汉坦病毒76—118株与R22株基因重排的实验研究

目的；研究汉坦病毒汉滩型与汉城型之间能否发生基因重排，以及发生重排的频率和特点。方法：用汉坦病毒汉滩型（HTNV）76－118株与汉城型（SEOV）R22株混合感染Vero-E6细胞，空斑形成实验挑取子代克隆株24株，传供培养后用PCR方法鉴定。结果：发现24株子代病毒（70.83%)的基因组来自76－118株或R22株；1株（4.17%)HTNV型与SEOV型引物扩增均为阳性；1株（4.17%)两型病毒引物扩增均为阴性；4株（16.67%)发生了基因片段重排。结论：证实了汉坦病毒HTNV与SEOV之间可以发生重排。     

湖北省不同地区汉坦病毒的基因型研究

目的 对分离湖北省不同地区的30株汉坦病毒（HV）RNAM片段进行分析，以了解湖北省不同地区HV的基因特征及基因组功能。方法 参考HV的基因库软件设计M片段G1区型特异性引物，用适合于湖北省HV分型的逆转录－半巢式聚合酶链反应（RT－heminestedPCR），并结合限制性内切酶酶切图谱分析，对湖北省不同地区分离的30株HV进行分型、酶切。结果 分离于湖北省不同地区的30株HV的分型结果为汉淮型21株、汉城型9株。21株汉滩型靶基因被HimfⅠ、HaeⅢ消化的图形与标准株76／118株的图形一致，未见与H－114株相似的图形，其中武汉和洪湖各有1株靶基因HaeⅢ消化只见1个片段；应城、江夏、黄陂和麻城各有1株靶基因HinfⅠ消化有3个片段。另外21株汉滩型靶基因除前述的应城毒株外均被HincⅡ。9株汉城型靶基因不能被HaeⅢ消化；HinfⅠ区；汉城型M片段基因稳定，汉滩型M片段基因不稳定，且在北地区具有一定的地理聚族性。     

新流行期汉城型汉坦病毒全S及部分L与M基因核苷酸序列测定及研究

目的：为获得SED型病毒基因组更为详尽的资料,也为局部爆发的原因提供科学的资料。方法：病毒分离、McAbs分型RT－PCR扩增及核苷酸序列测定。结果:首次测出我国SEO型病毒较为完整的S片段及部分L片段和M片段并与76－118、Seoul、SR11（在全S片段）;76－118、C4、L99、Seoul（在L片段）;10A、A9、C1－1、JB3、L99、SD227、SD70、SED（M片段）株核苷酸同源性进行比较,分别为64．2％、91．89％、96．8％及70．8％、72．0％、95．3％、95．9％及97．3％、63．0％、66．0％、93．0％、94．3％、96．3％、97．3％、94．7出的氨基酸同源性分别为：80．5％、95．4％、97．36％、及75．6％、75．1％、97．7％、97．36％及96．0％、78．8％、79．8％、94．9％、98．0％、97．0％、98．0、97．0％。结论：①不存在病毒基因组间的重排,即基因重排不是造成此次HFRS流行的原因。②SEO型病毒表现出明显的地理聚集现象。③选用与本地区流行的汉坦病毒型别相同的疫苗是行之有效的防止措施。     

用PCR和限制性酶分析快速鉴别汉坦病毒和汉城病毒

汉坦病毒76-118株和汉城病毒SR-11株的短小RNA S片段序列已被确定。通过比较核苷酸序列,作者选择出能扩增这两种病毒株同样大小DNA片段的两套引物序列,并试图用这两株病毒的两套共同引物以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和套式PCR以及PCR产物的限制性酶分析来鉴别汉坦病毒和汉城病毒。     

汉坦病毒四川分离株S85-46 的遗传学特征

目的：了解汉坦病毒四川分离株S85－46株分子流行病学特征。方法：将特异性引物从S85－46病毒感染细胞PCR扩增的产物克隆于T载体,正确的克隆纯化后测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果：S85－46株M片段与HTN型毒株同源性为84．1％－99．7％,而与SEO型毒株同源率仅为70．4％－70．9％,表明S85－46毒株属HTN型。核苷酸同源性比较显示,S85－46与韩国分离的76－118株高度同源,而与国内一些HTN型病毒差异较大。而且同一地区的毒株也以差异很大。S片段全基因序列同源性比较也支持以上的观点。结论：不同地区汉坦病毒的流行株基因序列可以高度同源。     

汉滩型汉坦病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法建立

目的建立一种针对汉滩型汉坦病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,以实现汉坦病毒的快速、高效检测。方法针对汉坦病毒汉滩型S片段的保守区,设计合成4条特异性引物,建立汉滩型汉坦病毒LAMP检测方法。结果该方法能够有效检测汉坦病毒标准质粒,并且该套引物具有良好的特异性,检测灵敏度达到10个基因拷贝,应用建立的LAMP检测方法能够有效检测血液样本中的汉滩型汉坦病毒。结论建立的LAMP方法具有高度灵敏性及特异性,是一种高效快速的检测汉滩型汉坦病毒的基因检测方法 。     

一株自褐家鼠分离的汉坦病毒SD10株分子生物学特征研究

[目的]测定从山东省滕州市褐家鼠分离的1株汉坦病毒SD10株的分子生物学特征,以了解山东省肾综合征出血热疫区的汉坦病毒型别。[方法]用RT－PCR扩增技术及核苷酸序列测定方法进行分子生物学分型,并与其他相关毒株比较。[结果]经M片段部分序列分析表明,该毒株为汉坦病毒汉城型（SEO）第3亚型（S3）。与已知不同年代分离的SEO型毒株有较高同源性。[结论]山东省家鼠型疫区毒株稳定。     

云南省褐家鼠与黄胸鼠中汉坦病毒的流行病学研究

目的 研究云南省褐家鼠、黄胸鼠中汉坦病毒的感染情况及其型别，以明确基因亚型及其地理分布，为该地区肾综合征出血热（HFRS）的预防控制提供科学依据。方法 捕捉鼠类取鼠肺，冷冻切片后以间接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原，从阳性鼠肺标本中提取病毒RNA，利用RT—PCR扩增汉坦病毒S和M基因部分片段并测序分型，构建系统发生树进行系统发生分析。结果 共捕获褐家鼠和黄胸鼠307只，检测到阳性样品14份，阳性检出率为4．56％。分析部分S片段（600～999nt）与M片段G1区（140～640nt）、G2区（2003～2302nt）的核苷酸序列，及用部分S及G2核苷酸序列构建的系统发生树，将来自云南省8个地区的汉城病毒分为2个亚型：S1和S3亚型。结论 云南省主要为家鼠型HFRS疫区，汉城病毒有2个亚型，地理分布较广。     

驻石某部肾综合征出血热流行病学调查

目的探讨某部肾综合征出血热（HFRS）的流行状况、啮齿动物间汉坦病毒（HV）感染特点及HV基因型，为HFRS的预防控制提供科学依据。方法夹夜法捕鼠，计算鼠密度，确定鼠种构成。针对HV基因M片段部分序列设计2种型特异性引物，应用RT-PCR法检测宿主动物带病毒情况。结果共捕获宿主动物14只，血清抗体阳性率为21．43％。RT-PCR扩增检测出阳性标本1份，为褐家鼠。分型为汉城型阳性标本。密切接触人群血清抗体阳性率为3．64％。结论该地区存在汉城型HV感染，提示应加强疫情监测，防止疫情的扩大蔓延。     

浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒的分子流行病学研究

目的 研究浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒(HV)流行情况及病毒型别,为该地区肾综合征出血热(HFRS)的预防控制提供科学依据.方法 采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原;用RT-PCR法扩增阳性样品中HV的部分S片段及部分M片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果在温州市HFRS疫区共捕获啮齿动物96只,在6份鼠肺样品中检测到HV抗原,其中4只褐家鼠,1只黄胸鼠与1只黄毛鼠,病毒携带率为6.3%.用汉城病毒(SEOV)特异引物从其中5份HV抗原阳性样品中扩增出部分S片段(620～999nt)及部分M片段(2001～2301nt)并测定序列.对扩增出的部分S及M片段的核苷酸序列分析发现,5株病毒与现有的SEOV有高同源性,均为汉城型HV.但在用部分S片段及部分M片段核苷酸序列所构建的系统进化树上,5株病毒的聚集模式不同.结论温州市的褐家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠均携带汉城型HV,并可能发生基因片段的重排.     

江西省1株汉滩型汉坦病毒的分离与鉴定

目的 了解江西省啮齿动物携带的肾综合征出血热汉坦病毒的基因型别。方法 采用Vero-E6细胞对8份免疫荧光汉坦病毒抗原阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对培养物进行鉴定,对分离株部分M基因进行序列测定和分析。结果 1份标本培养后经直接免疫荧光试验检测到汉坦病毒特异性免疫荧光颗粒,培养物能在Vero-E6细胞中稳定传代,毒株命名为AYW89-15。毒株核酸经汉坦病毒M基因特异性分型引物进行RT-PCR检测,获得汉滩型汉坦病毒(Hantaan virus, HTNV)预期大小的目的片段;通过序列分析发现,分离株与HTNV参考株核苷酸同源性为83.1%～94.7%,氨基酸同源性为95.0%～99.0%,与汉城型等其他型别汉坦病毒核苷酸和氨基酸同源性均低于75%。进化树分析表明AYW89-15位于HTNV所在的枝系。 结论 新分离株AYW89-15为HTNV。     

保定地区肾综合征出血热病人血清PCR分型及核苷酸序列测定

为明确保定肾综合征出血热(HFRS)疫区的型别,采用RT-PCR方法,检测急性期HFRS病人血清的汉坦病毒(HV)RNA,并进行分型及部分核苷酸序列的测定,并与国内外HV的代表株进行比较。结果31份急性期病人血清经RT-PCR分型,24份为汉城型(SEO型),2份为汉滩型(HTN型),并测得SEO型C3株M基因(位于1985—2314位),HTN型LBY株M基因(位于1996—2314位)核苷酸序列与国内外代表株的核苷酸和氨基酸序列相比较C3与76-118、A9、LBY核苷酸同源性分别为68.79％、67.58％、68.03％;氨基酸同源性分别为77.27％、77.27％、78.3％。C3与Seoul、R22相比,核苷酸同源性分别为95.15％、93.94％;氨基酸均为97.27％。LBY与76-118、A9、Seoul、R22核苷酸同源性分别为98.75％、87.15％、68.24％、68.03％;氨基酸同源性分别为100％、96.23％、78.3％、78.3％。首次发现与韩国76-118株同型(HTN型)HV在保定的存在,明确保定疫区为以家鼠型为主的混合型出血热疫区。     

Use of reassortant viruses to map attenuating and temperature-sensitive mutations of the Rift Valley fever virus MP-12 vaccine

A live-attenuated vaccine for Rift Valley fever virus (RVFV), MP-12, has been developed recently by undirected, serial mutagenesis of a RVFV strain (ZH548) isolated during the 1977 epidemic in Egypt. In the present study, the mutations responsible for attenuation of this virus have been examined by analysis of reassortant viruses generated between the vaccine strain and a wild RVFV strain isolated in Senegal. Reassortant viruses were generated efficiently in multiply infected Vero cells, and were readily isolated without application of selective pressures. The origin of the S and M genomic RNA segments in each cloned reassortant virus was determined with monoclonal antibodies capable of differentiating the nucleocapsid protein (S segment marker) or G1 glycoprotein (M segment marker) of the parental strains. The L segment of the vaccine strain was found to contain a temperature-sensitive (ts) mutation, and the origin of the L segment in most reassortants could be inferred by analysis of their ts phenotype. Analysis of the virulence properties of selected reassortant viruses in mice demonstrated that virulence characteristics were under polygenic control, and that at least one mutation capable of independently attenuating the virus existed on each genome segment. The L and M RNA segments were also found to contain ts mutations. These findings suggest that reversion to virulence is unlikely, and further indicate that genetic reassortment with wild-type viruses during a vaccination programme in endemic areas would also be expected to yield attenuated variants.     

Emergence of multireassortant bluetongue virus serotype 4 in Hungary

The genome sequence and the phylogenetic relationships of a serotype 4 bluetongue virus (BTV-4) emerged during 2014 in Hungary are described in this study. Genome segment 2 encoding the major neutralization antigen, VP2, shared moderate sequence similarity (nt, ⩽94.3%) with the corresponding gene of contemporary and historic homotypic bluetongue viruses, whereas genome segments S1, S4, S5, S7–S10 were typically more closely related to the cognate genes of heterotypic isolates. Importantly, in many gene phylogenies the Hungarian BTV-4 strain showed genetic relationship to BTV strains identified in outbreaks in the western Mediterranean basin. Our results indicate the identified Hungarian bluetongue virus strain evolved through reassortment involving multiple genome segments from various heterotypic bluetongue viruses.     

保定地区肾综合征出血热病人血清PCR分型及核苷酸序列测定

「目的」明确保定肾综合征出血热疫区型别。「方法」采用ＲＴ－ＰＣＲ法检测急性期肾综合征出血热病人血清汉垣病毒ＲＮＡ,并进行分型及部分核苷酸序列测定和与国内外汉垣病毒的代表析进行比较。「结果」３１份急性期病人血清经分型,２４份为家鼠型（ＳＥＯ）型,２份为野鼠型（ＴＨＮ）型,测得ＳＥＯ型Ｃ３株Ｍ基因（１９８５到２３１４位）,ＨＴＮ型ＬＢＹ株Ｍ基因（１９９６到２３１４位）核苷酸序列与国内外代表株比较：Ｃ３     

辽宁省汉滩型汉坦病毒基因特征及分布研究

目的探讨辽宁省汉滩型汉坦病毒(HTNV)的基因特征及其分布情况。方法在辽宁省肾综合征出血热(HFRS)主要流行地区收集鼠肺和HFRS患者标本,采用间接免疫荧光法检测鼠肺中HV抗原,以RTPCR方法扩增标本中M和S基因片段的特异性核苷酸序列,将HTNV的阳性产物测序,并进行同源性比对和系统发生分析。结果辽宁省HFRS疫区HTNV主要为黑线姬鼠所携带;从鼠肺标本中扩增出M片段4份,患者标本中扩增出M片段5份,S片段1份;M片段的核苷酸同源性分析表明,辽宁株与Bao14、CJAp267等株同源性最高,为95%～97%,与HTNV原型株76-118同源性为87.4%～89.0%;系统发生分析显示辽宁株均分布于同一支内,与Bao14、CJAp267等株构成一个独立的支系,同属于H4亚型;TL2S基因片段与YaluRiver13核苷酸同源性最高(97.1%),与HTNV原型株76-118同源性为91.2%;推导的S片段氨基酸同源性,TL2与Bao14、CJAp93同源性较高,为93.0%～96.2%,与其他代表株同源性多在74.1%～81.6%;而且基于S片段的系统发生分析提示与M片段的分型结果基本一致,与Bao14、CJAp93等株位于同一分支内,为H4亚型。结论目前辽宁省流行的HTNV主要为H4基因亚型,基因亚型的分布相对比较单一。     

中国大林姬鼠携带Amur类汉坦病毒及其分子生物学特征分析

目的 确定中国大林姬鼠是否存在Amur类汉坦病毒及其分子生物学特征。方法 应用RT-PCR法扩增大林姬鼠肺组织中汉坦病毒M基因片段和S基因全长,目的片段经测定其核苷酸序列后,用DNASTAR软件进行同源性比对和系统发育分析。结果 从东北大林姬鼠肺标本JilinAP06中分别扩增出长度383 bp（M基因）和1696 bp（S基因）大小的目的eDNA片段,其S基因全长由1696个核苷酸组成,完整的开放阅读框从37位核苷酸至1323位核苷酸,共1287个核苷酸,编码429个氨基酸的蛋白。JilinAP06 S基因与1378、Liu株同源性最高,与H5株同源性次之,与AP63、AP61和AP1371同源性为91．0%～91．7%,与76．118同源性为81．0%。S全序列基因推导的氨基酸序列与其他汉坦病毒已知序列比较显示：JilinAP06与AP1371同源性最高（98．4%）,与AP61同源性为98．1%,与AP63和Liu、B78和H5株同源性为97．2%～97．9%,与76-118同源性为95．1%。系统发育分析结果显示：JilinAP06与Amur类汉坦病毒构成一个相对独立的分支。M基因片段同源性比较和系统发育分分析结果与基于S基因全长得到的结果一致.结论 中国大林姬鼠存在Amur类病毒，大林姬鼠很可能为Amur类病毒的自然宿主和人群Amur类病毒感染的重要来源。     

河北省2株汉城病毒的遗传特征分析

目的 对河北省2株汉城病毒(SEOV)进行基因分型及系统进化分析.方法 用RT-PCR法扩增SEOV Li株和LF18株的S与M全基因片段;利用DNAStar软件分析S与M基因片段核苷酸序列同源性;利用Phylip软件构建系统进化树.结果 Li株与LFl8株的全S基因片段均由1772个核苷酸组成,开放阅读框(ORF)的位置均为43～1332核苷酸,编码429个氨基酸的核蛋白.2株病毒的M片段全基因序列均由3653个核苷酸组成,ORF的位置均为49～3450核苷酸,编码1133个氨基酸的糖蛋白前体.2株病毒的糖蛋白前体有62个半胱氨酸残基以及6个糖基化位点.2株病毒的全S、M基因片段的核苷酸序列与包括疫苗株L99、Gou3、Z37在内的已知SEOV的同源性分别为87.6%～99.2%和83.6%～97.3%.全S和全M基因片段构建的系统进化树显示2株病毒均为SEOV第Ⅲ亚型.结论 Li株和LF18株都属于SEOV,为SEOV的第Ⅲ亚型.河北省汉坦病毒的流行毒株的遗传特征与疫苗株Z37相似.     

汉坦病毒单克隆抗体的制备和鉴定

本文用汉坦病毒A16和R22株活毒免疫BALB／c小鼠，取牌细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合，制备了6株分泌抗汉坦病毒单克隆抗体的杂交癌细胞系。单克隆抗体IgG亚类鉴定表明，其中2株为IgG1，1株为IgG2b，3株为IgG2a。用间接免疫荧光检测单抗腹水滴度，分别在1：10240～1：81920之间；用反向被动血凝抑制试验测定单抗腹水，滴度均低于1：20。免疫印迹试验表明，6株单克隆抗体均为抗核蛋白单抗。对已知型别病毒的反应话表明，其中3株为组特异性单抗，1株为汉滩型特异性单抗，2株为汉城型特异性单抗。还用6株单抗对宁夏新分离毒株进行抗原性分析。