人心肌细胞中NLRP3融合蛋白表达的鉴定

目的：构建人NLRP3真核表达载体并证实NLRP3融合蛋白在人心肌细胞中表达。方法以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至pCDNA3．1-myc-his A表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用流式细胞仪观察Myc-NLRP3在人心肌细胞内的作用。结果 NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体 pCDNA3．1-myc-his A中,酶切鉴定片段大小为3111 bp。 Western blot检测到了融合蛋白Myc-NLRP3表达,分子量约为114 KD。 Myc-NLRP3在人心肌细胞中过表达,能够促进细胞凋亡。结论成功构建了Myc-NLRP3全长基因真核表达载体,过表达Myc-NLRP3能够促进心肌细胞凋亡。     

3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位

目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。     

SARS病毒E蛋白基因与EGFP基因在BHK-21细胞中的融合表达

目的：构建SARS病毒E蛋白基因的真核表达载体，观察E蛋白基因在BHK-21细胞中的正常表达及定位。方法：用PCR方法扩增E蛋白基因，上、下游引物两端分别设计EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，产物双酶切后定向克隆于pEGFP-N1载体，构建真核表达载体pEGFP-E，脂质体法转染BHK-21细胞，荧光显微镜观察E蛋白基因的表达。结果：经酶切和DNA序列测定鉴定，E蛋白基因正确插入到增强绿荧光蛋白EGFP基因上游，荧光显微镜显示E蛋白表达于细胞浆内，包膜上也有分布。结论：在BHK-21细胞中成功表达了SARSCovE-EGFP融合蛋白，蛋白定位于细胞浆内。     

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的：构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）/增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法：采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用Lipofectamine^TM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果：扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论：成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。     

骨肉瘤细胞中SORBS1的表达和定位

目的   构建人SORBS1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法   以GST-hSORBS1为模板,利用PCR扩增hSORBS1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hSORBS1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化hSORBS1蛋白。结果   hSORBS1基因cDNA全长成功构建到真核表达载体3*Flag中,Western blot检测到3*Flag-hSORBS1融合蛋白表达, 且在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞周边, 并成功纯化hSORBS1蛋白。结论   成功构建3*Flag-hSORBS1真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达,并纯化hSORBS1蛋白。3*Flag-hSORBS1蛋白主要定位在细胞周边。     

LRIG1基因功能域载体的构建及亚细胞定位

目的 构建含LRIG1胞外段＋跨膜段（ET）及跨膜段＋胞内段（TC）基因的真核表达载体, 并研究它们的亚细胞定位.方法 以人LRIG1全长的质粒p3XFLAG-CMV-9-LRIG1为模板, PCR扩增出3XFLAG-LRIG1-ET和LRIG1-TC, 并将之分别亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP-N1和p3XFLAG-CMV-9中. 酶切和DNA测序鉴定, 脂质体法将构建的质粒转染U251细胞, 观察标记基因荧光蛋白EGFP的表达, 间接免疫荧光检测标记基因3XFLAG的表达. 结果 构建的质粒序列正确, 转染细胞后可检测到EGFP和3XFLAG基因的表达; LRIG1-ET和LRIG1-TC均主要表达在U251的胞膜上, 少量表达在胞浆. 结论 包含LRIG1亚单位ET和TC的真核表达载体均构建成功, 其表达产物均主要位于胞膜, 少量位于胞浆.     

人脂联素真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人脂联素的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达.方法 从人脂肪组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法 获得人脂联素基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-AdipoQ,转染至真核表达细胞COS-7中,并通过SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白在真核细胞中的表达.结果 通过RT-PCR方法 克隆人脂联素基因744 bp,测序结果 显示,1个碱基发生突变,654位:A→T,突变率为0.%,氨基酸Glu→Asp.通过SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白分子质量约为55×103(绿色荧光蛋白分子质量约为27×103),说明脂联素基因在真核细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合.结论 成功的构建了真核表达载体,并在真核细胞中表达.     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。     

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

TGF-β1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建人转化生长因子-β1（TGF-β1）的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明TGF-β1在肝纤维化发生、发展中的作用以及建立相应的基因沉寂治疗途径奠定基础.方法：从人的肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得人TGF-β1基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1,转染真核表达细胞COS-7中,通过荧光显微镜检测其表达,RT-PCR和Western Blot检测TGF-β1基因在真核细胞中的表达.结果：通过RT-PCR方法克隆人TGF-β1基因为1173bp,与目的基因片段大小相一致; 测序结果显示,于531位有1个碱基突变：T→C,为无义突变.通过RT-PCR和Western Blot检测到TGF-β1基因的表达,其融合蛋白分子质量约为52ku（绿色荧光蛋白分子质量约为27ku）,说明重组质粒在COS-7细胞内正常表达.结论：成功的构建了真核表达质粒pEGFP-N1-TGF-β1,并在真核细胞COS-7中表达,为进一步研究其在肝纤维化的基因治疗中奠定了基础.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of Human PRX3 and Its Expression in HEK-293FT Cells

To construct the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 and measure its expression in the HEK-293FT cells, the full-length coding region of human PRX3 was cloned by PCR and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA4-Xpress (A). HEK-293FT cells were transiently transfected with the recombinant plasmid. Western blot and immuofluorescence were used to detect the expression of the fusion protein. In the experiment, restriction analysis identified the construction of the recombinant plasmid and the inserted sequence was identical with that published on GenBank. Western blot and immunofluorescence confirmed the expression of the recombinant protein in transfected HEK-293FT cells. It was concluded that the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 was constructed successfully and the recombinant could he expressed efficiently in HEK-293FT cells, which provides a sound basis for the further study on human PRX3.     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

GPC3真核表达载体的构建及其对肝癌细胞功能的影响

目的：通过构建GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体，研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3，GPC3）促细胞增殖效应的影响，探讨GPC3基因对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法：应用基因重组技术及限制性内切酶酶切构建并鉴定pEGFP-IRES-N1-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体，经脂质体Lipofectamine^TM 2000介导转染BEL-7404后，通过G418筛选出抗性克隆，应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测GPC3 mRNA在真核细胞中的表达，并在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况，采用免疫荧光法和流式细胞仪检测GPC3对细胞增殖效应的影响。Transwell小室实验检测BEL-7404肝癌细胞的侵袭能力。结果：限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子，荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光，RT-PCR法表明GPC3在真核细胞中成功表达，转GPC3的BED7404肝癌细胞与对照组相比有促细胞增殖及侵袭和转移效应。结论：构建完成真核表达重组质粒pEGFP—IRES-N1-GPC3；GPC3基因在BEL-7404中成功表达；GPC3可促进肝癌细胞的增殖，其通过增加细胞的侵袭能力而促进肝癌的转移。