人源性抗乙酰胆碱受体自身抗体的构建及特异性鉴定

目的 用人抗乙酰胆碱受体(AchR)自身抗体的抗原结合片段(Fab)构建完整的抗人AchR自身抗体,为重症肌无力(MG)的实验研究提供人源性抗体材料. 方法 应用PCR技术从分离自MG患者胸腺的Fab637扩增重链Fd片段基因和轻链基因,并克隆至含有免疫球蛋白(IgG1)基因的载体pIgG1上,构建人源性抗AchR自身抗体哺乳类细胞表达的重组载体pIgG1-637.将pIgG1-637转染CHO-k1细胞,细胞培养上清液经斑点杂交试验检测抗体的表达,以放射免疫测定法测定表达的抗体与特异性人AchR结合的活性.结果 细胞培养24 h后能检测到抗体的分泌,表达的抗体能特异性地与抗原结合,且结合活性很高.结论 已成功地构建了具有与抗原特异性结合的人源性IgG1类抗人AchR自身抗体IgG1-637.     

重症肌无力的自身免疫性研究Ⅰ.重症肌无力抗突触前膜抗体的检测

本文报道应用特异与突触前膜结合的β-银环蛇毒素(β-Bungarotoxin,β-BGT)和特异与乙酰胆碱受体(AchR)结合的α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BGT)包被检测板,纯化人骨骼肌提取液中各自特异结合的蛋白质,以ABC-ELISA法检测正常人和重症肌无力病人血清中各自抗体。凡与β-BGT板结合蛋白起反应者为抗突触前膜抗体,凡与α-BGT板结合蛋白起反应者为抗AchR抗体。文章详细介绍了检测方法的特异性、重复性和可比性。我们认为应用β-和α-银环蛇毒素纯化后进行的ABC-ELISA法,是研究重症肌无力交触前、后膜抗体可靠的手段。     

抗乙酰胆碱受体单链抗体对致病性抗体结合活性的抑制作用

为探讨单链抗体 (ScFv )对重症肌无力 (MG )的特异性免疫治疗作用 ,从分离自MG患者胸腺的抗乙酰胆碱受体(AchR )抗原结合片段Fab6 37构建单链抗体ScFv6 37。应用放射免疫测定法测定了ScFv6 37与刺激抗原人AchR的特异性结合活性以及与相关抗原大鼠AchR和电鳐AchR的交叉反应 ,应用竞争性ELISA测定抑制致病性抗AchR完整抗体IgG6 37与人AchR结合活性。结果发现ScFv6 37只能与人AchR结合 ,不能与大鼠和电鳐的AchR结合。对IgG6 37与人AchR结合的抑制率为 17 5 %～ 32 9%。表明单链抗体对AchR具有一定的“保护”作用。     

重症肌无力患者血清非Ig成分对突触前、后膜受体及其相应抗体反应的影响

利用盐析、免疫亲和吸附及Protein G Fast Flow完全去除20例抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体和抗突触前膜受体(PsmR)抗体阳性重症肌无力(MG)、20例抗体阴性MG、15例其它神经科疾病患者和15例正常对照血清的Ig部分。并以ABC-ELISA观察应用上述方法提取的血清非Ig成分对AchR和PsmR抗原抗体反应的影响。结果显示除抗体阴性MG血清经非Ig成分作用后,AchR、PsmR与其各自抗体的反应反而增强外,其余各种血清非Ig成分对AchR和PsmR的抗原抗体反应均五星著抑制作用。其机制目前尚不清楚。推测抗体阴性MG患者的血清非Ig成分中可能存在某种活化抗原抗体反应的物质。     

用我国海域电鳐电器官提取的N_2AchR粗提物建立大鼠EAMG模型

重症肌无力 (myastheniagravis,MG )是由烟碱型乙酰胆碱受体 (N2 AchR )抗体介导的针对神经肌肉接头处突触后膜上N2 AchR进行破坏的一种自身免疫性疾病。目前公认的MG动物模型是用电鳐 (Torpedocalifornia )发电器官提取、纯化的N2 AchR作为抗原免疫动物 ,建立实验性自身免疫性重症肌无力 (EAMG )模型 ,进行MG发病机制研究。但N2 AchR纯化需用眼镜蛇神经毒素 ,造价高 ,且制备复杂。国内建立EAMG模型 ,进行MG机制研究所用纯化的N2 AchR大多是国外同行馈赠所得 ,只能做少量动物实验。国内尚缺乏进行药效学研究的大样本的EAMG模…     

重症肌无力病人血清中突触前膜抗体的特异性及其交叉反应性

11例重症肌无力病人抗乙酰胆碱受体(AchR)和抗突触前膜抗体阳性的血清,进行了突触前膜(β-BuTx结合蛋白)抗体的特异性和交叉免疫反应性分析。结果发现90％以上的突触前膜抗体能被β-BuTx结合蛋白的亲和层析柱所吸附;亲和层析柱纯化的突触前膜抗体能特异地与β-BuTx结合蛋白起免疫反应,亦有45～55％的比值与AchR起免疫反应。交叉免疫反应的原因可能与AchR和β-BuTx结合蛋白的某些结构相似或同源性有关。     

表达膜抗AchR抗体的杂交瘤细胞株的建立

目的 建立表达膜特异性自身抗体的细胞株。方法 用DNA重组技术表达乙酰胆碱受体 亚基，并用其免疫小鼠。应用杂交瘤技术，建立小鼠脾细胞融合的杂交瘤细胞株。通过流式细胞术分析杂交瘤细胞膜抗体和膜免疫球蛋白的表达，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析膜抗体和分泌型抗体分子量的差别，用免疫沉淀和Western blot等方法鉴定膜蛋白和分泌蛋白。结果 杂交瘤细胞既可以分泌抗体又可以表达膜抗体。结论 表达膜抗AchR的杂交瘤细胞类似于重症肌无力中表达膜自身抗体的B细胞，可进一步作为靶细胞研究该疾病。     

同种异型T细胞抑制全身型MG患者AchR-Ab产生的研究

观察人T细胞对全身型重症肌无力 (MG )患者抗乙酰胆碱受体抗体 (AchR Ab )产生的影响。在体外用乙酰胆碱受体(AchR )为抗原诱导 30例全身型MG患者的淋巴细胞 ,并分别加入正常人T细胞和同种异体MG患者T细胞共同培养后 ,用酶联免疫吸附实验 (ELISA )检测MG患者淋巴细胞培养上清中AchR Ab的含量 ,并用微量细胞毒试验检测培养前后MG患者的T细胞亚群。结果显示 ,加入正常人T细胞组 ,其AchR Ab含量显著低于加入同种异体MG患者T细胞组和MG患者自身对照组 ,且正常人T细胞可使MG患者T细胞亚群间的比例发生改变 ,CD8+细胞数量明显增多 ,CD4+/CD8+比值明显降低。本文提示正常人T细胞能抑制全身型MG患者AchR Ab的产生 ,并对可能的机制及潜在的应用意义作了讨论。     

C-myc标记肽对单链抗体与抗原结合活性的影响

目的 探讨在不同的免疫学检测方法中，与单链抗体相连的亲和标记肽对单链抗体与抗原结合活性的影响。方法 在制备“VH-连接链-VL”型结构抗乙酰胆碱受体单链抗体时，将c-myc标记肽与单链抗体的VL连接，应用先将抗c-myc抗体固定单链抗体的固相放射免疫测定法、直接将单链抗体与乙酰胆碱受体结合的液相放射免疫测定法，分别测定单链抗体与乙酰胆碱受体的结合活性。结果 在固相放射免疫测定法中，单链抗体不能与乙酰胆碱受体结合；在液相放射免疫测定法中，单链抗体则能与乙酰胆碱受体结合。结论 在应用不同的免疫学检测方法中，与单链抗体相连的c-myc标记肽可影响单链抗体与抗原的结合活性。     

重症肌无力病人淋巴细胞对AchR的反应性和血清抗AchR抗体关系的研究

报告92例重症肌无力病者109次TEEM和抗AchR抗体的配对检测结果,发现延髓肌、脊髓肌型患者两种检测异常者均较高,眼肌型和全身肌无力型患者无显著差异。30岁以下发病者的细胞免疫异常显著高于30岁后发病者,抗AchR抗体的阳性检出率与年龄无明显相关。认为重症肌无力的免疫治疗应视发病年龄而別,30岁以下的女性患者应抑制细胞免疫反应,30岁以后者应以抑制体液免疫的方法为首选。     

人免疫球蛋白转基因小鼠自身免疫性重症肌无力模型的建立

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是由乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AchR)抗体介导的自身免疫病。AchR抗体与神经肌肉接头处的AchR结合，通过抗原调变、激活补体导致突触后膜裂解而使AchR数量减少，结果出现肌肉收缩无力等症状。MG的动物模型——实验性自身免疫性MG(experimental autoimmune MG，EAMG)可经主动免疫动物富含AchR的电鳐(Torpedo)电器官制备的AchR(tAchR)诱导出。     

鞣化羊红细胞电泳检测重症肌无力周围血淋巴细胞对AchR的细胞免疫性研究

应用鞣化羊红细胞电泳检测人骨胳肌提取的乙酰胆碱受体(AchR)粗制品对周围血淋巴细胞的免疫反应,共检测正常人40例,重症肌无力76例,散发性脑炎20例,肌营养不良症9例,多发性肌炎7例,运动神经元疾病2例,癫痫5例,中风后遗症2例。结果发现:(1)AchR对鞣化羊红细胞的缓慢率为0.994±1.225％,正常人淋巴细胞的致缓率为1.335±1.58％,两者无明显区别(P>0.05)。取-1.2～4.5％为正常范围,大于4.5％为阳性。(2)76例重症肌无力中62例缓慢率大于4.5％,阳性率     

重症肌无力——肌无力严重度与AChR Ab相对滴度密切相关

重症肌无力(MG)是累及神经—肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)的自身免疫性疾病,主要由抗体介导。一般报导MG病人的临床分类与抗乙酰胆碱受体抗体(AChR Ab)滴度相关不密切,甚至认为MG临床严重度与AChR Ab滴度无关。本文通过33例重症肌无力病人150例次抗乙酰胆碱受体抗体测定,经直线回归和相关性研究,证明MG病人的肌无力严重程度与其血清AChR Ab相对滴度密切相关。现将结果报告如下。     

Ⅱ.重症肌无力的抗突触前膜抗体及其意义

报道ABC-ELISA法检测82例重症肌无力,50例其它神经系统疾病和50例正常对照组血清中抗突触前膜和抗AchR抗体结果。以P/N比值大于2.5为阳性。结果发现:(1)82例重症肌无力抗AchE抗体阳性53例(64.6％),抗突触前膜抗体阳性55例(67.1％)。(2)两种抗体阳性互呈线性相关(r=0.90,p<0.01);64例两种或1种抗体阳性中,以抗突触前膜抗体占优势者极显著地多于以抗AchR抗体占优势者(p<0.01)。(3)抗突触前膜抗体占优势或仅突触前膜抗体阳性者,病程在5年以下者多于5年以上者(p<0.01)。本结果提示,重症肌无力病人血清中不仅存在抗AchR抗体,而且还存在抗突触前膜抗体,该抗体在重症肌无力的自身免疫发病机制中出现较早,并推测该抗体的出现在重症肌无力发病中可能有更重要的意义。     

用噬菌体表面显示肽库技术筛选乙酰胆碱酯酶有效抗原表位的研究

目的：筛选和鉴定乙酰胆碱酯酶的有效抗原表位。方法：收集乙酰胆碱受体抗体阴性而乙酰胆碱酯酶抗体阳性的重症肌无力病人血清，采用溴化氰活化的琼脂糖柱（CNBr-actived sepharose^TM4B）纯化抗乙酰胆碱酯酶的多克隆抗体并定量；用纯化的抗乙酰胆碱酯酶的抗体对随机的12肽噬菌体表面显示肽库进行5轮免疫学筛选，随机挑取克隆；采用Western blot免疫识别，识别为阳性的克隆进行核苷酸序列的测定，并与乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列进行同源性比较。将获得的不同表位的阳性克隆分别免疫小鼠，采用Western blot筛选能刺激小鼠产生抗乙酰胆碱酯酶抗体的阳性克隆，进行生物学活性的鉴定。结果：经5轮免疫学筛选后挑取的49个克隆中，经Westem blot识别15个克隆能被抗乙酰胆碱酯酶抗体识别。核苷酸序列分析发现共有7种不同的表位，其中1种表位与乙酰胆碱酯酶有较高的同源性，其余6种表位与其无一级结构的同源性。经动物免疫初步实验筛选，共有5个免疫原性较强的阳性克隆，其免疫的鼠血清均可识别人乙酰胆碱酯酶。结论：获得了5种乙酰胆碱酯酶的有效抗原表位，1种可能为结构表位，4种为模拟表位。     

人喉癌抗原的提取及其免疫原性的初步分析

我们应用喉癌组织提取喉癌抗原,制备了抗人喉癌抗体,并应用该抗体检测了66例喉癌、12例其它癌、30例献血员血清中喉癌抗原。     

AchR或ConA诱导正常人淋巴细胞培养上清治疗EAMG的研究

观察乙酰胆碱受体 (AchR )或刀豆蛋白 (ConA )诱导的正常人淋巴细胞培养上清对小鼠实验性重症肌无力模型 (EAMG )的疗效。分别用AchR或ConA诱导体外培养的正常人淋巴细胞 ,收集培养上清治疗EAMG小鼠。治疗前后用ELISA和微量细胞毒试验检测小鼠血中AchRAb的含量和T细胞亚群的变化 ,并检测小鼠的肌电图。结果显示 ,经两种培养上清治疗后 ,EAMG小鼠血中AchRAb水平明显下降 ,CD8+ 细胞数量显著增多 ,CD4+ /CD8+ 比值明显降低 ,且小鼠肌电图也明显改善。本文提示AchR或ConA诱导的正常人淋巴细胞培养上清对EAMG小鼠有一定疗效 ,并探讨了其可能的作用机制和潜在的应用价值。     

简化ELISA在检测重症肌无力抗烟碱型乙酰胆碱受体抗体的临床应用

抗烟碱型乙酰胆碱受体抗体(nAchR-Ab)为重症肌无力(MG)特异的自体免疫抗体,对协助临床诊断、观察疗效及研究MG 发病机理有重要意义。我们在原放射免疫分析法的基础上,省去碘标神经毒素,采用直接包被nAchR 抗原的ELISA 技术,检测MG 患者血清中抗nAchR-Ab,结果如下。     

重症肌无力患者骨髓、胸腺及外周血中IFN-γ、IL-4分泌细胞的检测

<正>重症肌无力（MG）是神经肌肉传递障碍的自身免疫性疾病,它是以抗乙酰胆碱受体（AchR）抗体为其主要的致病性抗体。目前认为该抗体的产生依赖于T淋巴细胞,T细胞所分泌的细胞因子参与了实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）的诱导和发病过程。干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）分别由Th1和 Th2亚型细胞所分泌,在机体免疫调节中起重要作用。本实验检测了早期发病的MG手术病人的骨髓、胸腺及外周血中IFN-γ和IL-4分泌细胞数,以期了解是否Th1及Th2均参与了MG的发病过程。     

重症肌无力患者TGA TMA RIA

本文报告202例重症肌无力（Myastheniagrauis,MG）患者的TGA、TMA放射免疫分析结果,并探讨其临床意义。 对象和方法 一、对象:重症肌无力患者为1995年1月～1996年12月本院神经内科确诊的住院病人,均无肝、肾或甲状腺疾病。 二、方法:TGA、TMA试剂盒由上海放射免疫分析技术研究所提供。测量仪器为北京二六一厂生产的FT-6306型γ计数器带微机数据自动处理系统。 结果 结果见表1。 讨论 目前普遍认为,MG是自身乙酰胆碱受体（AchR）致敏的自身免疫病,2/3MG患者血清免疫球蛋白增高,大多数MG病人血清中AchR抗体增高。