重组金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的表达及生物学活性分析

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因,添加亲和纯化标签进行原核表达,并对表达产物进行生物学活性分析.方法 通过PCR从pGEM-T-SEC2质粒中亚克隆得到带有编码6个组氨酸的核苷酸序列的基因片断,构建了表达质粒pET-28a-SEC2,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达.利用亲和层析纯化rSEC2,并采用MTT法对纯化后的rSEC2和天然SEC2生物学活性进行研究和比较.结果 表达质粒pET-28a-SEC2通过测序,表明已连入正确表达目的蛋白的核苷酸序列.含有该质粒的表达菌株经IPTG诱导,产生约占菌体总蛋白40%的可溶性重组蛋白.SDS-PAGE显示,经Ni2 亲和柱纯化的目的蛋白达到了电泳纯.MTT法表明该rSEC2和天然SEC2均有显著的超抗原活性.结论 成功构建了pET-28a-SEC2表达质粒,获得了与天然SEC2有着类似超抗原活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤活性奠定了基础.     

重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性.方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性.结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104 IU/mg.结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当.为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础.     

欧蓍草花粉主要过敏原Parj1的重组表达及鉴定

目的:克隆、表达和纯化欧蓍草花粉主要过敏原Par j1。方法:根据Parj1.0102在GenBank中的序列号获得其核苷酸和氨基酸序列,确定开放阅读框,采用DNAstar软件优化密码子,合成全基因,并克隆到表达载体pET-44a中,转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化蛋白表达条件并进行亲和层析纯化和Western blot鉴定。结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pET-44a+/Par j1.0102原核表达质粒。对表达菌表达条件进行优化,最终确定在30℃,IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4小时时蛋白表达量最高,重组蛋白经亲和层析纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在23 kD处有明显的条带。Western blot表明重组蛋白具有与StrepII标签抗体结合活性。结论:国内首次获得融合StrepII标签的Par j1.0102重组蛋白,为欧蓍草花粉过敏诊断及特异性免疫治疗奠定基础。     

人视黄醇结合蛋白原核蛋白表达和兔多克隆抗体的制备

目的制备兔抗人视黄醇结合蛋白(RBP)多克隆抗体。方法逆转录PCR扩增人RBP基因,将扩增产物连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-RBP,转化至大肠杆菌中。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,表达产物经SDS-PAGE分析鉴定出阳性克隆,扩大培养。用组蛋白标签(His-tag)纯化柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白皮下注射到新西兰白兔, 4次加强免疫得到抗血清。从抗血清中纯化出抗RBP多克隆抗体,并进行SDS-PAGE、 ELISA和Western blot法鉴定。结果成功构建了重组质粒pET-28a(+)-RBP,并获得高纯度的RBP重组蛋白, ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶512 000。结论成功制备兔抗人RBP多克隆抗体。     

人T-bet基因的表达、纯化及其免疫原性分析

目的：利用载体pQE30在大肠埃希菌（M15）原核表达人T-bet基因全长序列，并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法：利用PCR技术从克隆载体pGEM-T／T-bet获得人T-bet的全长编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pQE30，形成重组表达质粒pT-bet；酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109，测序鉴定后转化M15，经IPTG370C诱导4h后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白（表达产物），用Ni^2＋ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化；将纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠，制备人T-bet的多克隆抗体。结果：成功表达和纯化了人T-bet，并制备了多克隆抗体，ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价（1：100000）和高度特异性。结论：成功构建了原核表达载体pT-bet，并在工程菌M15中获得大量表达，经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白，制备了效价和特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。     

小鼠睾丸生精新基因SRG4原核表达与纯化

目的:原核表达小鼠睾丸生精新基因SRG4,并对重组蛋白进行纯化,为研究SRG4的生物学功能奠定基础。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸中扩增SRG4C端包含一个Sad1_UNC like domain的587bp片段,将PCR产物克隆至pUCm-T载体。随后,cDNA片段亚克隆至带有6个组氨酸标签的原核表达载体PQE-30中,测序鉴定。将重组质粒PQE-30-SRG4转化大肠杆菌M15,IPTG诱导,表达产物以Westernblot进行鉴定,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化。结果:成功地构建了原核表达质粒PQE-30-SRG4。IPTG诱导4~5h,SRG4融合蛋白表达量达最高。Western blot分析证实,IPTG诱导表达的蛋白是SRG4融合蛋白。Ni-NTAAgarose纯化后得到较纯的SRG4融合蛋白。结论:重组质粒PQE-30-SRG4能在大肠杆菌M15中表达,包含Sad1_UNC like domain的纯化SRG4融合蛋白可用于研究SRG4在精子发生中的生物学功能。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。     

汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化

目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrap~(TM) HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。     

大鼠细胞因子信号转导抑制因子-1基因的原核克隆表达和免疫学分析

目的 克隆表达大鼠细胞因子信号转导抑制因子-1基因(SOCS-1).方法 将大鼠SOCS-1全长编码基因的PCR产物,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-ratSOCS-1.转化大肠埃希菌BL-21/DE3,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用镍离子金属螯合剂亲和层析柱从表达产物中纯化重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物和重组蛋白进行鉴定.应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,抗体滴度达到1:10000以上后进行末次免疫,2周后心脏取血、测定滴度,分离制备免疫血清.用红细胞裂解法制备大鼠外周血白细胞裂解全蛋白.将阴性血清(未用重组蛋白免疫的新西兰大白兔的血清)、免疫血清及兔抗组氨酸标签抗体转入各蛋白条带,用Western免疫印迹检测重组蛋白的免疫学活性.结果 PCR、双酶切及DNA测序分析均表明重组质粒pET-28a(+)-ratSOCS-1构建成功.SDS-PAGE结果可见转化了重组质粒的大肠埃希菌全菌和经超声裂解后的菌体沉淀的样品均在相对分子质量约26 000处有一明显的蛋白条带,经亲和层析获得的纯化重组蛋白有特异的单一条带与上述条带一致,而在超声裂解后的菌体上清中相同位置却未见有蛋白表达条带.Western免疫印迹表明重组蛋白、大鼠外周血白细胞裂解蛋白中相对分子质量约24000的蛋白条带、兔抗组氨酸标签抗体均可被免疫血清识别,分别出现清晰的相对分子质量26000、24 000、26000的反应条带,表明其具有免疫活性.结论 SOCS-1基因可以在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得表达,其纯化重组蛋白具有良好的抗原性和免疫活性.     

败血症休克肝细胞线粒体损伤机制的实验研究

目的:探讨败血症休克肝细胞线粒体损伤的机制。方法:30只SD大鼠随机分为3组,假手术组,12h手术组,16h手术组。采用盲肠结扎穿孔术(cecalligationandpuncture)制作败血症休克模型,比较手术前后肝细胞线粒体呼吸功能和氧化磷酸化功能的变化及线粒体膜ATP酶的活性改变与大鼠死亡率和血压变化的关系。结果:12h手术组平均动脉压(9.54±1.26)kPa明显低于假手术组(14.58±1.32)kPa(P<0.05),死亡率明显高于假手术组(P<0.05),12h手术组肝细胞线粒体Ⅲ态(1.28±0.25)、P/O比值(1.67±0.34)、呼吸控制率(1.27±0.25)、线粒体膜Ca²⁺-ATP酶(58.00±2.43)、Na⁺-K⁺-ATP酶(40.80±3.45)、Mg²⁺-ATP酶(78.30±4.16)、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶(2.70±2.25)活性与假手术组相比较,具有显著差异(P<0.05)。术后16h组更低于12h组,与大鼠死亡率增加呈显著正相关。结论:肝细胞线粒体摄氧功能和氧化磷酸化功能减弱,膜流动性降低,能量代谢功能障碍,线粒体内钙镁平衡紊乱是败血症休克肝细胞线粒体损伤的主要机制。     

EGb761增强c-jun表达减少轴突撕脱后运动神经元的死亡

目的:观察EGb761对脊神经根撕脱后前角运动神经元c-jun表达和存活的影响。方法:成年Sprague-Dawley雌性大鼠180只,行脊髓C5-T1节段神经根撕脱术后,每日给予腹腔注射1mLEGb761(25mg·kg^-1),对照组注射同容积的生理盐水。治疗后4h、12h、1d、3d、5d、1周、2周、4周和6周9个时点分别处死动物,取C7脊髓节段行c-jun免疫细胞化学和中性红染色。定量比较两组c-jun阳性和存活的运动神经元数目。结果:对照组损伤侧运动神经元4h开始表达c-jun,1d达高峰,以后逐渐下降至术后2周。术后2周运动神经元开始死亡,4周-6周达高峰。EGb761组各时点c-jun阳性和存活的运动神经元数目都多于对照组。结论:EGb761能有效地减少神经根撕脱后运动神经元的死亡,机制可能与c-jun基因的上调有关。     

血管性血友病因子裂解酶金属蛋白酶域的克隆和表达

目的:克隆和表达血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)的金属蛋白酶域。方法:应用PCR从含有人vWF-cp金属蛋白酶域的质粒中扩增出该区域,克隆至pUC18载体后行序列分析,并将其重组于带有6×HisTag的融合蛋白表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌DE3／plySs中诱导表达。融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,采用Westernblot印迹鉴定。结果:PCR扩增得到658bp的vWF-cp金属蛋白酶域的基因片段,测序结果与GenBank序列一致。重组表达质粒经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导5h后表达的融合蛋白占菌体总蛋白的28％,进一步纯化后其纯度在95％以上。结论:在大肠杆菌中高效表达了人vWF-cp的金属蛋白酶结构域,为深入研究vWF-cp结构与功能的关系奠定了基础。     

钙通道阻滞剂对缺氧右心室心肌钙调神经磷酸酶活性的调控作用

目的:探讨钙调神经磷酸酶(CaN)在大鼠慢性缺氧性右心室肥大中的作用以及L-型钙通道阻滞剂对其的影响。方法:将大鼠置于氧浓度为(10±0.5)%的大型玻璃舱中每天24 h缺氧持续共7 d建立大鼠慢性缺氧模型。实验大鼠分为3组,每组各20只,即正常组、缺氧组、苯磺酸氨氯地平(norvasc)处理组,缺氧组持续缺氧21 d,norvasc处理组在缺氧的同时灌喂norvasc 30 mg·k^-1·d^-1。第21 d每组取10只大鼠分离心脏称重,并测CaN活性水平,另10只取心脏测定心肌细胞[Ca²⁺]_i。结果:(1)缺氧组右室与左室加室间隔的重量比、右室重/体重均明显高于正常组和norvasc处理组(均P＜0.01) 。(2)缺氧组右心室心肌细胞[Ca²⁺]_i 明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。(3)缺氧组右心室心肌CaN活性明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。结论: CaN可能参与了大鼠慢性缺氧性右心室肥大, L-型钙通道阻滞剂可能是通过降低心肌细胞内钙浓度,调控CaN活性而阻滞慢性缺氧右心室肥大。     

抑制Treg联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强阿霉素治疗肝癌效果的实验研究

目的:探讨抑制调节性T细胞(Treg)联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强阿霉素治疗肝癌效果的可行性,并对其机制进行探讨。方法:建立C57BL/6J小鼠皮下肝癌模型,待肿瘤长至100-150mm3时随机分为6组,每组12只:(1)对照组(PBS);(2)环磷酰胺组(CTX);(3)阿霉素组(DOX);(4)Ad.GM-CSF组;(5)CTX+DOX组;(6)CTX+DOX+Ad.GM-CSF组。末次治疗后第5d每组处死其中4只小鼠,取脾脏测定CTL活性;取肿瘤组织行病理检查;每组另外的8只小鼠用于观察皮下肿瘤生长和小鼠生存期。结果:CTX可以显著增强DOX对肿瘤生长的抑制作用(P0.05),延长小鼠生存期[(62.13±4.21)dvs(79.88±9.00)d,P0.05],而联合应用Ad.GM-CSF可显著增强该效果[(79.88±9.00)dvs(106.13±5.23)d,P0.01]。同其它组相比,CTX+DOX+Ad.GM-CSF组小鼠瘤体内可见大量肿瘤细胞坏死,CD8+T细胞浸润显著增加,而小鼠脾脏CTL杀瘤活性显著增强(P0.05)。结论:以阿霉素为治疗基础的化疗联合抑制Treg并瘤内转染Ad.GM-CSF的免疫治疗具有协同抗肝癌作用,免疫化疗治疗晚期肝癌具有一定的应用前景。     

Benextramine逆转神经肽Y下调人血管平滑肌细胞LDL-R的表达

目的:探讨benextramine对神经肽Y(NPY)人血管平滑肌细胞(hVSMC)低密度脂蛋白受体(LDL-R)表达影响的逆转作用。方法:应用荧光免疫组化和激光扫描共聚焦显微技术,定量检测hVSMC的LDL-R表达的变化。Benextramine(B组)浓度设为10^-5mol/L,NPY设10^-8mol/L(N1组)、10^-7mol/L(N2组)、10^-6mol/L(N3组)和10^-5mol/L(N4组)4个浓度,培养时间分别为6、12、24和48h。结果:对照组LDL-R表达的平均荧光值较高,介于2564-2649之间,且各时段间均无显著差异(P>0.05)。各NPY组LDL-R表达的平均荧光值均明显低于对照组和各benextramine组(P<0.05),介于1639-2512之间,其荧光值随NPY浓度增加而下降,N1-N4组分别平均下降15.64%、20.31%、22.58%和27.42%,呈现一定的剂量依赖效应;同时其荧光值也随NPY作用时间的延长而下降,在6、12、24和48h时间段分别平均下降11.24%、21.29%、23.04%和30.38%,亦呈现一定的时间依赖效应。各benextramine组(包括B组、B+N1组、B+N2组、B+N3组及B+N4组)的LDL-R表达荧光值介于2554-2631之间,与对照组间差异无显著(P>0.05),且与NPY作用浓度及时间无关(P>0.05)。结论:NPY能导致hVSMC的LDL-R表达下降,benextramine可逆转该作用。     

地塞米松或茶碱对血小板活化因子诱导的嗜酸性粒细胞活化的影响

目的:血小板活化因子(PAF)可诱导嗜酸性粒细胞(EOS)脱颗粒产生低密度嗜酸性粒细胞(HE),本研究旨在探讨地塞米松、茶碱对上述过程产生的影响。方法:分离正常人外周血EOS,观察不同密度EOS的组织学差别,测定地塞米松、茶碱对PAF诱导的EOS脱颗粒和正常密度EOS(NE)向低密度EOS(HE)转化的影响。结果:低密度嗜酸性粒细胞颗粒缩小;10^-5mmol/L地塞米松或10mg/L茶碱可使17.87%±2.16%或14.08%±2.42%的正常密度嗜酸性粒细胞转化为低密度嗜酸性粒细胞,与血小板活化因子组比较差异显著(P<0.05,P<0.01);同样浓度的地塞米松和茶碱分别使PAF诱导的嗜酸性粒细胞过氧化物酶的释放量下降至(101.17±10.32)mg/L、(110.85±4.16)mg/L及(100.53±9.65)mg/L、(106.94±10.11)mg/L(P<0.05,P<0.01)。结论:EOS脱颗粒是HE产生的原因之一;地塞米松、小剂量茶碱可以抑制PAF对EOS的活化,这可能是它们抗炎作用的机制之一。     

褪黑素对电离辐射诱导小鼠淋巴细胞凋亡的影响

目的:探讨褪黑素(MLT)对电离辐射诱导小鼠胸腺细胞和脾细胞凋亡的影响及其机制。方法:采用流式细胞术(FCM)和荧光分光光度法分别检测离体和在体小鼠淋巴细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率。结果:在离体研究中,小鼠胸腺和脾淋巴细胞体外接受(0.5-6.0)Gy X射线照射前预先加入2 mmol/L MLT,细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率均显著低于单纯照射组,胸腺和脾淋巴细胞凋亡小体百分率分别为单纯照射组的86.25％和89.44％,DNA裂解率分别为单纯照射组的87.23％和89.16％。在体研究中,2 Gy X射线全身照射前60 min腹腔注射MLT,小鼠胸腺和脾淋巴细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率显著低于单纯照射组,接近或低于假照水平,MLT剂量在0.1-2.5 mg／kg范围内均有作用,但无明显剂量依赖性。结论:MLT在体内和体外均可减轻电离辐射诱导的小鼠淋巴细胞损伤,且体内比体外作用更明显。     

狼疮肾炎患者外周血单个核细胞IL-17信号转导途径的初步研究

目的:了解IL-17及其信号转导成分JNK活化状态在狼疮肾炎(LN)发病机制中作用。方法:活动期LN病人15例,分离、培养外周血单个核细胞(PBMC);ELISA法检测上清液IL-6蛋白水平;逆转录多聚酶链反应法检测IL-6mRNA水平;蛋白印迹法检测JNK活性。结果:IL-17刺激下,LN患者PBMC反应性明显增强,各浓度点IL-6蛋白水平明显高于正常对照(均P<0.05)。LN患者PBMCIL-6mRNA表达水平明显高于对照组(无刺激培养:1.80±0.11vs0.36±0.07,P<0.01;刺激培养:3.21±0.24vs1.30±0.14,P<0.05);正常对照或LN患者刺激培养组PBMCIL-6mRNA表达水平均明显高于其无刺激培养组(对照:1.30±0.14vs0.36±0.07,P<0.05;LN患者:3.21±0.24vs1.80±0.11,P<0.01)。LN患者PBMCJNK活性水平明显高于对照组(无刺激培养:3.21±0.32vs1.00,P<0.01;刺激培养:4.82±0.39vs1.21±0.35,P<0.01);LN患者的刺激培养组PBMCJNK活性水平明显高于LN对照培养组(4.82±0.39vs3.21±0.32,P<0.01)。活动性LN病人PBMCJNK活性高低与其SLEDAI和IL-6mRNA水平均呈显著正相关。结论:IL-17介导LN患者PBMC过度表达、分泌IL-6可能是其参与LN的发病机制之一,JNK的活化在IL-17信号转导中具有重要作用。     

重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响

目的: 构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法: 将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF 病毒颗粒。按照10⁵v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: 通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48 h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P＞0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl₂组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl₂+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl₂+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论: 成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。