免疫活性细胞非神经乙酰胆碱系统的研究进展

免疫活性细胞表达胆碱乙酰转移酶(ChAT)、乙酰胆碱合成酶(AChE)、毒蕈碱和烟碱型乙酰胆碱受体(mAChR/nAChR),刺激免疫活性细胞上mAChR和nAChR,免疫细胞可以产生各种生化和功能的变化。活化免疫细胞,可以通过上调ChAT的表达,增加ACh的合成,而上调ChAT的表达。免疫细胞的免疫功能和淋巴细胞胆碱能活性密切相关。免疫细胞(如T细胞、B细胞、单核细胞)表达所有5种亚型的毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR M1~M5),同时表达不同亚型的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR),如α3、α5、α7、α9和α10。用卵白蛋白(OVA)免疫敲除M1和M5基因小鼠,上调脾脏单核细胞的TNF-α、IFN-γ和IL-6产生。导致血清抗OVA特异性IgG1增加。而敲除α7基因小鼠,α7烟碱受体下调促炎因子,减少抗OVA特异性IgG1的产生。免疫活性细胞,通过mAChR和nAChR调节细胞因子及抗体的产生。非神经胆碱能系统(NNCS)参与调节免疫细胞功能,二者相互影响。     

rL-RVG通过α7烟碱型乙酰胆碱受体诱导胃癌细胞系SGC凋亡的机制

目的探讨表达狂犬病毒疫苗糖蛋白的重组新城疫病毒(rL-RVG)通过乙酰胆碱受体诱导胃癌细胞凋亡的可能机制。方法将对数增殖期的胃癌细胞系SGC随机分成rL-RVG、新城疫病毒(NDV)组、PBS组,并同时分别设α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)抑制剂(MLA)及激动剂(ACB)预处理组。病毒感染24 h后,CCK8法测定病毒对SGC增殖影响;蛋白印迹检测α7-nAChR、RVG、NDV;凋亡蛋白cleved-caspase-3、BAX/BCL-2;P-ERK、ERK的表达。免疫荧光法测定P-ERK表达。结果随着rL-RVG、NDV病毒液浓度增加,胃癌细胞活力下降,rL-RVG在10~(-2)稀释倍数时抗增殖作用显著(P0.05);病毒组凋亡相关蛋白cleved-caspase-3、BAX/BCL-2相对表达量较PBS组明显升高,且rL-RVG组较NDV组及PBS组升高明显,乙酰胆碱受体抑制剂预处理后rL-RVG组、NDV组及PBS组凋亡蛋白水平明显增高,胆碱受体激动剂预处理组凋亡蛋白表达水平明显下降(P0.05);P-ERK在病毒组表达下降,且rL-RVG组较NDV组更低,乙酰胆碱受体抑制剂、激动剂预处理后分别下降、上升(P0.05)。结论rL-RVG通过α7-nAChR诱导胃癌细胞系SGC凋亡的机制之一是抑制ERK通路。     

大白鼠伏隔核乙酰胆碱酯酶阳性纤维的脑干起源

本文报道应用荧光逆行标记和乙酰胆碱酯酶组织化学相结合技术,研究了大白鼠伏隔核乙酰胆碱酯酶阳性纤维的脑干起源。向一侧伏隔核注入荧光示踪剂二盐酸4′,6-双脒基-2-苯吲哚(DAPI)或樱草黄(Pr)。处死前6～8小时肌注二异丙基氟磷酸(DFP)。用含10％福尔马林的磷缓液灌流,连续冠状冰冻切片,Karnovsky-Roots法孵育,荧光显微镜和普通光学显微镜观察同一切片。结果发现,下列核(区)内可见到胞体既受DAPI或Pr逆行标记,同时又呈AChE阳性反应的细胞(简称荧酶双阳性细胞):中脑被盖腹侧区、黑质、中脑尾侧中缝核、脚桥被盖核;脑桥中缝背核、中央上核、被盖网状核、蓝斑;延髓孤束核区、中缝苍白核、延髓网状结构包括旁正中网状核、中央网状核腹侧亚核和外侧网状核。     

慢性房颤患者心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道的研究

目的： 研究慢性房颤时乙酰胆碱敏感钾通道电流及其基因表达的变化，探讨该离子通道变化在房颤发生与发展中的作用。 方法： 膜片钳全细胞技术记录风湿性心脏病慢性房颤患者和窦性心律患者心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道电流，分析两组的电流密度-电压关系曲线；半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道基因(Kir3.4)mRNA表达的变化。 结果： （1）与窦性心律组比较，在测试电位-80 mV--120 mV时，慢性房颤组心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道电流密度明显减小。其中测试电位为 -100 mV 时，慢性房颤组电流密度为(-11.665±1.027)pA/pF(n=11)，窦性心律组为(-19.486±0.766) pA/pF(n=11) (P<0.01)。（2）慢性房颤组心房肌细胞Kir3.4 mRNA表达低于窦性心律组54.3%，为0.523±0.301(n=11) vs 0.239±0.102 (n=11), P＜0.01。 结论： 慢性房颤时乙酰胆碱敏感钾通道电流密度的改变与乙酰胆碱敏感钾通道基因表达下调呈正相关，该通道的改变可能与房颤的发生和发展有关。     

横纹肌肉瘤胚胎型骨骼肌乙酰胆碱受体γ亚基mRNA表达的临床诊断价值

目的探讨胚胎型骨骼肌乙酰胆碱受体γ亚基(AChR-7)mRNA的表达在横纹肌肉瘤病理诊断中的价值。方法运用双重逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)在17例石蜡包埋横纹肌肉瘤[胚胎型(ERMS)9例,腺泡型(ARMS)6例,多形型(PRMS)2例]、20例非横纹肌源性肿瘤(低分化滑膜肉瘤6例,尤文／原始神经外胚层肿瘤6例,淋巴瘤6例,神经母细胞瘤2例)和3例正常肌肉中同时检测AChR-γ和α亚基(AChR-α)mRNA的表达并比较两者比值。结果17例横纹肌肉瘤均表达AChR-α和AChR-γ,且两者表达量的比值即AChR-α/AChR-α≥1,20例非横纹肌源性小圆细胞肿瘤无AChR-1的表达,1例正常肌肉AChR-α/AChR-α＜1。结论检测AChR-γmRNA的表达有助于横纹肌肉瘤的诊断和鉴别诊断。     

α3β2与α3β4烟碱型乙酰胆碱受体α和β亚基不同配比的药理活性研究

目的:比较α和β亚基不同配比形成α3β2和α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)敏感性的差异。方法:体外转录获得α和β亚基的cRNA,采用显微注射将3种不同配比(α∶β分别为1∶10、1∶1和10∶1)的cRNA注入非洲爪蟾卵母细胞,利用双电极电压钳检测受体表达情况。利用激动剂乙酰胆碱(ACh)和拮抗剂α-芋螺毒素Reg IIA(α-CTx Reg IIA)检测在3种配比条件下形成受体药理活性的差异。结果:对于α3β2 nAChR亚型,在3种配比情况下,ACh的半数有效浓度(EC50)分别为91.2μmol/L、104.4μmol/L和130.6μmol/L,α-CTx Reg IIA的半数抑制浓度(IC50)分别为40.2 nmol/L、36.4 nmol/L和42.3 nmol/L。对于α3β4 nAChR亚型,在3种配比情况下,ACh的EC50分别为44.0μmol/L、110.0μmol/L和230.0μmol/L,α-CTx Reg IIA的IC50分别为226.8 nmol/L、71.5 nmol/L和49.4 nmol/L。结论:α3和β4亚基比例的改变会导致α3β4 nAChR结构和药理活性的改变。α3和β2亚基比例的改变对α3β2 nAChR结构和活性没有影响。     

AChRα亚基基因片段联合IL-6DNA免疫大鼠建立实验性重症肌无力模型

目的:探索用DNA免疫方法:建立实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)动物模型的可行性。方法:将含人乙酰胆碱受体α亚基N端主要免疫区205个氨基酸(AChRα205)的编码基因、含大鼠IL-6cDNA序列的基因分别亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建pcDNA3.1(+)/AChRα205、pcDNA3.1(+)/IL-6两种重组质粒。以pcDNA3.1(+)免疫对照组Lewis大鼠,pcDNA3.1(+)/AChRα205和pcDNA3.1(+)/AChRα205加pcDNA3.1(+)/IL-6分别免疫两个实验组大鼠。从临床症状、肌电图、血清抗AChR抗体、组织病理与超微结构、组织基因整合和RNA转录几方面进行检测与评估。结果:实验组动物出现了临床肌无力症状;重复神经电刺激呈衰减反应;血清抗AChR抗体滴度增高;组织学与超微结构检查呈退行性改变;这些变化在双质粒共注射组更明显。两实验组大鼠均有目的:基因的整合与转录。结论:用重组质粒pcDNA3.1(+)/AChRα205、pcDNA3.1(+)/IL-6免疫Lewis大鼠建立了EAMG模型,方法:简便实用。     

α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂抑制骨水泥微粒刺激小鼠外周血单核细胞分泌炎性因子

目的探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7n AChR)激动剂PNU282987对骨水泥微粒刺激小鼠外周血单核细胞分泌炎性反应因子的影响及其分子机制。方法分离培养小鼠外周血单核细胞,使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微粒刺激后,ELISA检测培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量;RT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达;Western blot检测p-p65、p65、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3及β-actin的表达;ELISA检测NF-κB DNA结合活力。结果单核细胞经PMMA微粒刺激后,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显增高(P0.05);细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达明显增高(P0.05);p65、JAK2和STAT3磷酸化明显增强(P0.05);NF-κB DNA结合活力明显增高(P0.05)。不同浓度PNU282987作用后,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量呈浓度依耐性下降(P0.05);细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达呈浓度依耐性下降(P0.05);总p65、JAK2和STAT3的表达不变;p-p65、p-JAK2和p-STAT3的表达呈浓度依耐性下降(P0.05);NF-κB DNA结合活力也呈浓度依耐性下降(P0.05)。结论α7n AChR激动剂PNU282987能显著抑制PMMA骨水泥微粒所诱导的小鼠血单核细胞炎性反应因子的分泌。     

烟碱型乙酰胆碱受体α3和/或α5型在大鼠脑垂体中的表达:荧光双标免疫组织化学研究

为了探讨在大鼠脑垂体中,包含α3和 /或α5亚单位的烟碱型乙酰胆碱受体(N -AChR)是否存在,我们运用免疫荧光双标记技术对成年雄性大鼠脑垂体进行了研究。结果显示:N -AChR的α3和 /或α5亚单位样免疫反应阳性物质局限性地分布在神经垂体的催产素能神经纤维上,并一直延续到神经垂体的尾侧末端。     

CXCL12通过PI3K/AKT信号通路对大鼠海马培养细胞乙酰胆碱分泌的影响

目的:观察CXCL12通过PI3K/AKT信号通路对体外培养的海马神经细胞乙酰胆碱合成和分泌的影响。方法:通过Western Blot方法观察CXCL12对培养的海马神经元PI3K/AKT信号通路和胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达量的影响;ELISA方法分别检测CXCL12对海马神经细胞乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性和乙酰胆碱分泌的影响,以及PI3K/AKT阻断剂(LY2940002)阻断海马培养神经元PI3K/AKT信号通路后乙酰胆碱的分泌和AChE活性的变化。结果:在海马神经细胞体外培养过程中,采用50 ng/ml的CXCL12作用于海马神经细胞后,AKT磷酸化水平升高,ChAT蛋白表达增多,AChE活性减少。随着培养时间的延长(1,3,5,7 d),乙酰胆碱的分泌逐渐增加;通过LY2940002阻断PI3K/AKT信号通路,AKT磷酸化水平降低,ChAT蛋白表达减少,AChE活性增加,乙酰胆碱分泌减少。结论:CXCL12可能通过PI3K/AKT信号通路引起乙酰胆碱合成和分泌增加,表明CX-CL12可以作为一种重要的神经生长因子刺激乙酰胆碱的合成和分泌。     

条件性免疫反应对大鼠胶原性关节炎的作用机制研究

目的:在已证明条件免疫反应(CIR)能够有效治疗大鼠胶原性关节炎(CIA)的前期研究基础上,进一步探讨其对大鼠CIA的作用机制。方法:建立大鼠CIA模型。将模型大鼠分为5组:CIR组,以樟脑气味为条件刺激,甲氨喋呤(MTX) +泼尼松(Pred)为非条件刺激,两者结合7次( 7天)后可建立条件免疫反应,然后每日再现条件刺激,条件刺激与非条件刺激每周结合1次,共4周;MTX +Pred组,MTX +Pred治疗4周;MTX +Pred减量组,MTX +Pred治疗7天内每天1次,7天后每周1次,共4周;单纯闻樟脑气味组,单纯闻樟脑气味4周;空白对照组,安慰剂治疗4周。用流式细胞技术检测大鼠外周血CD4 +T淋巴细胞活化(表达CD71)及表达烟碱样乙酰胆碱受体α7亚单位(nAChRα7)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的状态;免疫组织化学检测nAChRα7、ChAT、CD6 8(巨噬细胞标志)和TNFα在关节滑膜细胞的表达。结果:治疗1周后CIR组大鼠外周血CD4 +T淋巴细胞表达nAChRα7和ChAT明显高于其他各组(P <0 0 1) ;CIR组与MTX +Pred组大鼠,2周后外周血活化的CD4 +T淋巴细胞(表达CD71)明显减少(P <0 0 1) ,3周后大鼠关节炎指数明显低于其他各组(P <0 0 1) ;4周后滑膜组织表达CD6 8及TNFα明显降低(P <0 0 5 ) ;CIR组大鼠表达nAChRα7和ChAT明显高于其他各组(P <0 0 1)。结论:以樟脑气味为     

葡萄糖氧化酶诱导的氧化应激抑制α4β2烟碱型乙酰胆碱受体电流

目的探究葡萄糖氧化酶(GO)引起的氧化应激对α4β2烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)电流的影响。方法在HEK293T细胞共转染α4和β2质粒48 h后进行实验。分为对照组(control组)、3.5 k U/L的GO处理组(GO组)、3.5 k U/L的GO与450 k U/L的过氧化氢酶(CAT)共处理组(CAT组)。使用DCFH-DA荧光探针以及激光共聚焦显微镜来检测活性氧(ROS)的产生;采用全细胞膜片钳检测α4β2 nAChR的电流变化,给予1、10和30μmol/L ACh检测受体功能,给予10μmol/L ACh检测电流变化。结果全细胞膜片钳记录到呈ACh剂量依赖性的电流;GO处理HEK293T细胞1 h后可显著地增强细胞活性氧的水平(P0.001);对照组电流在10次给药中均保持稳定,GO组的电流在连续10次的ACh给药下逐渐降低(P0.01);CAT组反转GO引起的α4β2 nAChR电流下降(P0.01)。结论GO引起的氧化应激状态导致α4β2 nAChR电流逐渐下降,α4β2 nAChR电流的下降与ROS的增多密切相关。     

淡色库蚊不敏感乙酰胆碱酯酶与抗药性关系的研究

经过选育的淡色库蚊抗敌敌畏(Rd)、抗残杀威(Rp)、抗氯氰菊酯(Rc)品系及其降解品系(Rd降解、Rp降解、Rc降解)的抗性水平分别为敏感(S)淡色库蚊品系的12.17倍、11.21倍、534.31倍、6.10倍、8.38倍、83.26倍,不敏感乙酰胆碱酯酶蚊虫个体频率分别为49.47%、73.47%、4.76%、17.71%、42.86%、3.57%,S淡色库蚊品系不敏感乙酰胆碱酯酶个体频率为4.65%.表明淡色库蚊对敌敌畏和残杀威的抗性伴随着不敏感乙酰胆碱酯酶蚊虫个体频率的改变,而对氯氰菊酯的抗性不伴随着不敏感乙酰胆碱酯酶蚊虫个体频率的改变.     

MicroRNA-132通过调控胆碱能通路减轻肺泡巨噬细胞炎症反应

 目的: 探讨microRNA-132(miR-132)通过调控胆碱能通路减轻肺泡巨噬细胞炎症反应的作用机制。方法: 向大鼠肺泡巨噬细胞NR8383中转染miR-132 mimic、mimic阴性对照(NC)、miR-132 inhibitor或inhibitor NC,转染后用脂多糖(LPS)和(或)乙酰胆碱(ACh)处理细胞;采用real-time PCR检测乙酰胆碱酯酶(AChE)的mRNA表达;采用Western blot检测细胞中AChE、信号转导及转录激活因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3),以及细胞浆和细胞核中核因子κB(NF-κB)蛋白的改变;采用AChE活性测试盒检测细胞上清液中AChE活性的改变;采用免疫荧光检测NF-κB的核移位变化。结果: 上调或下调miR-132不影响AChE的mRNA相对表达水平;上调miR-132可使AChE蛋白及活性的水平均显著降低(P < 0.05),下调miR-132可使AChE蛋白及活性的水平均显著升高(P < 0.05)。当给予LPS+ACh作用时,miR-132 mimic组对NF-κB p65核移位的抑制作用较mimic NC组更强(P < 0.05),miR-132 inhibitor组较inhibitor NC组更弱(P < 0.05);miR-132 mimic组对STAT3及p-STAT3蛋白的抑制作用较mimic NC组更强(P < 0.05)。结论: miR-132通过调控胆碱能通路减轻肺泡巨噬细胞炎症反应的作用机制可能是miR-132靶向作用AChE,抑制AChE对ACh的水解作用,从而增强ACh的抗炎作用,抑制NF-κB及STAT3的活化。     

蒙古种沙土鼠背海马胆碱能神经局部分布

目的 :对蒙古种沙土鼠背海马乙酰胆碱酯酶阳性纤维和末梢的局部分布作分区分层的研究。方法 :应用乙酰胆碱酯酶纤维染色法及计算机图像扫描和统计学分析等方法。结果 :背海马局部乙酰胆碱酯酶纤维和末梢的分布按密度从大到小排列为 :CA2、CA3区辐射层 >CA4区 (齿状回门区 ) >齿状回多形层 >齿状回下支分子层 >齿状回上支分子层、背海马分子层 >CA1、CA2、CA3区多形层。结论 :实验结果为蒙古种沙土鼠背海马胆碱能投射的定位分布的进一步研究提供了一定的形态学基础     

大鼠舌乳头神经结构的乙酰胆碱受体亚型配布

目的:探索味觉的传递机制是否系味蕾细胞所接受的信息直接通过神经递质受体作用于舌乳头的感觉神经来完成。方法:免疫组化SABC技术对大鼠舌粘膜各部位各种乳头内神经结构上乙酰胆碱受体(AchR)的8种亚型(VR1、α2、α3、α4A、α4H、α7、β1及β2)的分布进行观察。结果:除丝状乳头外,其他3种乳头的支配神经束及纤维分支不同程度地分布有AchR的各亚型受体。阳性反应的AchR自乳头中轴上的神经束(干)起,并沿其分支分布,在临近味蕾前即中止,未见受体阳性的神经纤维终末到达味蕾细胞。结论:味觉感受的传递机制并非由AchR阳性感觉神经纤维直接从味蕾细胞“接力”上行。     

异种AchR检测抗AchR抗体的评价

<正> 自重症肌无力病人血清中发现抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体以来,检测病人血清中抗AchR抗体已成为诊断此病的重要手段。常用的检测抗原为去神经化的哺乳动物骨骼肌或人骨骼肌提取的乙酰胆碱受体粗制品,其中以人源AchR应用最多,结果较理想。然而,提取人源AchR抗原有许多不便和     

可乐定通过激活胆碱能抗炎通路抑制肺损伤小鼠炎性反应

目的:探讨可乐定对肺损伤小鼠炎性反应的影响及其作用机制。方法:以脂多糖(lipopolysac charide,LPS)诱导的肺损伤小鼠为模型,静脉注射可乐定,取左肺上叶组织,检测肺湿干重比(W/D)和总肺含水量(TLW),ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,RT-PCR和Western blot检测α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的变化;鼻内吸入法将α7nAChR基因RNA干扰慢病毒载体导入肺损伤模型小鼠肺内,或者静脉注射HMGB1外源性蛋白,检测炎性因子和HMGB1的变化。结果:可乐定可减轻LPS诱导的小鼠肺损伤,并通过降低细胞因子IL-6、IL-10和TNF-α水平从而抑制LPS诱导的炎性反应;可乐定促进α7nAChR表达从而激活胆碱能抗炎通路,并抑制HMGB1的表达。结论:可乐定对肺损伤小鼠具有抗炎作用,这可能与激活胆碱能抗炎通路,抑制HMGB1的表达有关。     

严重多发伤并急性胃肠损伤家兔的肠道黏膜损伤严重程度及α7烟碱型乙酰胆碱受体的变化北大核心CSCD

目的:探究严重多发伤并急性胃肠损伤(AGI)家兔的肠道黏膜损伤严重程度及α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的变化。方法:使用自制重力小型牵引式对(侧)撞机来模拟交通意外致伤以构建严重多发伤家兔模型;创伤严重程度评分(ISS)评估家兔创伤程度;AGI评分评估家兔AGI程度;ELISA法检测血浆二胺氧化酶(DAO)、内毒素及血清TNF-α含量;高压液相色谱法检测尿液乳果糖(L)、甘露醇(M)含量,并计算L/M;平板计数法检测家兔肠道细菌移位情况;HE染色及透射电镜分别观察小肠组织病理变化及超微结构损伤情况;免疫组化法及Western blot检测小肠组织α7-nAChR表达情况。结果:造模12 h后,AGI分级:Ⅰ级40只,Ⅱ级25只,Ⅲ级11只,Ⅳ级4只;与T0比较,T1、T2、T3家兔血浆DAO及内毒素、尿液L/M及血清TNF-α含量、肠道细菌移位率、肠道病理损伤程度随时间的推移依次显著升高(P<0.05),小肠组织α7-nAChR表达随时间的推移依次显著降低(P<0.05)。结论:严重多发伤家兔于早期便出现肠道功能损伤、肠道菌群移位及肠黏膜屏障功能损伤,这可能与α7-nAChR表达降低有关。     

重组人乙酰胆碱受体α亚单位胞外域在CHO细胞中的表达

目的 获得具有生物学活性的重组人烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α1亚基胞外域(ECD)蛋白.方法 从TE761细胞中提取人nAChR α1亚单位全长基因,以PCR法扩增nAChR α1亚基ECD1-216,酶切后装入pcDNA3.1表达载体中,脂质体转染入CHO细胞,分别在转染后6～72 h的7个时间点进行荧光实时定量PCR鉴定ECD基因的表达水平,利用125I标记的银环蛇毒素测定细胞培养上清中ECD蛋白的表达.结果 Hα1-216 PCR后所得708 bp片段大小符合预计结果,测序所得核苷酸序列与GenBank中人AChR α1序列完全一致.所构建的新载体经酶切鉴定目的基因正确插入,载体构建成功.随着细胞培养时间的延长ECD基因mRNA表达水平逐渐增加,且ECD蛋白表达水平也不断提高.结论 在CHO细胞成功表达了具有生物学活性的重组人nAChR α1胞外域蛋白.