SSH法获取大鼠小脑特异表达cDNA片段

目的获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,比较SSH方法的特点。方法以大鼠大脑和脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为Tester(测试)cDNA,经抑制性消减杂交法,去除与大脑及脑干相同的cDNA,从而获得大鼠小脑特异表达基因.然后克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库.结果经消减杂交、克隆,挑选出32个阳性质粒.最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段.同时,将测序结果进行同源性比较,发现其中6个cDNA是新EST序列.结论用SSH方法筛选差异表达序列非常有效,特异表达序列分析有助于从分子水平探讨小脑功能.     

成年大鼠小脑差异表达基因的克隆

目的 分析成年大鼠小脑基因与新生大鼠小脑基因的差异表达并获取新的表达序列标签。方法 成年大鼠小脑来源的cDNA为受检者（tester）,新生大鼠小脑的cDNA为驱动者（driver）,进行差减杂交,经克隆、获得成年大鼠小脑差减杂交为。结果 共挑选出54个阳性克隆质粒,测序得到56个不同基因片段序列,其中有16个是大鼠中首次测得的表达序列标签,并被GenBank收录（BG946773～BG946788）。结论 用差减杂交法建立差异表达基因文库可快速筛选未知表达序列标签。     

川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织,提取总RNA,逆转录cDNA,进行SSH构建消减文库获得序列标签,与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库,测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较,获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,初步筛选胃癌部分表达基因,为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。     

应用抑制性消减杂交筛选失血性休克所致大鼠心肌差异表达基因

目的：失血性休克可导致大鼠心肌的缺血，缺氧，进而对心肌细胞造成严重损伤，本实验将利用抑制性消减杂交技术（Suppression subtractive hybridization SSH)研究失血性休克大鼠心肌的差异表达基因，以期通过基因线索寻找其损伤机制，方法：建立失血性休克大鼠模型，选其心肌，提取总RNA，构建cDNA文库，应用抑制性消减杂交技术筛选其差异表达基因，通过反向Northern杂交验证差异表达基因阳性克隆，并进行测序分析，登陆Genbank寻找同源性基因。结果：获得42个阳性结果，25个为高表达基因，17个为低表达基因，其中发现5个新的cDNA片段，结论：SSH技术是一种高效的筛选差异基因的方法，本实验发现失血性休克可导致大鼠45S rDNA基因转录起始区域，鼠半胱氨酸富含蛋白61及鼠血清诱导激酶等基因的差异表达，今后的工作中我们将进一步研究它们与失血性休克所致损伤的关系。     

应用抑制消减杂交技术构建耐多药结核杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库,进一步探索结核杆菌耐多药的分子机制。方法：以耐多药菌株cDNA为实验组（Tester）,敏感株cDNA为驱动组（Driver）应用抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridiza－tion,SSH）技术结合T/A克隆技术构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库。结果：成功构建了耐多药结核菌株差异表达消减cDNA文库,获得113个差异表达cDNA片段。结论：研究表明SSH技术是筛选新功能基因的有效方法;多种已知或未知基因均参与了结核杆菌耐多药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础。     

辐射抗性小鼠与其亲代差异基因的表达序列标签

目的寻找IRM-2小鼠体内存在的与辐射抗性相关的基因。方法提取IRM-2小鼠和其亲代小鼠脾细胞总RNA,利用mRNA差异显示技术挑选差异表达片段,对每一条差异带进行特异PCR扩增、克隆和测序。结果获得IRM-2小鼠独有而亲代小鼠均无的cDNA差异带75条,经测序获得52条差异cDNA序列。与GenBank基因库同源性比较,得到21条与小鼠已知基因不同源的表达序列标签（EST）。结论21条EST提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

应用抑制消减杂交（SSH）克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异性表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验组。肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照组,应用抑制消减杂交技术,构建实验组特异表达cDNA消减文件;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序序和同源性分析（Genebank）。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDPP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDPP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片断与已知基因有96%～100%的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...     

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

高、低正加速度耐力大鼠脑组织差异表达基因的分离

目的:分离高、低正加速度耐力大鼠脑组织差异表达的cDNA片段,以获得耐力相关基因.方法:雄性SD大鼠在离心机上处理后,选取耐受终点在高、低两个极端的动物,立即取全脑,分离mRNA.以高+Gz耐力大鼠脑组织mRNA为实验组,以低+Gz耐力大鼠脑组织mRNA为驱动组,采用抑制消减杂交技术分离高、低+Gz耐力大鼠脑组织中差异表达的cDNA片段混合物,然后将此混合物与pGEM-T easy载体连接,转化E.coli JM109感受态细胞.结果:初步获得了608个可能在高+Gz耐力大鼠脑组织中上调表达的cDNA片段.这些cDNA片段长度介于150～1 400 bp之间,集中于300～700 bp.结论:在高、低+Gz耐力大鼠脑组织中差异表达的cDNA片段所代表的基因为+Gz耐力相关基因,这些基因的上调表达可能与+Gz耐力的提高有关.     

IDENTIFICATION OF DIFFERENTIAL GENES IN OVARIAN CANCER USING REPRESENTATIONAL DIFFERENCE ANALYSIS OF cDNA

Objoctive To identify differential genes between normal ovarian epithelium tissue and ovarian epithelial cancer using representational difference analysis of cDNA （cDNA-RDA）. Methods cDNA-RDA was performed to identify the differentially expressed sequences between cDNAs from cancer tissue and cDNAs from normal ovarian tissue in the same patient who was in the early stage of ovarian serous cystadenocarcinoma. These differentially expressed fragments were cloned and analyzed, then sequenced and compared with known genes. Results Three differentially cxpressed cDNA fragments were isolated using cDNA from normal ovarian tissue as tester and cDNA from cancer tissue as driver amplicon by cDNA-RDA. DP Ⅲ- 1 and DP Ⅲ-2 cDNA clone showed significant homology to the cDNA of alpha actin gene; DPⅢ-3 cDNA clone showed significant homology to the cDNA oftransgelin gene. Conclusion cDNA-RDA can bc used to sensitively identify the differentially expressed genes in ovarian serous cystadenocarcinoma. Ovarian serous cystadenocarcinoma involves alteration of multiple genes.     

应用抑制消减杂交技术筛选颞叶癫痫的相关基因

目的 构建颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达基因的消减cDNA 文库,筛选颞叶癫痫的差异基因。方法 采用抑制消减杂交方法,以正常大鼠和癫痫大鼠的海马组织作为对比材料,分离组织中差异表达基因的cDNA 片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆,用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。结果 获得14个在癫痫大鼠海马组织中有差异表达,并与大鼠的已知基因片段高度同源的基因。 结论 抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,颞叶癫痫大鼠海马组织中存在许多差异表达基因,为深入研究癫痫发病的分子机制提供重要线索。     

Over-expressed genes detected by suppression subtractive hybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE

To screen the over differentially expressed genes in carcinoma induced by BPDE-transformed 16HBE cells （16HBE-C cells）. Methods The suppression subtractive hybridization （SSH） method was performed to profile differentially expressed genes between 16HBE-C cells and 16HBE cells. The cDNA fragments of differentially expressed genes were inserted into TA cloning vector and transformed competent E. coli strain. Positive clones were randomly picked up and identified by the colony PCR method. Dot blot was used to test the same source with the tester. The differentially expressed cDNA fragments were sequenced and compared with known genes and EST database in Genbank. Results Eight known genes were over-expressed in 16HBE-C cells including eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, HIF-1 responsive RTP801, ribosomal protein L10 （RPL10）, ribosomal protein S29 （RPS29）, mitochondrion related genes, and laminin receptor 1. Three differentially expressed cDNA fragments could not be matched to the known genes but to the EST database. Conclusion The SSH method can detect differentially expressed genes between 16HBE-C and 16HBE cells. BPDE-induced carcinogenesis may be related to alteration of at least eight known genes and three unknown genes. These expression data provide a clue to further cloning novel genes and studying functions in BPDE-induced carcinoma.