葡萄糖氧化酶诱导的氧化应激抑制α4β2烟碱型乙酰胆碱受体电流

目的探究葡萄糖氧化酶(GO)引起的氧化应激对α4β2烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)电流的影响。方法在HEK293T细胞共转染α4和β2质粒48 h后进行实验。分为对照组(control组)、3.5 k U/L的GO处理组(GO组)、3.5 k U/L的GO与450 k U/L的过氧化氢酶(CAT)共处理组(CAT组)。使用DCFH-DA荧光探针以及激光共聚焦显微镜来检测活性氧(ROS)的产生;采用全细胞膜片钳检测α4β2 nAChR的电流变化,给予1、10和30μmol/L ACh检测受体功能,给予10μmol/L ACh检测电流变化。结果全细胞膜片钳记录到呈ACh剂量依赖性的电流;GO处理HEK293T细胞1 h后可显著地增强细胞活性氧的水平(P0.001);对照组电流在10次给药中均保持稳定,GO组的电流在连续10次的ACh给药下逐渐降低(P0.01);CAT组反转GO引起的α4β2 nAChR电流下降(P0.01)。结论GO引起的氧化应激状态导致α4β2 nAChR电流逐渐下降,α4β2 nAChR电流的下降与ROS的增多密切相关。     

用电压钳检测烟碱型乙酰胆碱受体导电孔道的重要位点

目的利用双电极电压钳技术检测组成人烟碱型乙酰胆碱受体离子导电孔道的主要氨基酸位点。方法用定点突变的方法将人alpha 7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nAChR)亚基跨膜区段M2的氨基酸(Leu248–Ala258)逐一突变为亲水性的丝氨酸,随后利用cDNA质粒体外转录获得cRNA,并将单个突变体的cRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞中。注射1～3 d后,利用双电极电压钳检测野生型(WT)α7 nAChR及各突变体的功能。结果获得跨膜区段M2亲水性突变后,与WT相比,发现4个亲水性突变体(L248、V252、L255和L256)对激动剂乙酰胆碱(ACh)的EC_(50)值明显降低(P0.001);剂量-反应曲线向左显著移动,脱敏程度明显减轻(P0.01);而且它们对ACh的敏感性与脱敏程度呈正相关性(R~2=0.98)。结论α7 nAChR亚基的M2跨膜区段的4个位点L248、V252、L256和L255是组成其导电孔道的主要氨基酸位点。     

α4亚基Arg-188和Pro-198突变促进α4β2烟碱型乙酰胆碱受体开放

目的:探讨乙酰胆碱、尼古丁、伐尼克兰和金雀花碱4种激动剂与α4β2烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)及其突变体相互作用的活性关键位点。方法:体外转录法制备野生型(wt)与突变型α4亚基cRNAs,注射入非洲爪蟾卵母细胞,应用电生理方法,测定4种激动剂对α4β2 nAChRs及其突变体的门控活性。结果:乙酰胆碱对wt α4β2、α4(R188I)β2、α4(P198Q)β2和α4(R188I,P198Q)β2 nAChRs的半数有效浓度(EC_(50))分别为67.15、63.83、22.43和1.37μmol/L,尼古丁对wt α4β2、α4(R188I)β2、α4(P198Q)β2和α4(R188I,P198Q)β2nAChRs的EC_(50)分别为1.43、0.63、1.05和0.27μmol/L。与乙酰胆碱(10 mmol/L)诱导的峰值电流幅度相比,金雀花碱对wt α4β2和α4(R188I,P198Q)β2 nAChRs的最大激动效率(E_(max))从37.62%提升至95.14%,伐尼克兰对wt α4β2和α4(R188I,P198Q)β2 nAChRs的E_(max)也从67.94%提升至94.69%。结论:α4亚基第188位精氨酸(arginine,Arg,R)和第198位脯氨酸(proline,Pro,P)分别突变成异亮氨酸(isoleucine,Ile,I)和谷氨酰胺(glutamine,Gln,Q)后,增强了α4β2 nAChRs对乙酰胆碱和尼古丁的敏感性,并提高了α4β2 nAChRs对金雀花碱与伐尼克兰的通道开放效率。     

RNA干扰抑制α3神经型尼古丁受体的表达对SH-SY5Y神经细胞抗氧化能力的影响

目的 探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响,来了解α3 nAChR的神经保护作用.方法 设计并体外合成α3 nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSilencer 3.1-H1 nco质粒中,构建重组质粒α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo.将α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo转染SH-SYSY细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化.用1 μmo1/Lβ淀粉样肽1-42(Aβ1-42)处理转染细胞后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞活力;用比色法测定其脂质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性.结果 成功构建α3 nAChR siRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3 nAChR mRNA及蛋白表达量均降低(抑制率分别为98%和66%);经转染处理的细胞活力明显低于对照组,细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低;抑制α3 nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用.结论 成功构建的α3 nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3 nAChR基因表达,α3 nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高,并增加Aβ的神经毒性,表明α3 nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用.     

免疫活性细胞非神经乙酰胆碱系统的研究进展

免疫活性细胞表达胆碱乙酰转移酶(ChAT)、乙酰胆碱合成酶(AChE)、毒蕈碱和烟碱型乙酰胆碱受体(mAChR/nAChR),刺激免疫活性细胞上mAChR和nAChR,免疫细胞可以产生各种生化和功能的变化。活化免疫细胞,可以通过上调ChAT的表达,增加ACh的合成,而上调ChAT的表达。免疫细胞的免疫功能和淋巴细胞胆碱能活性密切相关。免疫细胞(如T细胞、B细胞、单核细胞)表达所有5种亚型的毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR M1~M5),同时表达不同亚型的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR),如α3、α5、α7、α9和α10。用卵白蛋白(OVA)免疫敲除M1和M5基因小鼠,上调脾脏单核细胞的TNF-α、IFN-γ和IL-6产生。导致血清抗OVA特异性IgG1增加。而敲除α7基因小鼠,α7烟碱受体下调促炎因子,减少抗OVA特异性IgG1的产生。免疫活性细胞,通过mAChR和nAChR调节细胞因子及抗体的产生。非神经胆碱能系统(NNCS)参与调节免疫细胞功能,二者相互影响。     

毒蕈碱胆碱能受体3在小细胞肺癌增殖和迁移中的调节作用

目的:研究毒蕈碱胆碱能受体3(M3R)在人小细胞肺癌(SCLC)中的表达及其作用。方法:体外培养人SCLC细胞株SBC3和H82,RT-PCR和Western blotting法检测M3R的表达,MTT法和Boyden chamber法分别检测胆碱受体激动剂碘化乙酰胆碱(ACh)及M3R拮抗剂4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide(4-DAMP)对SBC3细胞增殖和迁移的影响。结果:SBC3和H82细胞均表达M3R,SBC3细胞M3R蛋白相对表达强度是H82细胞的2.65倍。ACh浓度依赖性地刺激SBC3细胞增殖,10-4和10-3mol/L ACh在48h和72h作用明显(P0.01)。4-DAMP浓度依赖性地阻断ACh对细胞增殖的刺激作用,48h时,10-5mol/L4-DAMP阻断ACh的作用(P0.05),至72h,10-7、10-6mol/L(P0.05)和10-5mol/L(P0.01)4-DAMP都能阻断ACh的作用。无外源性ACh的情况下,10-6、10-5mol/L4-DAMP在48h都能明显地抑制细胞增殖(P0.01),在72h,10-5mol/L4-DAMP的作用(P0.01)强于10-6mol/L4-DAMP(P0.05)。ACh浓度依赖性地增强SBC3细胞向人纤维结合蛋白(Fn)的迁移,10-4mol/L ACh增加细胞迁移约3倍,10-6、10-5mol/L4-DAMP几乎完全阻断10-4mol/LACh刺激的SBC3细胞迁移(P0.01)。结论:人SCLC细胞表达M3R,M3R拮抗剂抑制SCLC细胞增殖和迁移。     

尼古丁成瘾机制的研究进展

尼古丁(NIC)通过烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)在脑中起作用。nAChRs是由5个跨膜亚单位组成的配体门控离子通道,在哺乳动物中其包含9个α亚基(α2~α10)和3个β亚基(β2~β4)。脑中n Ach Rs主要亚型为含α4和β2亚基的nAChR(α4β2-nAChR),其介导许多与NIC成瘾有关的行为。近期研究表明,α7、α5、α6-nAChR在NIC成瘾中起重要作用。编码α5、α3和β4的CHRNA5-CHRNA3-CHRNB4基因簇的遗传变异,增加了对烟草依赖和吸烟相关疾病(包括肺癌)的易感性。小鼠中α5或β4亚基的表达改变了NIC的消耗模式。此外,NIC对食欲、注意力和情绪的影响与吸烟习惯的建立和维持相关。     

17α雌二醇对转基因细胞株(APP/PS1N2a)β-淀粉样蛋白生成的影响

目的 探讨17α雌二醇（ESUB>2/SUB>α）对稳定表达人β-淀粉样前体蛋白（APP）/早老因子-1（PS1）即APP /PS1基因的神经母细胞瘤细胞株（Neuro-2a）（APP/PS1 NSUB>2/SUB>a）β-淀粉样蛋白（Aβ）产生的影响及可能机制。方法 将APP/PS1 NSUB>2/SUB>a细胞用10×10SUP>-9/SUP> mol/L E2α预处理2d,更换培养液后,分别进行如下处理：1.加入不同浓度ESUB>2/SUB> a（25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L）和溶媒（对照组）,用免疫印迹法(Western blotting)检测APP/PS1 NSUB>2/SUB> a细胞内和细胞外的Aβ蛋白水平及细胞BACE1蛋白水平;2.加入 100nmol/L ESUB>2/SUB>α、20nmol/L葡萄糖和5mIU葡萄糖氧化酶（GOX）。24h后,进行二氢乙啶(DHE)染色观察APP/PS1 N2a细胞中活性氧（ROS）含量的变化。结果 不同浓度E2α（25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L）处理后,细胞外Aβ蛋白水     

CaMKⅡ抑制剂抑制AngⅡ或电场刺激诱导的心肌成纤维细胞TNF-α、TGF-β_1及collagenⅠ、Ⅲ的表达

目的:观察钙-钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)或电场刺激(EFS)诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖、分泌细胞因子及胶原酶表达中的作用及其机制。方法:培养新生1-3 d乳鼠心肌成纤维细胞(3代),分为正常对照组(control)、0.1μmol/L AngⅡ组、0.1μmol/L AngⅡ+0.5μmol/L CaMKⅡ抑制剂KN92组、0.1μmol/L AngⅡ+0.5μmol/L CaMKⅡ抑制剂KN93组、0.1μmol/L AngⅡ+0.5μmol/L CaMKⅡ抑制剂AIP组;10 V1.0 Hz EFS组、10 V 1.0 Hz EFS+0.5μmol/L KN92组、10 V 1.0 Hz EFS+0.5μmol/L KN93组、10 V1.0 Hz EFS+0.5μmol/L AIP组、10 V1.0 Hz EFS+0.1μmol/L AngⅡ组。MTT法测定心肌成纤维细胞增殖;ELISA法测定细胞因子(TGF-β1,TNF-α)分泌;RT-PCR检测TGF-β1、TNF-α、collagenⅠ、ⅢmRNA水平。结果:CaMKⅡ抑制剂(0.5μmol/L KN93,0.5μmol/L AIP)能预防AngⅡ或EFS诱导的心肌成纤维细胞增殖;CaMKⅡ抑制剂(0.5μmol/L KN93,0.5μmol/L AIP)可预防AngⅡ或EFS引起的细胞培养上清液TGF-β1、TNF-α含量及相应mRNA表达增加。CaMKⅡ抑制剂(0.5μmol/L AIP,1.0μmol/L AIP)预防0.1μmol/L AngⅡ引起的collagenⅠ、Ⅲ表达增加。结论:抑制CaMKⅡ对AngⅡ或EFS诱导的心肌成纤维细胞增殖具有预防作用,其机制可能与CaMKⅡ抑制剂抑制TGF-β1、TNF-α以及胶原的表达有关。     

ERS-GSK-3β信号通路介导高糖引起H9c2心肌细胞坏死性凋亡

目的探讨高糖损伤H9c2心肌细胞过程中,内质网应激(ERS)-糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)通路能否介导H9c2心肌细胞坏死性凋亡的发生。方法 H9c2心肌细胞随机分为正常对照(Control)组、高糖(HG,35 mmol/L葡萄糖)损伤组、4-PBA+HG组、Li Cl(为GSK-3β的抑制剂)+HG组、Nec-1(necroptosis特异性抑制剂)+HG组、4-PBA组、Li Cl组和Nec-1组。应用蛋白质免疫印迹试验测定ERS的2个关键蛋白分子,即葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP),以及GSK-3β、受体相互作用蛋白-3(RIP3)的蛋白水平;采用细胞计数试剂盒8测定心肌细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧(ROS)水平;ELISA法检测细胞分泌IL-1β和TNF-α的水平。结果 HG作用H9c2心肌细胞可促进GRP78、CHOP和RIP3蛋白的表达,并抑制磷酸化(p)-GSK-3β的表达;50μmol/L 4-PBA(ERS的抑制剂)或10 mmol/L Li Cl预处理心肌细胞60 min均能抑制HG对RIP3蛋白的上调作用;4-PBA预处理心肌细胞也可减弱HG对p-GSK-3β的抑制作用。此外,50μmol/L4-PBA和10 mmol/L Li Cl预处理心肌细胞或100μmol/LNec-1和HG共处理细胞均能对抗HG引起的细胞损伤,使细胞存活率升高,ROS生成减少,IL-1β和TNF-α的分泌水平降低。结论 ERS-GSK-3β通路在HG诱导心肌细胞坏死性凋亡等损伤中起着重要的作用。     

α7nAChR参与生理浓度糖皮质激素的抗炎作用*

 目的： 探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）在生理浓度糖皮质激素（GCs）抗炎过程中的作用。方法: MTT法检测不同浓度氢化可的松对小胶质细胞BV-2活性的影响;在建立LPS刺激的BV-2细胞炎症模型基础上,实验分组如下：(1) 空白对照组;(2) LPS组;(3) GCs＋LPS组;(4) α7nAChR阻断剂甲基牛扁亭碱（MLA）＋GCs＋LPS组,ELISA法测定细胞上清中TNF-α和IL-1β的含量。结果: 2 000 和1 000 nmol/L 氢化可的松可分别使细胞存活率降低至(76.9±5.5)%和(90.8±7.3)%,表现出超生理剂量GCs的细胞损伤作用。LPS明显刺激BV-2细胞释放TNF-α和IL-1β,并呈现时间和剂量依赖性。生理浓度（500和250 nmol/L）的氢化可的松均可减少LPS诱导BV-2细胞释放TNF-α和IL-1β,10 nmol/L MLA预处理BV-2细胞能拮抗GCs抑制炎症因子释放的作用。结论: α7nAChR参与了生理浓度GCs的抗炎作用。     

气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬功能的影响及HIF-1α的作用

目的:探讨气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬活性的影响及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的作用。方法:将不同浓度(0、100、200、400和800μmol/L)氯化钴(CoCl_2)处理或转染HIF-1αsi RNA的人支气管上皮(HBE)细胞与12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA)诱导人单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞共培养,RT-qPCR检测HBE细胞HIF-1α的m RNA表达,流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物的表达及对大肠杆菌的吞噬率。结果:CoCl_2浓度依赖性增加HBE细胞HIF-1α的m RNA表达,8 h为峰值,同时CoCl_2处理的HBE细胞也增加共培养的巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18荧光强度比率,800μmol/L处理的HBE细胞作用最强;共培养8 h和12 h的巨噬细胞CCL3荧光强度比率增加最明显,而共培养24 h的巨噬细胞CD163、CD206和CCL18荧光强度比率上升更明显。转染HIF-1α-Homo-488 si RNA的HBE细胞对巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18的刺激作用明显减弱。与不同浓度CoCl_2处理的HBE细胞共培养24 h的巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬率最初(60 min以前)均呈不同的上升趋势,其后吞噬率均降低。相对于正常HBE细胞共培养组,400和800μmol/L刺激组在各时点的吞噬率均降低,其中800μmol/L刺激组降低最明显。结论:低氧环境下气道上皮细胞早期增强巨噬细胞向M1优势转化,而长期低氧作用的气道上皮细胞抑制巨噬细胞吞噬作用并向M2优势转化,HIF-1α可能是这些过程的重要介质。     

橄榄苦苷对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞损伤的作用及机制研究

目的:研究橄榄苦苷对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的SD大鼠关节软骨细胞的影响。方法:采用酶两步顺序消化法消化SD大鼠关节软骨分离细胞,体外培养软骨细胞,光学显微镜观察细胞形态,阿尔新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化法对软骨细胞进行鉴定。橄榄苦苷对软骨细胞的细胞毒性采用CCK-8实验进行评估。取第3代软骨细胞,分别用浓度为10、50或100μmol/L的橄榄苦苷预先处理,随后用IL-1β刺激细胞24 h,所生成的NO和前列腺素E2(PGE2)的量分别用格里斯重氮化反应和酶联反应吸附实验进行评估。基质金属蛋白酶(MMP)-1和MMP-13 mRNA的表达利用实时荧光定量PCR进行定量检测。采用免疫印迹实验分析诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶2(COX-2)和活化NF-κB的蛋白表达。结果:软骨细胞在不同浓度橄榄苦苷培养24 h后,其生存能力与对照组相比无明显差异。橄榄苦苷可以显著降低IL-1β刺激下软骨细胞MMP-1和MMP-13 mRNA的表达及NO、PGE2的生成。橄榄苦苷通过减少IκB蛋白的降解从而抑制IL-1β介导的NF-κB通路的活化。结论:橄榄苦苷可通过NF-κB信号转导通路调控炎症的发生发展,进一步明确了橄榄苦苷对关节炎防治作用的分子机制,为骨关节炎的免疫治疗提供了重要的基础理论依据。     

3β，5α，6β-三羟基胆甾烷诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡

 目的：研究3β,5α,6β-三羟基胆甾烷(Triol)诱导恶性胶质瘤细胞凋亡的作用及其机制。方法：以不同浓度的Triol作用于C6细胞和A172细胞不同时间。采用MTT法检测细胞存活率,Hoechst 33342染色和TUNEL法检测细胞凋亡,试剂盒检测caspase活性变化,蛋白免疫印记方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2家族蛋白的变化。结果：Triol可呈剂量和时间依赖性降低C6细胞和A172细胞的存活率;Triol处理细胞48 h,C6细胞和A172细胞的IC50值分别为（17.8±0.6)μmol/L和(20.6±0.2)μmol/L。Hoechst 33342染色、TUNEL检测和凋亡执行酶caspase-3活性检测结果显示,给药组中2种细胞都出现明显凋亡核象、TUNEL阳性细胞数增多和caspase-3的激活。Triol作用于C6细胞12 h、24 h和48 h后,在凋亡外通路中激活的caspase-8和在凋亡内通路中激活的caspase-9活性均随时间升高,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达量随时间降低,而促凋亡蛋白Bak的表达量随时间升高。结论：Triol通过激活内、外凋亡通路引起恶性胶质瘤细胞的凋亡,且 Bcl-2家族蛋白在此过程中起重要的调控作用。     

甘氨酸受体α_1亚基在乳鼠心肌细胞的表达及损害性因素对其表达的影响

目的:研究甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)在乳鼠心肌细胞中的表达以及脂多糖(LPS)、缺氧/复氧(H/R)、异丙肾上腺素(ISO)和高糖(HG)对其表达的影响。方法:体外培养乳鼠心肌细胞,Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达;心肌细胞分别用LPS、H/R、ISO以及HG处理24 h,采用CCK-8试剂检测细胞活力,Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达。结果:Western blotting方法检测到乳鼠心肌细胞上GlyRα1的表达;LPS(20 mg/L)、ISO(100μmol/L)以及HG(25mmol/L)处理心肌细胞24 h与心肌细胞H/R 3 h对心肌细胞存活率无明显影响;LPS组、H/R 3 h组以及ISO组心肌细胞上GlyRα1表达均高于对照组(P0.01),而HG组心肌细胞上GlyRα1表达低于对照组(P0.01)。结论:乳鼠心肌细胞上存在GlyRα1,并且一定浓度的LPS、ISO与一定时间的H/R均可上调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达,而HG可下调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达。     

槲皮素通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大

目的:探讨槲皮素对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的防治作用及机制。方法:分别在原代新生大鼠心肌细胞和培养的H9c2心肌细胞,用100 nmol/L的AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型,并给予3种不同浓度的槲皮素(10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)处理,利用免疫荧光检测原代和H9c2心肌细胞表面积的改变,采用荧光底物法检测H9c2心肌细胞蛋白酶体的活性变化,以及用Western blot检测H9c2心肌细胞糖原合酶激酶(GSK)-3α/β、Akt及其磷酸化情况。结果:与对照组相比,模型组原代心肌细胞和H9c2心肌细胞表面积均显著增大,槲皮素处理组2种心肌细胞表面积较模型组均明显减小,而20μmol/L槲皮素组减小更明显(P0.05)。在H9c2细胞实验中发现模型组蛋白酶体的糜蛋白酶样、半胱天冬酶样和胰蛋白酶样活性明显升高,20μmol/L和40μmol/L槲皮素组半胱天冬酶样和胰蛋白酶样活性较模型组均明显降低,而糜蛋白酶样活性只有在槲皮素20μmol/L时有显著差异(P0.05);Western blot检测结果显示,模型组磷酸化(p)-GSK-3α、p-GSK-3β和p-Akt水平较对照组均明显增加,而20μmol/L和40μmol/L槲皮素处理均使p-GSK-3α、p-GSK-3β和p-Akt水平明显下降(P0.05)。结论:槲皮素可明显抑制蛋白酶体活性从而减轻心肌细胞肥大,其机制可能是通过下调Akt活性而升高GSK-3α/β活性实现的。     

HIF-1α介导人参皂甙Rb1对缺氧心肌细胞葡萄糖代谢的调节

目的:探讨人参皂甙Rb1(Gs-Rb1)是否通过缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和(或)AMP激活的蛋白激酶α(AMPKα)调节缺氧心肌细胞的葡萄糖代谢而改善其生存能力。方法:将乳鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组(1%O_2、94%N_2和5%CO_2)和缺氧干预组(即Gs-Rb1组、Ara-A组、Gs-Rb1+Ara-A组、YC-1组、Gs-Rb1+YC-1组、Ara-A+YC-1组和Gs-Rb1+YC-1+Ara-A组),Gs-Rb1、Ara-A和YC-1浓度分别为200μmol/L、500μmol/L和5μmol/L,均干预8 h。MTT法检测细胞存活率;Western blot法半定量检测AMPKα、p-AMPKα、HIF-1α和葡萄糖转运体4(GLUT-4)的蛋白水平;ELISA检测己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。结果:Gs-Rb1显著改善缺氧心肌细胞的生存能力,该作用可被Ara-A和YC-1抑制,且YC-1和Ara-A具有协同效应。Gs-Rb1增加缺氧心肌细胞AMPK活性的效应可被Ara-A或YC-1抑制。Ara-A和YC-1能不同程度抑制Gs-Rb1上调缺氧心肌细胞HIF-1α表达的效应。Gs-Rb1显著上调缺氧心肌细胞膜GLUT-4的表达,但该作用可被Ara-A或YC-1抑制,Ara-A和YC-1联用时尤为显著。Gs-Rb1显著增加缺氧心肌细胞HK、PFK和LDH等的活性,但该作用可被Ara-A和YC-1抑制,且YC-1和Ara-A具有协同抑制效应。结论:人参皂甙Rb1改善缺氧心肌细胞生存能力与其促进葡萄糖摄取和增强葡萄糖糖酵解有关,这些效应可被HIF-1α和(或)AMPK调节,且HIF-1α和AMPK对此的调节具有协同作用。     

ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制坏死性凋亡介导的高糖致H9c2心肌细胞炎症中的作用

目的:探讨ATP敏感性钾通道(K_ATP通道)在硫化氢(H2S)抑制坏死性凋亡介导的高糖(HG)致H9c2心肌细胞炎症中的作用。方法:应用Western blot法测定受体相互作用蛋白3(RIP3)和环氧化酶-2(COX-2)的表达水平;ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,其RIP3的表达水平明显升高,100μmol/L K_ATP通道开放剂二氮嗪(DZ)和400μmol/L H_2S的供体硫氢化钠(Na HS)预处理心肌细胞30 min均可抑制HG对RIP3表达的上调;100μmol/L K_ATP通道阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)预处理心肌细胞30 min可阻断Na HS对HG上调RIP3表达的抑制作用。另一方面,100μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1共处理或100μmol/L DZ、400μmol/L Na HS预处理心肌细胞均能抑制高糖引起的心肌细胞炎症,使COX-2表达及IL-1β和TNF-α的分泌水平均减少;而100μmol/L 5-HD能明显拮抗Na HS的上述抗炎症反应作用。结论:K_ATP通道在H_2S抑制坏死性凋亡介导的高糖致心肌细胞炎症反应中发挥重要的作用。     

低氧诱导神经干细胞凋亡和miR-26a低表达

目的:初步探讨氯化钴(cobalt chloride,Co Cl2)是否诱导神经干细胞(neural stem cells,NSCs)凋亡及其机制,探讨NSCs凋亡是否引起microRNA-26a(miR-26a)表达变化。方法:用不同剂量的Co Cl2处理NSCs,CCK-8检测细胞活力;TUNEL检测细胞凋亡;建立Co Cl2诱导NSCs凋亡的模型,将NSCs分为对照组和凋亡组,real-time PCR检测miR-26a-3p、miR-26a-5p、GSK-3β、Bcl-2、Bax和caspase-3的表达;Western blotting检测Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果:CCK-8结果显示不同浓度(200、400和600μmol/L)Co Cl2作用24 h,NSCs活力呈剂量依赖性下降(P0.05)。TUNEL检测显示Co Cl2(200、400和600μmol/L)作用24 h后NSCs凋亡率呈剂量依赖性增加(P0.05)。Real-time PCR和Western blotting结果表明凋亡组miR-26a、GSK-3β、Bax和caspase-3表达增加,Bcl-2、Bcl-2/Bax蛋白水平下降(P0.05)。结论:Co Cl2(400μmol/L)作用24 h可建立NSCs凋亡模型,其机制可能与线粒体凋亡通路有关;NSCs凋亡时miR-26a表达减少。     

IL-1β对脓毒症新生幼鼠胼胝体内少突胶质细胞前体细胞分化成熟的影响

目的:探讨IL-1β对少突胶质细胞前体细胞(OPCs)分化成熟及轴突髓鞘化的影响。方法:将出生1 d的SD幼鼠96只随机分为2组:对照组和脂多糖(LPS)组各48只。LPS组给予腹腔注射1mg/kg LPS,对照组腹腔注射等体积PBS。根据注射后时间分为3 h、24 h、3 d、7 d、14 d、28 d 6个亚组,应用双标免疫组化及Western blotting的方法观察3 h、24 h、3 d、7 d时IL-1β及IL-1受体1(IL-1R1)的表达和14 d、28 d时髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。进行原代OPCs培养将其分为对照组、IL-1β组、IL-1β+IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)组及IL-1Ra组。将其诱导分化3 d后利用免疫荧光及Western blotting比较4组间MBP的表达。结果:与对照组相比,LPS注射后3 h、24h、3 d、7 d幼鼠胼胝体小胶质细胞表达IL-1β明显增加,其受体在OPCs表达增加。LPS注射后14 d、28 d,MBP在胼胝体的表达下降。细胞实验显示原代OPCs培养诱导分化3 d后IL-1β可以抑制MBP的表达,并且可以被IL-1Ra逆转。IL-1β可抑制磷酸化ERK的表达,ERK过表达可逆转IL-1β对MBP的抑制作用。结论:在脓毒症新生幼鼠胼胝体内IL-1β有可能通过抑制ERK通路来抑制OPCs成熟,从而导致脑白质轴突低髓鞘化。