RNA干扰PTEN基因对HCT-8 细胞增殖能力的影响

 目的:观察小干扰RNA (siRNA)对结肠癌相关基因PTEN表达的抑制作用及其对结肠癌细胞增殖能力的影响。方法：构建携带有针对PTEN基因序列的siRNA真核绿色荧光表达载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4,脂质体法转染入结肠癌HCT-8细胞(分别为p1、p2、p3和p4组),同时设转染阴性对照质粒组(p5组)和亲本细胞组(p6组),实时 PCR方法检测PTEN mRNA表达,MTT法分析细胞增殖活性变化。结果：通过荧光显微镜观察计数,细胞转染率为58%。实时PCR方法检测结果显示,siRNA 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4的抑制率分别为48.3%、76.5%、29.4%和61.2%,与p6组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。MTT结果表明,细胞增殖抑制能力明显增强。结论：PTEN基因在肿瘤的发生发展中可能起到一定的作用。     

RNA干扰IDH2基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的：研究RNA干扰(RNAi)对结肠癌HCT-8细胞IDH2基因表达的抑制作用及干扰后对HCT-8细胞增殖的影响,为结肠癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法：实验分siRNA干扰质粒转染组、阴性质粒对照组和HCT-8细胞空白对照组。构建靶向基因IDH2的siRNA真核绿色荧光载体重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2,利用FuGENE HD转染剂转染HCT-8细胞,通过荧光定量PCR检测IDH2 mRNA的表达情况及MTT法检测结肠癌HCT-8细胞增殖变化。结果：在荧光显微镜下进行细胞计数,细胞转染率为74%。实时荧光定量PCR检测,siRNA重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2对IDH2基因表达的抑制率为85.02%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MTT检测,干扰质粒转染组细胞的增殖能力明显低于空白对照组(P<0.05)。结论：抑制IDH2基因的表达可影响结肠癌细胞的增殖能力,提示IDH2基因在结肠癌的发生发展中起重要作用,抑制IDH2基因的表达可能成为一种治疗结肠癌的方法。     

不可逆性电穿孔介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的:探讨利用治疗剂量脉冲电场产生不可逆电穿孔(IRE)介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒进入细胞的可行性,阐明二者共同作用对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响及其作用机制。方法:将HPV16 E6基因特异性干扰序列插入pGenesil-1质粒,构建HPV16 E6 shRNA真核表达载体,将10个电压为800 V、脉宽100 μs、频率1 Hz的IRE作用于SiHa细胞与HPV 16 E6 shRNA干扰质粒的混悬液,根据处理因素组合,分为空白对照组、IRE处理组、pGenesil-N组、pGenesil-N+IRE组、pGenesil-E6组和pGenesil-E6+IRE组。在荧光显微镜下观察SiHa细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达,计算GFP表达效率;RT-PCR法检测HPV 16 E6 mRNA表达水平,Western blotting法检测HPV16 E6蛋白、P53及PCNA蛋白表达水平,CCK-8法检测各组SiHa细胞增殖能力的变化。结果:成功构建HPV16 E6 shRNA真核表达载体,IRE处理后24 h细胞即可见到绿色荧光;与IRE组比较,pGenesil-E6+IRE组E6 mRNA表达水平下降(P<0.05),E6蛋白表达水平降低(P<0.05),P53蛋白表达水平增高(P<0.05),PCNA表达水平下降(P<0.05);CCK-8法检测,与pGenesil-E6组比较,pGenesil-E6+IRE组细胞增殖活性下降更明显(P<0.05)。结论:治疗剂量的IRE可介导外源基因进入细胞,二者联合作用能明显抑制宫颈癌SiHa细胞增殖。     

靶向干扰ARTN对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖能力的影响

目的:通过RNA干扰技术靶向抑制ARTN基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,探讨抑制ARTN基因对Ishikawa细胞增殖能力的影响.方法:体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,以pGPU6/GFP/Neo为载体构建ARTN基因的短发夹RNA(pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA)干扰质粒,利用脂质体法转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞,荧光显微镜下观察转染效率,应用Western Blot法检测转染后细胞ARTN蛋白的表达情况,CCK法检测Ishikawa细胞的增殖活性.结果:pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干扰质粒成功转染Ishikawa细胞,转染效率为80％;转染后48h,干扰组Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和正常组(P<0.05);转染后48h、72h、96h,干扰组Ishikawa细胞的增殖活性明显低于阴性对照组和正常组(P<0.05).结论:靶向干扰ARTN基因可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力.     

RNA干扰乳腺癌MCF-7细胞HSPA8基因表达

目的：构建并筛选高干扰率的热休克蛋白8（HSPA8）(相对分子质量70 000)基因干扰质粒,为进一步研究HSPA8基因在乳腺癌中的作用提供材料。方法：根据GenBank所发表的HSPA8的基因序列合成4个干扰片段,依次构建1、2、3和4组干扰质粒：pGPU6/GFP/Neo-349、pGPU6/GFP/Neo-818、 pGPU6/GFP/Neo-931和pGPU6/GFP/Neo-1180,将这4组干扰质粒分别转染至人乳腺癌MCF-7细胞,并设阴性及空白对照组。经过G418筛选后得到稳定转染的细胞株,采用RT-PCR 和Western blotting方法分别从mRNA 和蛋白质水平检测各组干扰质粒对HSPA8基因的干扰效果。结果：RT-PCR检测转染shRNA干扰质粒的各组MCF-7细胞的HSPA8基因mRNA转录水平与未转染组比较,干扰质粒1组HSPA8基因的表达量下降了25.0%,干扰质粒2组下降了37.5%,干扰质粒3组下降了43.7%,干扰质粒4组下降了68.5%。Westen-blotting检测结果显示：各实验组与对照组之间蛋白表达比较差异有显著性（P<0.05）,pGPU6/GFP/Neo-1180干扰质粒的干扰效率最高。结论： 成功构建了HSPA8基因的干扰质粒,提示HSPA8基因及其表达产物为研究HSPA8基因在乳腺癌的发生、发展中的作用提供了材料。     

UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

目的 利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响.方法 采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率.结果 转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达（P＜0.01）.与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率（P＜0.01）,增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达（P＜0.01）.结论 pG-PU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率.     

紫薯花青素抗结肠癌作用及其诱导细胞凋亡机制

目的: 探讨紫薯中原花青素(PCI)对人结肠癌细胞(HCT-116)的细胞毒性作用,阐明其诱导细胞凋亡的机制。方法: 取处于对数生长期HCT-116细胞和人成纤维细胞HF-91随机分为对照组(PBS组)、阳性药组[25 mg·L^-1顺铂(DDP)]和PCI组(终浓度分别为25、50和100 mg·L^-1)。采用CCK8法检测细胞增殖抑制率,AO/EB法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,流式细胞术检测JC-1线粒体膜电位变化,qPCR法检测p53和caspase-3 mRNA表达水平。结果: 与DDP组比较,100 mg·L^-1 PCI组HCT-116细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05),各浓度PCI组HF-91细胞增殖抑制率明显降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。与DDP组比较,50和100 mg·L^-1 PCI组HCT-116细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。与对照组比较,DDP组和不同浓度PCI组HCT-116细胞中caspase-3和p53 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);与DDP组比较,不同浓度 PCI组HCT-116细胞中caspase-3 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05),100 mg·L^-1 PCI组HCT-116细胞中p53 mRNA表达水平明显升高(P<0.05),且呈浓度依赖性。结论: 紫薯花青素对消化系统肿瘤细胞具有较强的毒性作用,而对正常细胞毒性较小。     

RNA干扰下调人胆管癌细胞系Hucct-1乳酸脱氢酶-A表达的体外研究

目的:体外实验观察乳酸脱氢酶-A(lactate dehydrogenase-A,LDHA)短发夹RNA对胆管癌细胞系Hucct1 LDHA表达的抑制效果,筛选出针对LDHA基因有效的干扰靶点,并检测LDHA表达下调后,细胞增殖活力的改变情况?方法:设计合成干扰LDHA表达的寡核苷酸片段,经退火?连接等步骤克隆到线性化pGPU6/GFP/Neo真核表达载体,转化入DH-5α大肠杆菌中扩增,经质粒抽提纯化后测序鉴定?重组质粒用脂质体法转染胆管癌细胞系,荧光显微镜观察转染效率;并分别利用RT-PCR及Western blot技术检测LDHA mRNA及蛋白表达,验证短发夹RNA的干扰效果?将干扰效率最高的质粒转染Hucct-1,MTT法检测干扰组较对照组细胞增殖的变化?结果:成功构建了靶向LDHA基因的3个shRNA质粒表达载体,脂质体法平均转染效率为(80 ± 5)%?荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染si-LDHA-1?si-LDHA-3的Hucct1细胞LDHA mRNA和蛋白表达均较阴性对照组有不同程度的下降,其中si-LDHA-3干扰效果尤为明显?MTT法检测显示转染组Hucct1细胞较阴性对照组增殖减慢,转染后96 h两组差异具有统计学差异(P < 0.05)?结论:重组质粒能有效干扰胆管癌细胞Hucct1中LDHA基因的表达,经瞬时转染筛选出了有效干扰靶位,下调LDHA的表达,明显抑制胆管癌细胞系Hucct-1的增殖活力?     

shRNA-FHIT对胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响

目的  构建靶向抑制脆性组氨酸三联体（FHIT）基因的短发夹双链RNA（shRNA）真核表达质粒,观察FHIT抑制后对胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响。方法  构建FHIT基因特异性的小RNA干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1、PGPU6/GFP/Neo-shRNA2,利用脂质体LipofactamineTM2000转染胃癌细胞BGC-823,实验分为未转染组、阴性对照组（转染PGPU6/GFP/Neo-shNC组）及PGPU6/GFP/Neo-shRNA1转染组和PGPU6/GFP/Neo-shRNA2转染组,G418筛选得到稳定表达株,Real-time PCR检测在mRNA水平干扰质粒对FHIT的抑制效应,MTT法、流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果  与阴性对照组相比,转染shRNA-FHIT重组质粒的BGC-823细胞FHITmRNA表达明显下降(P＜0.05)。与未转染组和阴性对照组相比,转染干扰质粒组细胞增殖活性增强,凋亡率减低、生长周期出现S期和G2/M期的比例上调（均P＜0.05）。结论  成功将重组shRNA-FHIT表达载体转染BGC-823细胞,并筛选出稳定低表达FHIT的细胞。shRNA-FHIT可以促进胃癌细胞增殖、降低凋亡率,并削弱G0/G1期阻滞,为进一步研究FHIT基因在肿瘤中的作用机制奠定了实验基础     

P27RF-Rho基因沉默对肝癌Bel7402细胞增殖的影响

目的:构建靶向新分子P27RF-Rho基因的慢病毒RNA干扰载体,研究P27RF-Rho基因对肝癌Bel7402细胞增殖能力的影响。方法:将合成的寡核苷酸片段克隆入RNAi载体,并转染肝癌Bel7402细胞,以沉默P27RF-Rho基因表达。实验分为空白对照Bel7402组、阴性对照Scramble-siRNA组和P27RF-Rho-siRNA组。荧光显微镜观察细胞转染情况;RT-PCR法检测各组Bel7402细胞中P27RF-Rho基因沉默效果;绘制生长曲线,检测转染细胞的增殖情况;平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力;RT-PCR法检测细胞增殖能力相关基因P16、Cyclin E、MMP-9和CDK-5 mRNA的表达水平。结果:P27RF-Rho-siRNA组P27RF-Rho基因表达水平明显低于空白对照Bel7402组和阴性对照Scramble-siRNA组(P<0.01)。P27RF-Rho-siRNA组肝癌细胞的生长速度明显低于空白对照Bel7402组和阴性对照Scramble-siRNA组(P<0.05)。与2个对照组比较,P27RF-Rho-siRNA组细胞中CyclinE、MMP-9和CDK-5 mRNA表达水平降低(P<0.01),P16 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。结论:抑制P27RF-Rho基因的表达能够降低肝癌细胞的增殖能力。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

STAT3小干扰RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建以STAT3为靶基因的短发夹状小干扰RNA表达载体,并探讨STAT3小干扰RNA表达载体对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法：以pGPU6／GFP／STAT3质粒为载体,构建STAT3的小干扰RNA表达载体,使用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞系,用M1Tr法检测空白对照组、小干扰RNA组、阴性对照组与脂质体对照组的增殖活性,48h后流式细胞仪分析4组细胞周期分布与凋亡的变化,并且通过RT—PCR和Westernblot检测结肠癌HCTll6细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定和测序分析表明靶向STAT3的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染HCT116后,STAT3的mRNA和蛋白水平较空载体转染组显著下降;小干扰RNA组与3对照组相比细胞增殖活性明显受到抑制（P〈0．01）;细胞生长明显减缓,G0／G1期细胞比例增加（P〈0．01）。结论：沉默STAT3基因可有效控制结肠癌细胞的增殖,使癌细胞阻滞于G0／G1期并诱导其凋亡,可望成为结肠癌治疗的新方法。     

Oncol2012: 靶向黑色素瘤细胞RhoC基因慢病毒表达载体的构建及初步鉴定

背景 恶性黑色素瘤是体表肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤,高度侵袭转移性是其重要的生物学特征之一,亦是其预后不良的主要因素。肿瘤转移相关因子RhoC可通过多种转移相关机制参与肿瘤的侵袭与转移,是控制肿瘤转移的分子开关,RhoC有望成为抑制肿瘤转移的重要靶位。目前应用RNAi技术靶向RhoC基因对黑色素瘤侵袭转移能力的影响尚未见报道。本研究拟利用RNAi技术,以慢病毒作为基因载体,以人黑色素瘤A375细胞作为研究对象,以转移相关基因RhoC作为靶基因,研究靶向RhoC基因慢病毒干扰载体的构建并检测对RhoC的沉默效应。 方法 根据RhoC编码区基因信息设计构建三条pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体,通过检测其对A375细胞RhoC 的沉默效应筛选出最有效的靶序列。将RNAi效应最佳序列进行慢病毒包装构建形成靶向RhoC 的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体,并感染A375细胞,进一步应用荧光定量PCR和Western blot检测对RhoC mRNA及蛋白表达的沉默效应,应用Transwell小室细胞侵袭实验检测 A375细胞侵袭能力。 结果 构建的三对shRNA表达载体分别为pGPU6/GFP/Neo-shRNA336、pGPU6/GFP/Neo-shRNA453及pGPU6/GFP/Neo-shRNA680,应用荧光定量PCR和Western blot检测转染人黑色素瘤A375细胞后靶基因RhoC mRNA和蛋白表达水平分别为1.47±0.26、1.13±0.16、1.39±0.11和70.98±9.21、50.67±6.06、65.77±4.06,RhoC453为最佳干扰序列。成功构建了靶向RhoC的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体,经测序证实序列正确;将构建的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体感染A375细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测RhoC mRNA和蛋白的表达水平分别为1.05?0.05、62.04?15.86,而阴性对照慢病毒组、正常对照组RhoC mRNA和蛋白分别为4.21±0.24、220.86±24.07和4.63±0.32、257.39±12.30,Transwell小室细胞侵袭实验结果显示pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组穿膜细胞数为40.41±8.88,阴性对照慢病毒组、正常对照组分别为64.82±13.48和77.46±6.47,慢病毒表达载体组较对照组相比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 成功构建的靶向RhoC基因的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体可高效感染体外培养的人黑色素瘤A375细胞,并可显著抑制靶基因RhoC的表达和细胞的侵袭能力。     

沉默GPC-3基因质粒构建及对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白多糖(glypican,GPC)-3 shRNA质粒,观察GPC-3活化干扰对肝癌(HepG2)细胞的抑制作用。方法:设计与合成多条针对GPC-3序列的shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建、转染HepG2细胞、筛选高效质粒,观察沉默GPC-3表达对肝癌细胞增殖的抑制作用与机制。结果:经BamHⅠ或PstⅠ酶切鉴定,证实插入pGPU6/GFP/Neo载体GPC-3 shRNA序列正确,成功构建GPC-3 shRNA干扰质粒。以脂质体介导,将GPC-3shRNA1～4分别转染HepG2细胞,shRNA1沉默GPC-3 mRNA最高效率达89.3%,可有效抑制HepG2细胞增殖,在72 h达71.1%;shRNA1干扰使HepG2细胞周期阻滞在G1期,促进癌细胞发生凋亡(65.6%)。结论:shRNA可有效干预肝癌细胞GPC-3基因转录,促进凋亡并抑制增殖,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

细胞信号转导抑制因子3特异性shRNA的构建及鉴定

目的构建针对大鼠细胞信号转导抑制因子3(SOCS-3)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,选取最有效shRNA模板序列。方法设计并合成编码的shRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,进行序列测定;转染至骨骼肌细胞中。Real-time PCR和Western blot检测各组SOCS-3的表达情况。结果测序证实重组质粒构建成功。4对shRNA模板序列对SOCS-3的表达抑制与空白及阴性对照相比差异均有统计学意义(均P<0.05),且以SOCS-3-shRNA a干预效果较好。结论 SOCS-3特异性shRNA重组表达载体构建成功,能有效抑制大鼠骨骼肌细胞SOCS-3的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗奠定了基础。