姜黄素抑制多药耐药肝癌细胞HepG2/ADM的增殖及其机制研究

目的 观察姜黄素对多药耐药(MDR)的肝癌细胞株HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用及其机制.方法 制备、培养HepG2/ADM细胞,然后用不同浓度的姜黄素(5、10、20、40 mol/L)处理该细胞24、48、72 h.采用CCK-8试剂检测姜黄索对HepG2/ADM细胞的增殖活力的影响.流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(R-123)的浓度和阿霉素(ADM)的浓度;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内mdr-1 mRNA的水平变化;用Western blot检测细胞内p-糖蛋白(pgp)水平的变化.结果 与空白对照组和DMSO组相比,姜黄素对HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用更加明显(P＜0.05);更能够明显抑制细胞内Rh123的外排(P＜0.05);RT-PCR和Western blot结果分别显示,姜黄素对HepG2/ADM细胞内的mdr-1 mRNA和P-gp水平更有明显的降低(P＜0.05),且呈浓度-时间依赖性(P＜0.05).结论 姜黄素可以显著抑制多药耐药HepG2/ADM细胞的增殖,其机制可能与抑制和MDR密切相关的mdr-1基因及其编码的P-gp水平有关.     

Synergistic effect of hyperthermia and neferine on reverse multidrug resistance in adriamycin-resistant SGC7901/ADM gastric cancer cells

Multidrug resistance(MDR) plays a major obstacle to successful gastric cancer chemotherapy.The purpose of this study was to investigate the MDR reversal effect and mechanisms of hyperthermia in combination with neferine(Nef) in adriamycin(ADM) resistant human SGC7901/ADM gastric cancer cells.The MDR cells were heated at 42℃ and 45℃ for 30 min alone or combined with 10 μg/mL Nef.The cytotoxic effect of ADM was evaluated by MTT assay.Cellular plasma membrane lipid fluidity was detected by fluorescence polarization technique.Intracellular accumulation of ADM was monitored with high performance liquid chromatography.Mdr-1 mRNA,P-glycoprotein(P-gp),γH2AX expression and γH2AX foci formation were determined by real-time PCR,Western blot and immunocytochemical staining respectively.It was found that different heating methods induced different cytotoxic effects.Water submerged hyperthermia had the strongest cytotoxicity of ADM and Nef combined with hyperthermia had a synergistic cytotoxicity of ADM in the MDR cells.The water submerged hyperthermia increased the cell membrane fluidity.Both water submerged hyperthermia and Nef increased the intracellular accumulation of ADM.The water submerged hyperthermia and Nef down-regulated the expression of mdr-1 mRNA and P-gp.The water submerged hyperthermia could damage DNA and increase the γH2AX expression of SGC7901/ADM cells.The higher temperature was,the worse effect was.Our results show that combined treatment of hyperthermia with Nef can synergistically reverse MDR in human SGC7901/ADM gastric cancer cells.     

多药耐药mdr-1基因体外转染兔骨髓造血细胞及其表达与功能的研究

目的：探讨浓缩病毒上清转染法在体外将多药耐药mdr—1基因转入兔骨髓造血细胞的条件及检测转染后mdr—1基因在兔骨髓造血细胞中的表达及功能。方法：用秋水仙碱(90ng／ml)筛选含人类全长mdr—1cDNA的产病毒包装细胞PA317—HaMDR1／A1后进行细胞培养并制备浓缩病毒上清。采集新西兰大白兔骨髓并分离富含造血细胞的单个核细胞。骨髓造血细胞与浓缩病毒上清及细胞因子组合共培养。采用免疫组织化学法检测转染率，PCR法检测外源性mdr—1基因的整合，柔红霉素(daunorubicin DNR)泵出试验检测导入的mdr—1基因的功能。结果：秋水仙碱筛选后，产病毒包装细胞P糖蛋白(P-g;ucp[rpteom P-gp)表达增强：外源性mdr—1基因能成功的导入兔骨髓造血细胞，转染2日、4日、6日的转染率分别为22％、37％、39％，但转染4日组细胞生长状态最好；转入的mdr—1基因能发挥药物外排泵的功能。结论：采用浓缩病毒上清转染法能成功的将外源性mdr—1基因导人兔骨髓造血细胞中并获得稳定的功能性表达，为进一步研究mdr—1基因转染骨髓造血细胞后自体回输在大剂量化疗中对骨髓保护作用的研究提供了依据。     

急性髓系白血病细胞株APP表达及APP—siRNA对HL60细胞的沉默作用

目的：研究淀粉样前体蛋白（APP）基因在HL60、HL60／ADM、U937和kasumi-1细胞株中的表达及筛选针对APP基因的有效干扰片段。方法：采用荧光定量PCR和Western blot方法分别检测APP基因在4种细胞株中的mRNA和蛋白表达。用化学法合成4条针对APP的干扰片段和一条阴性对照,脂质体法转染HL60细胞,分别用定量PCR和Western blot检测APP表达。结果：在4种细胞株中,APP mRNA和蛋白表达由高到低依次为：kasumi-1、HL60、HL60／ADM和U937,kasumi-1和HL60均显著高于HL60／ADM、U937（P〈0．05）。同阴性对照相比较,4条干扰片段均能不同程度地抑制APP表达,其中siRNA-4效果最佳,APP mRNA和蛋白分别下降了约64％和65％。结论：APP基因在不同AML细胞株中表达差异显著。siRNA-4的干扰效果最佳。     

多元药物抗性基因(mdr-1)在白血病细胞中的表达

多元药物抗性基因(multidrug resistance gene,mdr-1)编码 P 170膜蛋白,可使细胞对多种结构不同的细胞毒药物产生抗性。本文以 mdr-1 cDNA为探针,做白细胞总 RNA 斑点杂交分析了5例髓性白血病人mdr-1的mRNA水平。说明mdr-1基因在此类患者的白细胞中的表达有明显差异,同一病人治疗前后也有改变。所建立的观查临床标本中基因表达水平的方法,具广泛的应用价值。     

三羟异黄酮对人乳腺癌耐药细胞mdr-1、HER2/neu表达的影响

目的研究三羟异黄酮(Genistein,GEN)对体外培养人乳腺癌MCF-7/ADM耐药细胞中mdr-1、HER2/neu基因及蛋白表达的影响,探讨其逆转多药耐药机制。方法采用MTT法检测GEN作用MCF-7/ADM细胞后的细胞增殖抑制率(IR)和半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测MCF-7/ADM细胞经不同浓度阿霉素(ADM)、GEN及GEN联合ADM处理后,其mdr-1、HER2/neu mRNA表达的变化;Western blot检测其对c-erbB2蛋白及P-糖蛋白(P-gp)的影响。结果 GEN对MCF-7/ADM细胞生长抑制作用明显,其抑制效应呈时间-剂量依赖性,特别是GEN浓度增加到60μg/mL时,对细胞抑制作用急剧升高(P<0.01)。MCF-7/ADM细胞中有mdr-1、HER2/neu过量表达,经GEN单独及联合ADM作用后,HER2/neu mRNA表达明显下调,c-erbB2蛋白出现一致性的表达下调,但对mdr-1mRNA及P-gp无影响。结论人乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药性与耐药基因及原癌基因的高表达相关,GEN能下调MCF-7/ADM细胞HER-2/neu基因及蛋白表达,可能是其逆转MCF-7/ADM细胞多药耐药性的机制之一,但对由P-gp介导的多药耐药无效。     

红霉素对人类白血病细胞系CCRF-CEM/VLB100耐药性逆转作用的研究

本文报告,亲脂性抗生素红霉素在体外培养条件下,成功地逆转了人类淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM/VLB100对长春花碱的耐药性。免疫荧光检测证实,耐药细胞膜上有P-糖蛋白高表达,阳性率为94％;敏感细胞则无P-糖蛋白表达。耐药细胞经红霉素作用后,P-糖蛋白阳性半降至30％以下。据此认为,红霉素使耐药细胞膜上P-糖蛋白表达降低,阻断了耐药细胞泵出药物的功能,可能是其逆转耐药性的基础。我们首次将红霉素用于人类白血病细胞系,对耐药性逆转作用的实验研究及临床应用均有积极的意义。     

mdr—1基因转移可提高肺癌细胞对阿霉素的抗性

以逆转录病毒介导，将人全长mdr-1cDNA导入人肺腺癌细胞系GLC82中，经G418和阿霉素筛选，挑选出3个阳性克隆。用mdr-1cDNA的一种特异引物在3个克隆中都扩增到1条167bp的带，表明mdr-1基因cDNA已稳定地整合在染色体基因组中。原位杂交显示转染细胞的mdr-1转录升高，免疫细胞化学发现转染细胞中P170糖蛋白呈弱阳性。MTT药敏实验表明3个克隆对阿霉素的抗药性分别是GLC细胞的6.4、7.0和8.8倍。提示在mdr-1基因cDNA转染的细胞中，mdr-1基因低表达足以大大提高细胞对药物的耐受性。     

人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的建立及耐药相关基因表达检测

目的：建立人肝癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性及机制。 方法：应用人肝癌细胞株BEL-7402,采用阿霉素（ADM）大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系BEL-7402/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH／GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。 结果：BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对ADM的耐药性(半数抑制浓度,IC₅₀)提高了17.31倍。流式细胞仪分析发现（65.5±5.8）%的BEL-7402/ADM细胞表面P-gp 表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（31.3±4.3）%;（32.4±3.5）%的BEL-7402/ADM细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（23.4±3.1）%,二者差异有显著性(P<0.01);BEL-7402/ADM和BEL-7402细胞的GSH／GST表达无明显变化（P>0.05）。RT-PCR检测发现BEL-7402/ADM中MDR及MRP mRNA高表达。 结论：BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR及MRP mRNA表达升高。     

ADM诱导人肝癌细胞株多重抗药性的形成

目的：建立人肝癌耐药细胞模型,研究其多药耐药机制。方法：对人肝癌细胞株BEL－7404采用阿霉素浓度递增法及高浓度间歇诱导法,建立人肝癌耐药细胞BEL－740／ADM,用MTT法检测其检测其耐药性,用免疫细胞化学法检测细胞p-糖蛋白（p-gp)及多药耐药相关蛋白（MRP）的表达,结果：用此方法建立的肝癌耐药细胞模型BEL－7404／ADM经MTT法检测其对阿霉素的IC50较亲本细胞BEL－7404增加100倍,并对多种抗癌药物产生交叉耐受性。细胞p-gp及MRP表达较亲本细胞有显著增加（P＜0．01）,p-pg阳性率为68．7％,MRP阳性率为53．5％,结论：BEL－7404／ADM是一个多药耐药模型,其多药耐药性与p-gp、MRP高度表达有关。     

EGCG逆转人耐药肝癌细胞株多药耐药的体内实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)体内逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用及可能的机制.方法:MTT法检测肝癌耐药细胞株BEL-7404/ADR与其亲本细胞BEL-7404耐药倍数,采用BEL-7404/ADR种植于裸鼠皮下,建立肿瘤耐药模型,两周后EGCG灌胃,腹腔注射阿霉素(ADM),联合治疗两周;荧光分光光度法检测瘤体内ADM含量,HE染色观察形态学改变;RT-PCR检测瘤组织mdr1 mRNA的表达,免疫组化法检测瘤组织P糖蛋白(P-gp)的表达.结果:低、中、高EGCG联合ADM组肿瘤生长速度明显低于ADM组,瘤重明显低于阿霉素组;EGCG联合ADM可增加瘤体内ADM的含量 (P<0.01);三个EGCG联合 ADM组与阿霉素组相比HE病理图片显示肿瘤组织纤维包裹,炎细胞浸润; mdr1 mRNA和P-gp的表达明显低于对照组和阿霉素组 (P<0.01).结论:EGCG在体内具有逆转BEL-7404/ADR的耐药作用,机制可能是EGCG下调了肝癌细胞mdr1基因的表达,使P-gp的表达降低,瘤组织内药量增高.     

Establishment of multidrug-resistance cell line C6/adr and reversal of drug-resistance

Objective To investigate the mechanism of multidrug resistance (MDR) in a human glioma cell and methods for overcoming multi-drug resistance.Methods MDR cell line C［6］/adr was established. The expression of the mdr-1 gene and its P-glycoprotein (P-gp) in the C［6］/adr cell line was observed by RT-PCR and flow cytometry. The reversal of MDR by verapamil, erythromycin, dihydropyridine, P-gp monoclonal antibody and Salvia miltiorrhiza (SM) was studied by microtiter tetrazolium (MTT) assay or by high performance liquid chromatographic assay.Results The mdr-1 gene of the C［6］/adr cell line was positive, over-expressing P-gp. The drug-resistance of the C［6］/adr cell lines could be partly reversed by 2-6μg/ml of verapamil, 50-100μg/ml of erythromycin, or 5μg/ml of dihydropyridine. As concentration increased, they had a better effect. Among these drugs, 100μg/ml of erythromycin had the best result of reversal. Dihydropyridine 1μg/ml, P-gp monoclonal antibody and SM had no effect.Conclusion The mdr-1 gene and its expression might be associated with the MDR of glioma cells. Verapamil, erythromycin and dihydropyridine could reverse the MDR of glioma cells.     

83例大肠癌多药耐药基因的检测

目的：研究复发及多源发大肠癌多药耐药基因的表达。方法：采用逆转录－多聚酶链式反应（RT－PCR）技术对83例大肠癌多药耐药（mdr-1)基因进行了检测。结果：原发大肠癌mdr-1基因表达率30．9％（12／42）,复发大肠癌mdr-1基因表达率61．3％（19／31）,两者有显著差异（P＜0．05）。多源发大肠癌mdr-1基因阳性表达率60％（6／10）。mdr-1基因表达的阳性和阴性与耐药与否的总符合率达10＋16／31（P＜0．05）。结论：大肠癌组织mdr-1基因的表达水平,这对正确判断病人耐药能力的高低,合理术后化疗,判断预后都具有重要意义。     

川芎嗪对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响

目的观察川芎嗪（TMP）对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）表达的影响,研究TMP对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM的逆转机制。方法将人肝癌细胞耐药株BEL-7402/ADM及其亲本细胞BEL-7402分为：亲本组、耐药组、逆转组（耐药＋TMP）、阳性对照组（耐药＋维拉帕米）、二抗阴性对照组,用免疫组化SABC法和流式细胞术对照观察TMP对BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响。结果流式细胞术结果显示耐药组显著高于亲本组（P〈0.01）;耐药＋TMP组和耐药＋维拉帕米组均显著低于耐药组和亲本组（P〈0.01）。免疫组化SABC法显示耐药组P-gp阳性表达率显著高于亲本组（P〈0.01）;TMP组、维拉帕米组的P-gp阳性表达率显著低于耐药组（P〈0.01）。结论 TMP能显著降低人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM细胞表面P-gp的表达,增加阿霉素等化疗药物对BEL-7402/ADM的细胞毒性作用,从而增加对肿瘤细胞的抑制率,提高化疗疗效。     

Reversal effect of bufalin on multidrug resistance in K562/VCR vincristine-resistant leukemia cell line

ObjectiveTo probe insights into the reversal effect of bufalin on vincristine-acquired multidrug resistance (MDR) in human leukemia cell line K562/VCR.MethodsProliferative inhibition rate and the reversal index (RI) of bufalin were determined by Methyl thiazolyl tetrazolium assay. The uptake of Adriamycin (ADM) in K562/VCR cells, cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM). Cell morphologic changes were observed with Wright-Giemsa staining. The expression of P-glycoprotein (P-gp), multidrug-associated protein-1 (MRP1), Bcl-xL and Bax protein were measured by immunocytochemistry.ResultsThe human leukemia multidrug resistant K562/VCR cells showed no cross-resistance to bufalin. The RIs of bufalin at concentrations of 0.0002, 0.001 and 0.005 μmol/L were 4.85, 6.94 and 14.77, respectively. Preincubation of 0.001 μmol/L bufalin for 2 h could increase intracellular ADM fluorescence intensity to 28.07% (P<0.05) and down-regulate MRP1 expression simultaneously, but no remarkable effect was found on P-gp protein. Cell cycle analysis indicated increased apoptosis rate and apparent decreased G2/M phase proportion after treatment with bufalin. When exposed to 0.01 μmol/L bufalin, typical morphological changes of apoptosis could be observed. Down-regulation of Bcl-xL and up-regulation of Bax expression in K562/VCR cells could be detected by immunocytochemistry.ConclusionBufalin could partly reverse the MDR of K562/VCR cells, with a possible mechanism of down-regulating MRP1 expression and activating apoptosis pathway by altering Bcl-xL/Bax ratio.     

PDTC逆转K562/AO2细胞多药耐药性机制研究

目的研究核因子κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）逆转K562/AO2细胞耐药效应及其机制。方法采用MTT比色法分别检测K562/AO2细胞的耐药性、PDTC对K562/AO2细胞增殖的影响以及非细胞毒剂量PDTC、维拉帕米（Ver）预作用后K562/AO2细胞药物敏感性的变化,采用免疫细胞组织化学法、RT-PCR检测K562、K562/AO2细胞NF-κB、mdr-1 mRNA表达水平以及PDTC作用一定时间对其影响。结果①K562/AO2细胞对阿霉素（ADM）的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后,ADM对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低,相对逆转耐药效率为93.03%,强于经典耐药逆转剂Ver的作用81.07%（P〈0.01）;②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞（P〈0.01）;PDTC可有效抑制K562/AO2细胞NF-κB表达,伴随mdr-1 mRNA表达减少,呈时间依赖性。结论抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO细胞耐药性,其机制与mdr-1 mRNA转录表达减少有关。     

无血清培养联合多柔比星诱导A549细胞耐药

目的： 探索快速建立肺癌耐药细胞模型的新方法,并探讨肺癌耐药和干细胞的相关性。方法： 应用无血清培养联合药物筛选法建立肺腺癌细胞耐药株A549/ADM;MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、ABCB1和ABCG2的表达水平及细胞内多柔比星的浓度;细胞免疫荧光及流式细胞仪通过特异性表面抗原标记法（CD133）检测肿瘤干细胞含量。裸鼠皮下种植瘤试验评估A549/ADM的致瘤性。结果： A549细胞经无血清培养可见细胞球形成;A549/ADM细胞对多柔比星、长春新碱、紫杉醇均产生了耐药,其耐药指数分别为A549的13.167,12.86,3.4倍;与亲代A549相比, 耐药株A549/ADM S期细胞比例由(45.76±1.41)% 降低至(23.33±1.32)%,细胞凋亡百分率由(58.23±0.82)% 减少至(16.49±0.77)%;耐药株A549/ADM中ABCB1和ABCG2的表达水平明显增高(P<0.05),且细胞内多柔比星浓度明显低于A549细胞; CD133细胞在A549/ADM和A549中的比例分别为(6.2±0.7)％和(1.9±0.2)％(P<0.05),免疫荧光检测A549/ADM细胞CD133表达水平较A549细胞高;A549/ADM具有高致瘤性。结论： 无血清培养联合多柔比星诱导能高效富集肺癌干细胞,成功建立了人肺腺癌A549/ADM多药耐药细胞模型。     

急性白血病一氧化氮合酶表达与多药耐药的关系

目的：探讨急性白血病（AL）患者NOS表达与Pgp/mdr-1的关系。方法：采用免疫组织化学法检测iNOS,eNOS,Pgp表达;RT-PCR检测iNOS基因,mdr-1基因表达。结果：AL患者NOS表达较对照升高, iNOS与Pgp/mdr-1基因表达之间呈高度正相关（r=0.680,P<0.01）。结论：NO对AL多药耐药可能有一定影响。     

人膀胱癌耐药细胞系T24/ADM的建立及其耐药机制

目的建立人膀胱癌耐药细胞系,对其耐药机制进行初步探讨。方法采用阿霉素浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系T24/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,应用RT-PCR和Western blot比较两种细胞P-GP、MRP和LRP的表达差异来探讨可能的耐药机制。结果建立了T24/ADM耐药细胞系,对ADM、VCR和VP16有交叉耐药,P-GP、MRP和LRP在耐药细胞系中表达升高。结论 T24/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因表达升高是T24/ADM获得耐药的主要机制之一。     

MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态与多药耐药的关系

目的：分析MCF-7/Adr及MCF-7细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态,初步探讨乳腺癌多药耐药的表观遗传机制。 方法：用甲基化敏感PCR技术检测两个细胞系mdr-1基因启动子甲基化状态。实时定量PCR技术检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs) mRNA及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs) mRNA的表达。光密度值法检测组蛋白H3和H4乙酰化水平。 结果：MCF-7细胞mdr-1基因启动子呈现高甲基化,MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子呈现低甲基化。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞DNMT1,DNMT3a及DNMT3b mRNA表达显著下降(P＜0.05)。MCF-7/Adr细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平较MCF-7细胞明显升高(P＜0.01)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞HDAC1,HDAC2,HDAC7及SIRT1 mRNA的表达显著下降(P＜0.01)。 结论：mdr-1基因启动子低甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化、DNMTs mRNA及HDACs mRNA低表达可能是介导MCF-7/Adr细胞MDR形成的重要表观遗传学因素。