汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化

目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrap~(TM) HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。     

宿主蛋白LSml-7复合体在登革病毒RNA复制中的作用研究

目的探讨LSml-7复合体在登革病毒（DENV）RNA复制中的作用。方法DENV感染HepG2细胞后．在不同时间点（2、24、36、48h）收集细胞和提取总mRNA,实时定量PCR（RT-qPCR）分析LSml表达水平;将LSml的siRNA和非特异对照siRNA两次转染HepG2细胞后感染DENV-2,24h后收集细胞,提取总mRNA,RT-qPCR分析LSml表达水平与病毒RNA表达水平;利用LSml抗体与dsRNA抗体对DENV感染细胞进行免疫荧光染色,激光共聚焦分析LSml与dsRNA共定位情况。结果与2h比较,随着时间的推移,DENV-2RNA和LSmlRNA水平逐渐升高;与对照组siNC比较,siLSml组LSmlRNA水平明显降低,沉默效率达78．2％;与对照组siNC比较,siLSml组DENVRNA含量降低35．6％：LSml-7复合体在DENV感染HepG2细胞后募集到核周围,与DENVdsRNA共定位。结论LSml-7复合体可能作为DENV复制复合物的组成部分,正调控DENVRNA的复制。     

西安地区14 094名育龄妇女TOX、RV、CMV和 HSVI/II感染的流行病学特征分析

目的 了解西安地区育龄妇女TORCH感染的流行病学特征,为优生优育提供参考依据。方法 应用化学发光免疫法检测14094名育龄妇女TORCH抗体IgM和IgG,从季节、年龄、户籍等方面进行流行病学分析,采用SPSS 20.0软件对数据进行卡方（χ2）检验。结果 TORCH - IgG阳性率大于80%的病毒为CMV（90.90%）、RV（83.59%）、HSV I（82.95%）。TORCH - IgM阳性率分别为 CMV（2.31%）、RV（1.42%）、HSV I（0.22%）、HSV II（0.15%）、TOX（0.12%）。不同年龄组TOX - IgM（χ2 = 8.20,P = 0.017）、CMV - IgM（χ2 = 7.55,P = 0.023）、HSV II - IgM（χ2 = 6.74,P = 0.034）阳性率差异有统计学意义;不同季节组RV - IgM（χ2 = 10.40,P = 0.015）阳性率差异有统计学意义;不同户籍组TOX - IgM（χ2 = 5.13,P = 0.024）、CMV - IgM（χ2 = 5.28,P = 0.022）阳性率差异有统计学意义。结论 RV和HSV I对西安地区育龄妇女威胁较小,而TOX、HSV II和CMV威胁较大;其中,年龄因素影响TOX、CMV、HSV II感染,季节因素影响RV感染,户籍因素影响TOX、CMV感染,因此,为进一步降低新生儿出生缺陷率,需加强该地区育龄妇女TORCH感染筛查。     

膜联蛋白A2在登革病毒Ⅱ型入胞过程中作用的初步研究

目的　探讨膜联蛋白A2（annexin A2, ANXA2）在登革病毒Ⅱ型（dengue virus type Ⅱ, DENV-2）入胞过程中的作用。方法　通过敲低ANXA2和S100钙结合蛋白A10（S100A10）表达以及抗体阻断实验验证ANXA2在DENV-2复制周期中的作用,并进一步通过激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀分析明确ANXA2与DENV-2 E蛋白的相互作用。结果　DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的细胞中,DENV-2 RNA水平显著降低;ANXA2抗体和DENV-2 E蛋白抗体可有效抑制DENV-2的入胞效率,细胞内病毒RNA水平显著低于对照组;此外,ANXA2在DENV-2感染细胞中由细胞质募集到细胞膜上,与DENV-2 E蛋白有相互作用。结论　ANXA2是DENV-2入胞过程中重要的宿主分子,有望为抗DENV-2研究提供新的靶点。     

膜联蛋白A2在登革病毒Ⅱ型入胞过程中作用的初步研究

目的探讨膜联蛋白A2(annexin A2, ANXA2)在登革病毒Ⅱ型(dengue virus typeⅡ, DENV-2)入胞过程中的作用。方法通过敲低ANXA2和S100钙结合蛋白A10(S100A10)表达以及抗体阻断实验验证ANXA2在DENV-2复制周期中的作用,并进一步通过激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀分析明确ANXA2与DENV-2 E蛋白的相互作用。结果 DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的细胞中,DENV-2 RNA水平显著降低;ANXA2抗体和DENV-2 E蛋白抗体可有效抑制DENV-2的入胞效率,细胞内病毒RNA水平显著低于对照组;此外,ANXA2在DENV-2感染细胞中由细胞质募集到细胞膜上,与DENV-2 E蛋白有相互作用。结论 ANXA2是DENV-2入胞过程中重要的宿主分子,有望为抗DENV-2研究提供新的靶点。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

宿主蛋白LSm1-7复合体在登革病毒RNA复制中的作用研究

目的 探讨LSm1-7复合体在登革病毒(DENV)RNA复制中的作用.方法 DENV感染HepG2细胞后,在不同时间点(2、24、36、48 h)收集细胞和提取总mRNA,实时定量PCR (RT-qPCR)分析LSm1表达水平;将LSm1的siRNA和非特异对照siRNA两次转染HepG2细胞后感染DENV-2,24h后收集细胞,提取总mRNA,RT-qPCR分析LSm1表达水平与病毒RNA表达水平;利用LSm1抗体与dsRNA抗体对DENV感染细胞进行免疫荧光染色,激光共聚焦分析LSm1与dsRNA共定位情况.结果 与2h比较,随着时间的推移,DENV-2 RNA和LSm1 RNA水平逐渐升高;与对照组siNC比较,siLSm1组LSm1 RNA水平明显降低,沉默效率达78.2％;与对照组siNC比较,siLSm1组DENV RNA含量降低35.6％;LSm1-7复合体在DENV感染HepG2细胞后募集到核周围,与DENV dsRNA共定位.结论 LSm1-7复合体可能作为DENV复制复合物的组成部分,正调控DENV RNA的复制.