急性淋巴细胞白血病bcr/abl融合基因表达及其与免疫表型的关系

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了M-bcr/abl和m-bcr/abl两种类型融合基因在48例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的表达,并且绝大多数病例同时进行了免疫表型和DNA倍体的流式细胞术分析。结果表明,25%(12/48)的病例M-bcr/abl或m-bcr/abl融合基因阳性,m-bcr/abl阳性率略高。分析bcr/abl阳性病例的免疫表型,发现大多数病例为B系标志阳性,但部分T系标志阳性的病例也检测出M-bcr/abl或m-bcr/abl,说明bcr/abl阳性ALL病例以B系标志阳性者居多,T系标志阳性的ALL病例也可为bcr/abl阳性。     

慢性髓系白血病不同bcr/abl融合基因转录子与临床关系的研究

目的研究慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因转录子类型与临床的关系.方法采用RT-PCR技术检测537例临床怀疑CML的患者新鲜骨髓标本三种bcr/abl(M、m及μ型)融合基因的表达.结果 479例CML患者 M-bcr/abl阳性,其中慢性期(CP)370例,加速/急变期(AP/BC)109例,CP期和AP/BC期患者表达b2a2型融合基因转录子的百分率分别为32.4%(370例中120例)及36.7%(109例中40例)(P>0.05),急淋变及急髓变患者b2a2型百分率分别为52.6%(19例中10例)及33.3%(90例中30例) (P>0.05);b3a2型患者初诊时外周血血小板数明显高于b2a2型患者[(485.9±333.8)×109/L] vs [(380.5±321.9)ⅹ109/L](P<0.05);66.0%CP及64.4%AP/BC患者同时表达M-bcr/abl及m-bcr/abl;1例单纯m-bcr/abl(+)患者表现为急性髓系白血病(AML);2例μ-bcr/abl(+)患者均具有典型CML表现.结论典型CML患者几乎均为M-bcr/abl融合基因阳性,大部分患者同时伴有m-bcr/abl表达,个别CML患者可以为μ型;除了急性淋巴细胞白血病(ALL)外,单纯m-bcr/abl(+)也可见于AML或CML急粒变的患者; b3a2型患者初诊时更易有血小板数增高表现.     

慢性髓性白血病异基因造血干细胞移植后M-bcr/abl及m-bcr/abl融合转录子追踪观察

为研究慢性髓性白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (SCT)后M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子表达特征 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术测定 72例CML患者SCT后不同时间骨髓M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子的表达。结果显示 ,CML患者移植后 <6个月M bcr/abl阳性率 (79.2 % ,4 2 /5 3)显著高于 6 - 12个月(34.3% ,11/32 )及≥ 12个月 (35 .1% ,13/37) (P <0 .0 0 1) ,各时间段M bcr/abl阳性患者的临床复发率分别为1 9% (1/5 3) ,0 (0 /32 )及 16 .2 % (6 /37) ;6例临床复发患者中有 5例复发时M bcr/abl与m bcr/abl同时阳性。 14例遗传学缓解患者移植 6个月后M bcr/abl阳性的 17份标本无 1例m bcr/abl阳性。结论 :多数CML患者移植后M bcr/abl仍为阳性 ,一般在 6个月内转阴 ,移植后M bcr/abl阳性的患者不一定复发 ,同时追踪观察M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子可能会有助于监测残存白血病。     

两例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病患者具有少见型bcr/abl融合基因

目的　研究 2例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病慢性期 (CML CP)患者异常的bcr/abl融合基因结构。方法　分别采用常规的M 及 μ 型bcr/abl融合转录子特异性引物进行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,对RT PCR扩增产物测序进行序列同源性分析 ,以确定扩增产物的成分及bcr/abl融合转录子类型 ,其中 1例根据测序结果设计引物并通过PCR研究其DNA水平bcr与abl基因融合方式。结果　 2例患者临床表现均符合典型CML CP特征 ,RT PCR扩增后均未见典型的M 及 μ 型扩增带 ,而分别出现一条异常的条带 ,产物大小分别介于M 及 μ bcr/abl之间及小于M bcr/abl。经序列分析证明RT PCR产物均含有bcr及abl基因序列 ,例 1的bcr基因断裂发生在第 18外显子 (e18)内部 ,abl基因融合位点为常见的外显子 2 (a2 )处 ,它们之间插入了 4 0bp的部分abl基因内含子 1b序列 ,为一种新型的符合阅读框架结构的bcr/abl融合转录子e18 int a2。经PCR证明该融合发生在DNA水平。例 2的融合转录子中缺失典型M bcr/abl(b2a2 )融合基因中abl基因外显子 2 (a2 ) ,为e13a3(b2a3)型。结论　少见型bcr/abl融合基因可见于典型Ph染色体阳性CML患者并产生异常的RT PCR扩增带。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

m-bcr／abl融合基因型慢性粒细胞性白血病临床和实验室研究

目的研究2例表达m型（ela2）bcr／abl融合基因慢性期慢性粒细胞性白血病（CML-CP）患者的临床及实验室特征。方法患者骨髓细胞分别用R带技术进行染色体核型分析．流式细胞术进行免疫分型，RT-PCR进行bcr／abl融合基因检测，治疗采用羟基脲、阿糖胞苷或羟基脲、HA（高三尖杉酯硷，阿糖胞苷）及干扰素方案。结果2例患者染色体核型均为：46，XY，t（9,22）（q34；q11）；免疫分型：CD13、CD15、CD33阳性．其中例2同时表达CD10抗原（34．35％）：RT-PCR分析例1初诊时M型bcr／abl融合基因阳性（b3a21，治疗后M型bcr／abl转阴而m型bcr／abl（ela2）阳性，例2初诊时即为M型bcr／abl融合基因阴性而in型bcr/abl（ela21阳性：两例患者骨髓像及临床均表现为慢性期．但例2外周血白细胞计数增高不显著（15～47×10^9／L），脾脏不肿大。结论 m-bcr／ablCML是罕见的CML分子亚型。具独特的临床和实验室特征，其发现对于临床诊断和生物学研究具有重要的意义。     

四色流式细胞术分析B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型

为了研究国人B细胞型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)免疫表型特点，使用了四色流式细胞术CD45／SSC 设门分析181例B-ALL的免疫表型。研究结果发现，所有检测病例CDl9阳性率100％，HLA-DR阳性率98．9％，CD38，CD10和CD34阳性率分别为88．5％，76．8％和76．8％，CD117与T系抗原CD2和CD7在B-ALL中很少表达。儿童组(≤14岁)CD10比例较高，青少年(15-18岁)和成人组(≥19岁)髓系相关抗原CD13和(或)CD33表达较高。各年龄组CD10 ／CD34 型比例最高，随年龄增长CD10 /CD34 型比例升高。CD10-CD34 型伴殖系抗原表达率明显高于其它亚型。与CD45 病例相比，CD45-或CD45 /-病例常伴有较高的CD10表达。43例标本RT-PCR检测bcr／abl结果显示：bcr／abl 组和bcr／abl-组伴殖系抗原表达率无显性差弄，m-bcr／abl 主要见于CD10／CD34 型。结论：典型的B-ALL细胞表达CD19和HLA-DR，不表达CD117。不同发育阶段CD34，CD10和CD45表达不一。青少年组免疫表型与成人组相似。CD45 多见于CD10-B-ALL。儿童组殖系抗原表达率较低。m-bcr／abl 多见于CD10／C1)34 型B-ALL。     

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域（PTD）与慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因片段的质粒，并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CML bcr/abl基因片段，经DNA测序后，与合成编码PTD的DNA片段一起手稿质粒pET-16b，构建表达载体pEPb，转化大肠杆菌并进行了PTD－bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的523bp的目的片段被有效地扩增，DNA序列分析表明所构建的含PTD－bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD－bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD－bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物，为进一步研究CML的免疫治疗奠定了基础。     

RT—PCR一步法检测慢性粒细胞白血病bcr／abl融合基因

应用ＲＴ－ＰＣＲ一步法检测了４２例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，均显示ｂｃｒ／ａｂｌ基因阳性，其中２１例为１６８ｂｐ扩增带，１８例为９３ｂｐ扩增带，３例同时具有１６８ｂｐ和９３ｂｐ二条扩增带。ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因检测，对ＣＭＬ的诊断、治疗及预后判断均有重要意义。ＲＴ－ＰＣＲ一步法特异性好，敏感性高，简单快速，可节省试剂，值得推广应用。     

TEC启动子介导BCR/ABL基因在BaF3细胞中的表达

转P210bcr/abl基因小鼠是研究慢性髓系白血病的理想模型,但广泛表达的启动子容易引起转基因小鼠的胚胎致死,所以应用在造血细胞中特异表达的启动子是成功建立转P210bcr/abl基因小鼠模型的关键。本研究探讨TEC启动子介导BCR/ABL基因在BF3细胞中的表达。从小鼠的基因组中克隆TEC启动子的-364至+22区域,并替换掉IRES2-eGFP载体的CMVie启动子,同时在该载体的EcorⅠ酶切位点插入7.2 kb的P210bcr/abl基因,再将构建好的载体分别转染BaF3细胞和293细胞,观察eGFP基因与P210bcr/abl基因在2种细胞中的表达情况。结果通过荧光显微镜和流式细胞仪检测发现,eGFP基因在BaF3细胞成功表达,表达率在转染后6、24、72 h分别为7.10%、23.35%和64.61%,而在293细胞中未见eG FP基因表达。RT-PCR在BaF3细胞中扩增出BCR/ABL mRNA中372 bp的片段,而在293细胞中未扩增出任何片段。结论:TEC启动子的-364至+22区域能介导相关基因在造血细胞中高效特异性表达,适合于构建转P210bcr/abl基因小鼠模型。     

STR-PCR联合RT-PCR技术在慢性髓细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后微小残留病变检测中的应用

为了探究STR PCR联合bcr/abl融合基因转录本RT PCR定性检测技术对慢性髓细胞白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后复发的预测价值 ,对接受allo HSCT的 2 4例CML患者进行微小残留病变(MRD)的动态检测 ,对供体细胞嵌合率 (DC)采用复合扩增荧光标记STR PCR结合毛细管电泳方法进行定量检测 ,对bcr/abl融合基因转录本采用巢式RT PCR方法检测。结果显示 :移植后长期处于完全供体细胞嵌合状态(FDC)即DC≥ 95 %的患者bcr/abl均转为阴性 ,MRD消失 ;稳定混合嵌合状态 (MC)即 90 %≤DC <95 % ,并且bcr/abl阴性的患者 ,也可达到分子水平的缓解并长期生存 ;但是bcr/abl的阳性结果并不总是与复发相关 ,只有当DC进行性下降 (DC <90 % ) ,而同时bcr/abl阳性时 ,才有复发或植入失败的可能 ,对该类患者应尽早实施临床干预性治疗。本研究中有 5例患者出现DC下降和MRD阳性 ,其中 3例为分子水平复发 ,1例为细胞遗传学水平复发 ,1例为植入失败。结论 :STR PCR在敏感范围内 ,其结果与RT PCR的结果符合率高 ,两种技术的结合是一种检测MRD高度敏感的手段 ,可检出allo HSCT后发生分子生物学或细胞遗传学复发的高危患者。     

Ph+/bcr-abl+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph^ ／bcr-abl^ 急性淋巴细胞白血病(ALL)患的微小残留病变(MRD)的简便而灵敏的方法，对84例初治ALL患和其中的缓解期患的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT—PCR检测。结果表明，缓解期患骨髓中不存在Ph^ 染色体，巢式RT-PCR方法检测到1l／14例缓解期患存在MRD(bcr-abl融合基因)(阳性率78．57％)，而流式细胞术检测到5／14的缓解期患阳性(阳性率35．71％)。巢式PCR的灵敏度达到10^-6-10^-7水平，流式细胞检测的灵敏度达到10^-4-10^-5水平。结论：Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏，而巢式RT—PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高，且更易于开展应用。     

bcr/abl mRNA反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病Ph~ 细胞的作用

Ph~ 慢性粒细胞白血病(CML)的bcr/abl融合基因在其发病机制中具有重要作用。为研究bcr/abl反义寡核苷酸对CML细胞的作用,将合成两种18个碱基的bcr/abl硫代反义寡核苷酸与相应CML细胞系(K562细胞)及患者细胞共同孵育。结果发现,bcr/abl反义寡核苷酸可明显抑制K562细胞生长;对CML细胞CFU-GM抑制率为54％—91％,部分病例CFU-GM可有bcr/abl mRNA消失而PCR检测为阴性。上述抑制都是序列特异性的,与剂量呈正相关关系。通过流式细胞仪PI染色分析DNA含量,检测具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量,发现反义寡核苷酸诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本实验为bcr/abl反义寡核苷酸CML基因治疗及体外骨髓净化提供了依据。     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

慢性髓系白血病细胞中SphK-1／S1P信号通路的初步研究

慢性髓系白血病（CML）是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。为探讨SphK-1／S1P信号通路元件在CML细胞中的表达情况，研究P210^bcr/abl是否涉及到SphK-1／S1P信号通路，首先采用RT—PCR检测bcr／abl阳性的K562细胞和bcr／abl阳性的原代CML细胞中SphK-1和S1P受体mRNA的表达.进一步利用P210^bcr/abl特异抑制剂甲磺酸伊马替尼处理bcr／abl阳性的K562细胞和CML原代细胞，然后通过^32P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。结果表明：K562细胞经2．5μmol／L甲磺酸伊马替尼处理0．5,2,6,24和48小时后，对SphK-1活性抑制强度分别为0．007％、38．9％、34．6％、28．1％和76．1％；CML原代细胞在使用2．5μmol／L甲磺酸伊马替尼处理后SphK-1活性较对照下降（16．8—41．9）％。结论：CML细胞中存在SphK-1和S1P的表达，P210^bcr/abl具有激活SphK-1的作用。     

bcr/abl反义寡核苷酸净化后自体骨髓移植治疗慢性粒细胞白血病

目的　观察bcr/abl反义寡核苷酸 (AS ODN)净化后自体骨髓移植 (ABMT)治疗慢性粒细胞白血病 (CML)的疗效。方法　 5例CML中慢性期 2例 ,加速期 1例 ,急变期 2例 ,均具b3a2型bcr/ablmRNA。骨髓采集前患者均经 2个疗程大剂量联合化疗的体内净化 ,自体骨髓经CS30 0 0plus浓集后加入 18bp的硫代bcr/ablAS ODN(40～ 6 0 μg/ml,48～ 6 0h)体外净化Ph 细胞。预处理方案为全身照射 环磷酰胺 (TBI CTX)或马法兰、阿糖胞苷、CTX和环己亚硝脲 (MAC CCNU)。结果　体内净化后骨髓Ph 细胞减至 34 % (2 4%～ 46 % ) ,bcr/ablmRNA( )的CFU GM减至 45 .6 % (33%～ 5 8% )。经bcr/ablAS ODN净化后 ,2例骨髓bcr/ablmRNA(- ) ,3例bcr/ablmRNA( ) ,但bcr/ablmRNA( )的CFU GM明显减少。 5例ABMT后造血重建有延迟现象。经 2年以上随访观察 ,3例移植后持续 9～ 12个月主要遗传学缓解 (MCR) ,且移植后慢性期明显延长 ,其中 1例急变期患者至今无须治疗 ,现已无病生存 37个月 ,bcr/ablmRNA(- )。 1例急变期患者仅获短暂MCR ,移植后 7个月急变期复发 ,1例移植后第 74天因造血重建延迟而感染、出血死亡。结论　bcr/ablAS ODN净化后ABMT可使部分患者取得相当一段时期的MCR及延长慢性期。     

双色荧光原位杂交用于慢性粒细胞白血病干扰素治疗效果的监测

为了探讨双色荧光原位杂交（D-FISH）方法对CML病人干扰素治疗后疗效监测的意义，本研究采用D-FISH方法对慢性粒细胞白血病（CML）病人应用干扰素治疗前后骨髓间期核细胞进行bcr/abl融合基因的检测，并与RT-PCR方法检测bcr/abl mRNA及传统细胞遗传学方法检测Ph染色体的结果进行比较。结果显示，22例CML病人D-FISH bcr/abl融合基因在干扰素治疗前均为阳性，其平均检出率在干扰素治疗前后分别为96.4％和58.6％，其中2例治疗前P染色体阴性病人，D-FISHbcr/abl融合基因在干扰素治疗前后平均检出率分别为94.0％和70.1％。D-FISH方法检测的22例病人中，4例为部分反应，4例为微小反应，其余14例为无反应。与传统的细胞遗传学方法相比较具有良好的相关性。结果：D-FISH方法直接检测CML病人间期核细胞的bcr/abl融合基因，克服了传统的细胞遗传学只能进行分裂中期核细胞分析及RT-PCR方法不能定量检测的不足，为CML干扰素治疗后克隆缓解程度的评定提供了更方便、可靠的方法。