与细胞活性呈高度负相关（r=-0.99.P=0.036）.100～700 μmol/L H2O2作用ARPE-19细胞后,Realtime-PCR结果 Ct值分别为1.154±0.007、1.324±0.022、1.350±0.011、1.280±0.031,差异有统计学意义（F=33.409.P=0.000）;H2O2浓度在300～500 μmol/L范围时,ARMS2基因mRNA表达量达到高峰,之后下降.细胞免疫荧光检测灰度值结果分别为7320±2493、14 300±848、22400±1596、23400±2405、19 200±561,差异有统计学意义（F=22.843,P=0.000）;H2O2浓度在300～500 μmol/L范围时,ARMS2蛋白表达量达到高峰,之后下降.转录和蛋白水平变化趋势一致.结论 H2O2在一定浓度范围内时,可诱导氧化应激,使ARPE-19细胞内ARMS2转录和蛋白水平增加,如果H2O2的浓度超过ARPE-19细胞耐受范围,ARMS2基因表达量下降.     

三氧化二砷诱导人晶状体上皮细胞凋亡的机制研究

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对离体培养的人晶状体上皮细胞(FHL124)的凋亡及其作用机制.方法 实验研究.四甲基偶氮唑盐比色法观察As2O3对FHL124细胞的抑制作用;原位缺口末端标记(TUNEL)法测定细胞凋亡;Taqman实时荧光定量PCR检测基因表达的变化;荧光显微镜动态监测细胞内Ca2+浓度的变化.As2O3对FHL124细胞的生长抑制和细胞内Ca2+浓度的变化采用t检验进行分析;3种基因不同处理组间表达水平差异的比较采用Wilks'λ检验;单个基因比较采用LSD-t检验.结果 As2O3(3×10-7～1×10-4mol/L)对FHL124细胞的作用呈浓度依赖性,1 μmol/L As2O3即可显著抑制FHL124细胞的生长,半效抑制量(IC50)为1.5 μmol/L.TUNEL检测证实As2O3诱导FHL124细胞凋亡,引起FHL12A细胞DNA断裂.实时定量荧光PCR结果显示,As2O3可以引起FHL124细胞与内质网应激信号传导有关的基因产物EIF2A,ERN1和ATF6显著增加(F=8.51,P=0.0005).细胞内Ca2+测定显示As2O3降低细胞内Ca2+浓度,从而降低了Ca2+信号的峰值.20 μmol/L As2O3孵育30 min后,峰值降低了(66.34±4.47)%(P=0.0018),60 min则降低了(96.95±7.98)%(P=0.0002).20 μmol/L As2O3使Ca2+内流幅值及速度分别降低了(22.59±2.98)%和(39.69±6.01)%.结论 As2O3抑制FHL124细胞的生长并诱导细胞凋亡,诱导内质网应激可能是其重要作用机制之一.     

硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的 利用丙烯醛建立年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的细胞损伤模型,并观察硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导ARPE-19细胞损伤的保护作用.方法 MTT比色法检测ARPE-19细胞的生长周期.将25μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24 h,复制AMD细胞水平的损伤模型并确定其损伤浓度;预先加入50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体及150 μmol·L-1硫辛酸预处理对数生长期细胞24 h后,再加入已经确定细胞损伤模型的丙烯醛浓度处理24 h,前后两次处理后均用MTT比色法检测细胞活性,HE染色法检测细胞数量和形态改变.结果 ARPE-19细胞24 h内开始贴壁,4～5d细胞生长开始融合,第1-6天后生长分裂迅速进入对数生长期,6d后即开始随着时间延长活性显著下降.当丙烯醛浓度达到50 μmol·L-1时,ARPE-19细胞数量明显减少,细胞肿胀、坏死,胞浆收缩、细胞核聚集;而当硫辛酸烟酸二联体浓度达到100 μmol·L-1时即可以明显减少50 μmol·L-1丙烯醛诱导的ARPE-19细胞活性的降低,防止凋亡小体的形成.MTT结果显示:100 μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体+丙烯醛处理组(50 μmol·L-1)抗凋亡效果优于100 μmol·L-1硫辛酸组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用丙烯醛可以诱导ARPE-19细胞损伤来建立AMD细胞损伤的模型,硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤具有保护作用.     

表皮生长因子对氧化损伤的人眼Müller细胞增生及迁移的保护作用

背景 目前认为氧化损伤机制在年龄相关性黄斑变性(AMD)的发病中起着重要作用,主要与血-视网膜屏障的破坏有关,而Müller细胞是稳定血-视网膜内屏障功能的主要细胞成分.研究表明,表皮生长因子(EGF)可促进实验动物视网膜Müller细胞的增生和迁移,但其对人Müller细胞的作用研究较少. 目的 探讨EGF对体外氧化损伤的人眼Müller细胞增生和迁移的影响及其作用机制. 方法 将人眼Müller细胞系MIO-M1细胞进行培养并用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、第Ⅷ因子、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、人角蛋白及S -1 00免疫组织化学法进行鉴定.在无血清DMEM中加入不同质量浓度(0、1、10、30、100 mg/L) EGF,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷( BrdU)标记法测定MIO-MI细胞的阳性率.根据干物方式的不同将培养细胞分为EGF组、H2O2损伤组、EGF+H2O2组、葡萄糖氧化酶(GO)组、GO+EGF组、EGF+ LY294002+H2 O2组,采用MTT比色法测定各组培养细胞的增生情况(A590).对培养的人眼Müller细胞采用划痕实验观察H2O2损伤条件下0、1、10、30、100 mg/L EGF作用24、48、72 h后对Müller细胞增生、迁移的影响;采用Western blot技术检测EGF对体外不同培养条件下M üller细胞Akt信号传导通路的作用. 结果 正常培养条件下10、30、100 mg/L EGF作用后Müller细胞的增生率分别为28.0％、32.9％、39.0％,明显高于0 mg/L、1 mg/L EGF组(24.5％、26.2％).在H2O2和GO分别培养细胞的条件下,高质量浓度的EGF组Müller细胞的吸光度(A570)值明显大于低质量浓度组,各组总体差异有统计学意义(F=23.582,P=0.000).与EGF+H2O2组比较,EGF+ LY294002+H2O2组Müller细胞的吸光度(A570)值明显下降.10 mg/L EGF促进Müller细胞迁移的作用最强.0.08 mmol/LH2O2作用Müller细胞后Akt信号通路激活,提前2h加入外源性EGF后,100 mg/L EGF对抗氧化所致Müller细胞的损伤作用最明显,同时提前2h加入外源性EGF和Akt信号通路阻断剂LY294002后,Akt信号传导通路的保护作用减弱. 结论 EGF对体外培养的Müller细胞具有促进增生及迁移的作用,10 mg/L EGF促进Müller细胞迁移作用最强.100 mg/L外源性EGF抗Müller细胞氧化损伤作用最强,其作用机制是激活Akt信号传导通路.     

全反式视黄酸对诱导为神经元样细胞的脐带间充质干细胞分化和凋亡的影响

目的 观察不同浓度全反式视黄酸(ATRA)在诱导脐带间充质干细胞(MSC)向神经元样细胞分化中对细胞形态、增殖、凋亡的作用并筛选其最适诱导浓度.方法 实验研究.取生长良好的第3代脐带MSC接种于24孔培养板,细胞贴壁后培养基更换为含ATRA的DMEM/F-12培养液.ATHA终浓度分别为0 μmol/L(对照组,A组)、0.25 μmol/L(B组)、0.5 μmol/L(C组)、1.0 μmol/L(D组)、2.0 μmol/L(E组)、4.0 μmoL/L(F组),诱导后1 h、24 h观察细胞形态,并应用MTT法监测ATBA的细胞毒性.另取对照组和经各浓度ATRA诱导24 h后的细胞应用Annexin-V/PI联合流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率和双标染色后的细胞着色情况,综合上述指标确定ATRA诱导脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的最适浓度.根据资料性质,对不同浓度ATRA作用24 h后各组间A值、细胞凋亡率进行比较,采用单因素方差分析,并应用t检验进一步进行两两比较;对照组和ATRA诱导组之间神经元样细胞阳性表达率的比较采用配对资料的t检验.结果 与对照组相比,ATRA(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L)对MSC形态、细胞增殖、细胞凋亡均无明显影响(t=0.72,1.32;P>0.05);高浓度(4.0 μmoL/L)加入后即刻可见部分细胞浮起,24 h后无贴壁细胞;≥1.0 μmol/LATRA诱导24 h后能极显著抑制细胞增殖(t=8.8,18.9,22.1;P<0.01),且随ATRA浓度增加,抑制作用越明显.诱导24 h后,2.0 μmol/L组细胞回缩较1 h更明显,大部分细胞由长梭形回缩至类圆形,细胞质内出现粗大颗粒,部分细胞漂浮;1.0 μmoL/L组中仅有少数细胞有形态改变;Annexin-V/PI联合FCM检测显示≥1.0 μmol/L组细胞凋亡率与对照组间差异有统计学意义(t=9.88,19.95,31.6l;P<0.01).结论 0.5 μmol/L ATRA是诱导脐带MSC向神经元样细胞转化的最佳剂量,≥1.0 μmol/L能明显抑制MSC的增殖,增加细胞凋亡率并诱导细胞发生明显损伤.     

三氧化二砷对体外培养的人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究

目的 观察三氧化二砷（As2O3）对体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生抑制及凋亡诱导作用。方法 不同浓度的As2O3理细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，四唑盐（MTT）比色法检测人RPE细胞对As2O3的药物敏感性，流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡率。结果 药物处理后细胞出现凋亡形态改变。MTT比色法结果显示，As2O3作用血清组人RPE细胞后各实验组与对照组之间吸光度比较有统计学意义，药物剂量分别为：作用24h为6．25μmol／L（P=0．018）、48h为6．25μmol／L（P〈0．01）、72h为1．56μmol／L（P〈0．01）；作用无血清组细胞48h后为12．5μmol／L（P〈0．01）。流式细胞仪分析结果显示As2O3作用人RPE细胞周期改变表现为S期阻滞及G2／M期延长。As2O3处理人RPE细胞后出现凋亡峰。结论 As2O3可抑制体外培养的人RPE细胞的生长并诱导其凋亡，有望为临床防治增生性玻璃体视网膜病变（PVR）提供新的药物干预。     

表皮生长因子对氧化损伤的人眼Muller细胞增生及迁移的保护作用

背景目前认为氧化损伤机制在年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病中起着重要作用,主要与血一视网膜屏障的破坏有关,而Mailer细胞是稳定血一视网膜内屏障功能的主要细胞成分。研究表明,表皮生长因子（EGF）可促进实验动物视网膜Muller细胞的增生和迁移,但其对人Muller细胞的作用研究较少。目的探讨EGF对体外氧化损伤的人眼Muller细胞增生和迁移的影响及其作用机制。方法将人眼Maller细胞系MIO—M1细胞进行培养并用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、第Ⅷ因子、a-平滑肌肌动蛋白（Ot—SMA）、人角蛋白及S-100免疫组织化学法进行鉴定。在无血清DMEM中加入不同质量浓度（0、1、10、30、100mg／L）EGF,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法测定MIO—M1细胞的阳性率。根据干预方式的不同将培养细胞分为EGF组、H2O2损伤组、EGF＋H2O2组、葡萄糖氧化酶（GO）组、GO＋EGF组、EGF＋LY294002＋H2O2组,采用MTT比色法测定各组培养细胞的增生情况（A590）。对培养的人眼Muller细胞采用划痕实验观察H2O2损伤条件下0、1、10、30、100mg／LEGF作用24、48、72h后对Miiller细胞增生、迁移的影响;采用Westernblot技术检测EGF对体外不同培养条件下MUller细胞Akt信号传导通路的作用。结果正常培养条件下10、30、100mg／LEGF作用后Muller细胞的增生率分别为28．0％、32．9％、39．O％,明显高于0mg／L、1mg／LEGF组（24．5％、26．2％）。在H2O2和GO分别培养细胞的条件下,高质量浓度的EGF组Muller细胞的吸光度（A570）值明显大于低质量浓度组,各组总体差异有统计学意义（F=23．582,P=0．000）。与EGF＋H2O2组比较,EGF＋LY294002＋H2O2组Muller细胞的吸光度（A570）值明显下降。10mg／LEGF促进Muller细胞迁移的作用最强。0．08mmol／L H2O2作用Mfiller细胞后Akt信号通路激活,提前2h加入外源性EGF后,100mg／LEGF对抗氧化所致Mtiller细胞的损伤作用最明显,同时提前2h加入外源性EGF和Akt信号通路阻断剂LY294002后,Akt信号传导通路的保护作用减弱。结论EGF对体外培养的Muiler细胞具有促进增生及迁移的作用,10mg／LEGF促进Muller细胞迁移作用最强。100mg／L外源性EGF抗Muller细胞氧化损伤作用最强,其作用机制是激活Akt信号传导通路。     

姜黄素通过AKT/HIF-1α/VEGF信号通路在体外抑制脉络膜新生血管的机制

目的：探讨姜黄素在体外抑制脉络膜新生血管(CNV)生成的作用及机制。

方法：氯化钴(CoCl₂)诱导人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞建立化学性缺氧模型,采用CCK-8法检测姜黄素对CoCl₂诱导的ARPE-19细胞活性的影响,采用RT-qPCR和Western blot检测姜黄素对CoCl₂诱导的ARPE-19缺氧模型细胞内AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达的影响。采用细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验、Transwell小室侵袭实验及Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。

结果：100μmol/L CoCl₂可成功建立ARPE-19细胞化学缺氧模型。CoCl₂在100μmol/L浓度下促进ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。姜黄素在浓度为100μmol/L时可减少ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。ARPE-19细胞姜黄素低(6.25μmol/L)、中(25μmol/L)、高剂量组(100μmol/L)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移; 其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移和细胞侵袭。ARPE-19细胞姜黄素中、高剂量组条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。

结论：姜黄素在100μmol/L对CoCl₂诱导ARPE-19细胞缺氧有保护作用。姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。     

曲安奈德对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)增生抑制作用的实验研究

目的观察曲安奈德（triamcinolone acetonide，TA）对培养的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）增生的影响。设计实验性研究。研究对象ARPE-19。方法采用MTT比色法和TUNEL染色法观察不同终质量浓度（0、10、30、300mg／L）TA分别作用于培养的ARPE-19细胞24、72小时后细胞的增生和凋亡的情况。主要指标吸光度，凋亡指数。结果（1）TUNEL法：质量浓度10mg／LTA不影响ARPE-19细胞的生长，随着质量浓度增大，细胞凋亡程度逐渐增强（t=2．921，P〈0．01），随着时问延长，ARPE-19细胞的凋亡指数逐渐增大（t=2．306，P〈0．01）。（2）MTT法：TA浓度和作用时间均对ARPE-19细胞的增生具有显著影响，随着浓度增加和时间延长，其抑制作用的差别有显著性意义（F0．05，3．16=3．24，P〈0．05；F0.05,1．16=4．49，P〈0．05），而且，TA浓度和作用时间相互影响着ARPE-19细胞的生长，对其抑制作用具有统计学意义（F0.05,1．16=4．49，P〈0．05）。结论TA能够抑制ARPE-19细胞的增生，通过玻璃体腔内注射TA或联合玻璃体切割手术可能成为增生性玻璃体视网膜病变的有效治疗。     

雌激素对蓝光及过氧化氢诱导的ARPE-19细胞内活性氧生成的影响

目的:观察17-β雌二醇(E2)对蓝光及过氧化氢(H2O2)诱导的人视网膜色素上皮ARPE-19细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的影响方法:对培养的ARPE-19细胞予以浓度为10nmol/L,100nmol/L,1μmol/L的E2预处理2h后接受蓝光照射(470±20nm,2000±500lx)或200μmol/LH2O2处理,在处理前、处理后30min;1,2,4h行2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)细胞内ROS荧光染色,以490nmol/L荧光显微镜观察照相,收集细胞后以流式细胞仪检测荧光强度。结果:蓝光照射和过氧化氢均可显著增强ARPE-19细胞内的ROS荧光,提示蓝光照射和过氧化氢处理均成功诱导氧化应激,10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L17β-雌二醇剂量依赖性地减弱蓝光照射和过氧化氢处理后ARPE-19细胞内的ROS荧光增强的幅度。结论:蓝光照射及过氧化氢处理可诱导ARPE-19细胞内活性氧水平增高;17β-雌二醇可剂量依赖性地抑制蓝光照射诱导的ARPE-19细胞内活性氧水平增高。     

LY294002对人晶状体上皮细胞蛋白激酶B活化的影响

背景蛋白激酶B（Akt）与许多细胞信号转导通路密切相关，从而参与多种细胞功能活动的调控，包括细胞的增生、迁移和代谢等，其中磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）可催化Akt活性并启动各种相关的细胞信号通路。P13K抑制剂能够抑制Akt活性，但是否影响后发性白内障发生过程中残留的晶状体上皮细胞（LECs）的生物学行为尚不清楚。目的观察P13K抑制剂LY294002对人LECs中Akt活化的影响。方法对人LECs系HLEC-B3细胞进行常规培养和传代，然后接种于96孔板中，培养24h后在培养板中加入LY294002，终浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80μmol／L，继续培养24h后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞的增生抑制率。在同一批接种于6孔板内无菌盖玻片上的传代细胞中加入10μg／L转化生长因子-β2（TGF—β2）为诱导组，用20μmol／LLY294002预培养1h后再加入10Ixg／LTGF—β2进行共培养为TGF—B，与LY294005共培养组，以未加入TGF，p：和LY294002的细胞作为对照组，应用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞中磷酸化Akt（p-Akt）的荧光表达情况，并用Westernblot法检测各组细胞中p-Akt表达量的差异。结果CCK-8法检测结果显示，随着LY294002浓度的增加，HLEC—B3的吸光度（A）值逐渐减小，即LY294002对HLEC—B3细胞增生的抑制作用随浓度的增加而逐渐增强，不同浓度LY294002组间HLEC—B3的A值比较差异有统计学意义（F分组=9．72，P=0．00）；随着检测时间点的延长，HLEC—B3的4值逐渐增大，不同检测时间点A值比较差异有统计学意义（F时间=1737．54，P=0．00）。激光扫描共焦显微镜观察显示，对照组细胞仅有微量的p-Akt红色荧光，诱导组p-Akt表达明显增多，并向细胞膜聚集，细胞轮廓清晰，而TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt表达的红色荧光明显减弱，细胞形态不清。Westernblot法检测结果显示，对照组、诱导组和TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt的表达量分别为0．91±0．08、1．48±0．13和0．95±0．19，3个组间差异有统计学意义（F=15．04，P=0．00）。结论LY294002能够拈抗TGF—β2诱导的Akt磷酸化激活过程，有望成为新的有效防治后发性白内障的药物。     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

特异性转化生长因子-β_2 shRNA对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察转化生长因子-β2（TGF-β2）特异性短发夹RNA（shRNA）对人眼Tenon囊成纤维细胞（TCFs）TGF-β2表达的影响及对人TCFs增生的抑制作用。方法根据小干扰RNA（siRNA）的设计原则,针对TGF-β2基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染培养的人TCFs。MTT比色法检测细胞的增生情况;ELISA法检测shRNA对TGF-β2蛋白表达的抑制作用。结果 TGF-β2shRNA转染组的细胞增生及TGF-β2蛋白的表达均受到抑制。转染24、48、72h后MTT比色法检测显示,TGF-β2shRNA转染组培养的Tenon囊的成纤维细胞的增生值分别为0.5426±0.05、0.5210±0.03、0.4055±0.04,明显低于阴性对照组的0.5655±0.03、0.5378±0.03、0.5268±0.04,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=54.691,P=0.000;Ftime=66.888,P=0.000）。ELISA法检测显示,TGF-β2shRNA转染组TGF-β2蛋白的表达水平下降,24、48、72hTGF-β2蛋白的表达量分别为（543.58±25.32）、（400.26±30.74）、（202.72±23.24）ng/L,明显低于阴性对照组的（659.78±20.95）、（547.45±24.65）、（442.87±17.43）ng/L及空白组的（721.75±30.19）、（756.61±30.19）、（787.60±18.37）ng/L,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=163.082,P=0.000;F时间=31.498,P=0.000）。结论 TGF-β2特异性shRNA能显著抑制人TCFsTGF-β2的表达,载体介导的TGF-β2特异性shRNA对眼前节术后的抗瘢痕化治疗具有潜在的可能性。     

转化生长因子β2对牛角膜内皮细胞增生的影响

目的体外培养牛角膜内皮细胞（CECs）,观察不同质量浓度的外源性转化生长因子β2（TGF-β2）对牛CECs的增生抑制作用。方法0.1、1、10、100μg/L的TGF-β2作用于体外培养的牛CECs,于24、48、72h观察不同质量浓度的TGF-β2对牛CECs的影响。采用CCK-8检测法测定各孔吸光度（A值）,采用流式细胞检测仪对各组细胞周期进行检测。结果0.1、1、10μg/L的TGF-β2作用后各时间点,均能使牛CECs的吸光度发生改变。在同一时间点,0.1μg/L、1μg/L的TGF-β2抑制效果最为显著。各质量浓度的TGF-β2对牛CECs作用48h,其吸光度改变最明显。48h时,0.1μg/L、1μg/L的TGF-β2对牛CECs的增生抑制作用明显。各质量浓度组作用48h后,0.1μg/L、1μg/L组牛CECs的G0周期细胞所占比例与阴性对照组比较,差异均有统计学意义,而10μg/L、100μg/L组的牛CECs的G0期细胞百分比与阴性对照组比较,差异均无统计学意义。结论0.1μg/L、1μg/L的TGF-β2作用24、48、72h对牛CECs均具有明显的增生抑制作用。     

三氧化二砷诱导的视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞白噬的研究

背景细胞的自噬是肿瘤细胞非凋亡形式的死亡过程,研究证实三氧化二砷（As2O3）可诱导肿瘤细胞凋亡,但As2O3是否可致SO—Rb50细胞发生自噬的研究鲜有报道。目的探讨As2O3体外诱导SO—Rb50细胞自噬的作用。方法用浓度为0．5、1．0、2．0、4．0μmol／L的As2O3培养液及不含As2O3的未处理组处理SO—Rb50细胞系48h,采用MTT法测定各As2O3,浓度组SO—Rb50细胞的吸光度（As2O3）值。构建自噬标志物磷酸化绿色荧光蛋白（pGFP）-LC3体外转染SO—Rb50细胞,并分为新鲜RPMI一1640培养组（未处理组）、As2O3,RPMI一1640培养组（As2O3处理组）和rapamycin培养组（阳性对照组）,于48h后行激光共焦显微镜检测细胞自噬;用自噬特异性染料单丹磺酰戊二胺（MDC）行荧光染色检测SO—Rb50细胞的自噬,并用透射电子显微镜检测SO—Rb50细胞的自噬表现,采用流式细胞仪定量检测不同浓度As2O3,处理组自噬泡阳性细胞百分比。结果未处理组和0．5、1．0、2．0、4．0txmolAs2O3,作用48h后SO—Rb50细胞的A570值分别为2．194＋0．066、1．841±0．213、1．035±0．046、0．374±0．042和0．167±0．019,总体比较差异有统计学意义（F=547．636,P〈0．05）,其中各浓度As2O3组A。值均明显低于未处理组,差异均有统计学意义（均P=0．000）。As2O3处理组和阳性对照组可见GFP—LC3融合蛋白呈点状聚集在相应的自噬泡,未处理组GFP—LC3呈弥散分布。透射电子显微镜检查可见未处理组SO—Rb50细胞超微结构正常,As2O3处理组和阳性对照组见大量双层膜状结构及自噬溶酶体。未处理组48h见极少量MDC阳性荧光颗粒,As2O3处理组及阳性对照组48h可见明显的MDC阳性荧光颗粒,聚集在细胞质相应的自噬发生区。流式细胞术检测发现未处理组和0．5、1．0、2．0、4．0μmol／LAs2O3及rapamycin作用48h后自噬泡阳性的SO—Rb50细胞百分比分别为0、15．6％、42．7％、57．9％、79．5％和89．0％,随As2O3,浓度的增加MDC阳性细胞百分比递增。结论As2O3,抑制SO—Rb50细胞的生长和增生,并致SO—Rb50细胞发生自噬;SO—Rb50细胞经As2O3处理后,自噬的发生早于细胞核的改变,早中期自噬程度呈明显的As2O3浓度依赖性。     

全反式维甲酸诱导的Cx43基因在RB细胞中的过表达及其对RB生长的抑制作用

背景诱导细胞间隙连接蛋白（＆）基因在瘤细胞中过表达是全反式维甲酸（ATRA）抑制肿瘤细胞生长的重要机制。我们先前的研究已证实,ATRA抑制视网膜母细胞瘤（RB）细胞增生、分化作用的机制与诱导Cx43过表达有关,但药物作用位点及其对在体肿瘤组织生长的影响尚未明确。目的研究ATRA对RB细胞中Cx43基因及其蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法用无水乙醇将ATRA溶解并配制成浓度为1×10^-2mol／L的溶液,使用前再用细胞培养液配制成不同浓度ATRA液。用含体积分数10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液常规培养人RB细胞株HXO—RB44,将1×10^5-×10“和1×10^-2mol／L的ATRA分别加至培养基中,分别于添加后2、4、6d采集细胞,分别采用Westernblot法和逆转录PCR法检测细胞中Cx43蛋白及mRNA的表达变化。选取15只BALB／c裸鼠,将RB细胞悬液1恤l（含5×10^5个细胞）进行裸鼠右眼前房注射,建立裸鼠眼前房RB模型。将造模成功的11只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和1X10。mol／LATRA组,阴性对照组和1×10^-5mol／LATRA组裸鼠分别行0．5％无水乙醇的生理盐水或1×10^-5mol／LATRA前房注射,每3天1次,共注射3周,裂隙灯显微镜下观察各组裸鼠肿瘤生长情况;实验结束时摘除实验眼,用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查。结果Westernblot法检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43蛋白表达量（Acx43／AGPDH）均逐渐增加,总体比较差异有统计学意义（F时间=71．31,P=0．00;F分组7．66,P=0．00）;药物作用后2d1×10^-5mol／LATRA组、作用后4d1×10^-6mol／LATRA组、作用后6d1×10^-7mol／LATRA组Cx43蛋白表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义（t=3．34,P〈0．叭;t=2．33,P〈0．05;t=3．12,P〈0．01）。逆转录PCR检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43 m     

柚皮素对ARPE-19和HUVEC细胞的抗氧化作用

目的：研究柚皮素对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的抗氧化作用。 方法：采用MTT的方法检测ARPE-19和HUVEC细胞的生存率及增殖率。 结果：3，10mg／L柚皮素能显著增加ARPE-19细胞的增殖率达10．8％和11．4％。10mg／L柚皮素能提高ARPE-19细胞在缺氧，0．3mmol／LNaN，及200μmol／L，H2O2条件下的生存率分别为55．2％，69．2％及50．3％。1mg／L柚皮素能提高ARPE-19细胞在50μmol／L t-BHP和30mg／LNaIO3条件下的生存率达20．2％和30．4％。30mg／L柚皮素能够促进ARPE-19细胞在50μmol／L t-BHP条件下的增殖率达32．2％，而1mg／L柚皮素可以提高30，100，300mg／LNaIO3处理的ARPE-19细胞的增殖率达30．3％，10．3％及18．5％。3，10及30mg／L柚皮素抑制HUVEC的增殖率分别为23．9％，70．4％及77．9％。1，3mg／L柚皮素能提高HUVEC细胞在缺氧条件下的生存率达10．7％和13．1％，以及提高在300mg／LNaIO3条件下的生存率达41．2％和37．7％。3mg／L柚皮素能提高HUVEC细胞在200，400μmol／L H2O2条件下的生存率达20．1％和21．5％． 结论：柚皮素能够促进ARPE-19细胞的增殖率，抑制HU-VEC生长，同时对这两种细胞均有抗氧化作用。因此，柚臾素是治疗老年黄斑变性的很有前景的候选药物。     

过氧化氢诱导的氧化应激对ARPE-19细胞中泛素化途径的激活

目的探讨H2O2诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19细胞中泛素及泛素化蛋白表达的影响。方法MTT法建立H2O2诱导ARPE-19细胞模型。不同浓度H2O2作用于ARPE-19细胞后,RT-PCR检测细胞内泛素基因转录水平,细胞免疫荧光方法检测细胞内泛素化蛋白的表达。用有（或无）蛋白酶体抑制剂MG-132预处理后再用H2O2处理ARPE-19,Western blot方法检测细胞内泛素化蛋白。结果氧化应激后UBA、UBB的转录水平明显增加（P〈0．05）,UBC无明显变化。细胞内相对分子质量为50000～250000的泛素化蛋白均增加,MG-132预处理后再用H2O2处理,细胞内增加的泛素化蛋白则多集中在相对分子质量75000以上。细胞内泛素化蛋白表达增加,核内增加明显。结论H2O2诱导的ARPE-19氧化应激过程激活细胞内泛素化途径。     

国产猪源纤维蛋白黏合剂玻璃体腔注射后对兔眼视网膜组织的生物安全性研究

背景 猪源纤维蛋白黏合剂已广泛应用于临床手术中,能够起到止血和闭合伤口的作用.目前眼科学者认为猪源纤维蛋白黏合剂在玻璃体切割术中可替代长效气体或硅油作为填充物,但国产猪源纤维蛋白黏合剂是否对视网膜有毒性作用仍在研究中. 目的 研究国产猪源纤维蛋白黏合剂在眼内应用后对视网膜组织的生物安全性. 方法 15只青紫兰兔任选一眼作为实验眼,对侧眼作为对照眼.兔眼行玻璃体切割术,实验眼术毕于玻璃体腔内注射猪源纤维蛋白胶0.5 ml,对照眼注射等量平衡盐溶液.术后1、3、7、15、30 d用裂隙灯及直接/间接检眼镜检查眼前后节的炎症反应,术后1、3、7d用Schi(o)tz眼压计测量眼压,分别于术前和术后30 d进行视网膜电图(ERG)检查,评估视网膜的功能变化,术后30 d行眼科B型超声检查.玻璃体腔内注射后第30天摘除眼球并制备视网膜切片,光学显微镜下检查视网膜的组织形态学变化,透射电子显微镜下观察视网膜的超微结构变化. 结果 实验组15只兔眼中出现并发症者7只眼,其中晶状体损伤后发生白内障者3只眼,术后增生性玻璃体病变和视网膜脱离者5只眼,眼内炎者1只眼.对照组15只兔眼晶状体损伤后发生白内障者2只眼,术中发生视网膜损伤者2只眼.眼内注射后30d实验组未出现并发症的8只眼及对照组的11只眼均未见明显的眼内炎症反应,术后眼压均正常,2个组间及手术前后各时间点间的眼压变化差异均无统计学意义(F分组=0.008,P=0.929;F时间=3.600,P=0.075).实验组及对照组间兔眼注药前后ERG a波、b波振幅的总体差异均无统计学意义(a波:F分组=0.728,P=0.405;b波:F分组=0.222,P=0.644);各组兔眼手术前后ERG a波、b波振幅的总体差异均无统计学意义(a波:F时间=0.516,P=0.482;b波:F时间=0.057,P=0.814).眼内注射后30 d,实验眼和对照眼视网膜组织层次清晰,无水肿及阳性细胞浸润,各层视网膜的细胞及视网膜光感受器、视网膜色素上皮的色素细胞形态均正常,亚细胞器结构清晰,细胞膜和核膜完整,线粒体嵴排列整齐. 结论 国产猪源纤维蛋白黏合剂玻璃体腔注射后对兔眼视网膜无毒性作用.