卡介苗对人肺腺上皮细胞表达Fall-39 mRNA及抗菌活性的影响

目的　探讨卡介苗能否增强 Fall- 39在人肺腺上皮 SPC- A- 1细胞中的表达 ,分离鉴定卡介苗刺激作用的有效胞壁蛋白组份 ,并检测其抗菌活性。方法　根据 Gen Bank中人 Fall- 39的 c DNA序列资料 ,设计特异性引物 ,应用 RT- PCR法检测 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达 ,采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadexG- 75柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份 ;采用琼脂糖弥散杀菌法检测 SPC- A- 1细胞培养上清的抗菌活性。结果　卡介苗刺激 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达明显增强 ,而且这种诱导增强表达在一定范围内具有刺激物剂量和时间依赖性。卡介苗胞壁蛋白层析所得 6个组份中 ,组份 4 (相对分子质量范围约 2 1～ 2 9× 10 3)诱导 SPC-A- 1细胞 Fall- 39m RNA的表达增强约 8.5倍 ,其培养上清的抗菌活性显著增强。结论　 BCG胞壁蛋白是 Fall- 39基因的激活因子 ,可诱导其基因的上调表达     

卡介苗胞壁蛋白增强肺抗铜绿假单胞菌感染防御功能的研究

目的 观察卡介苗胞壁蛋白组分能否提高大鼠肺组织对铜绿假单胞菌的清除率.方法 密度梯度离心和分子筛方法分离卡介苗胞壁蛋白组分.用Northern 杂交和RT-PCR检测卡介苗全菌体及其胞壁蛋白组分对肺上皮SPC-A-1细胞β防御素hBD-1 mRNA表达的刺激作用;腹腔注射卡介苗胞壁蛋白组分48 h后,经气管滴入铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌,24 h后处死大鼠,取肺组织进行菌落计数.结果 卡介苗胞壁蛋白经分子筛层析后主要得到两大组分,Tricine-SDS-PAGE鉴定组分2相对分子质量约为18×103～30×103.Northern杂交显示热灭活卡介苗能提高肺上皮细胞β防御素hBD-1 mRNA表达,RT-PCR显示胞壁蛋白组分2刺激作用明显强于全菌体.经胞壁蛋白组分2治疗的大鼠肺组织铜绿假单胞菌数低于阴性对照组(P＜0.01),而对金黄色葡萄球菌感染无明显抵抗作用.结论 卡介苗胞壁蛋白组分可提高肺组织对铜绿假单胞菌的清除率,增强肺抗感染防御能力.     

白念珠菌磷脂甘露聚糖对单核细胞产生白介素-6、白介素-8的影响

目的 研究白念珠菌磷脂甘露聚糖( PLM)诱导人急性单核细胞白血病细胞系细胞(THP-1)产生的炎症反应是否依赖Toll样受体(TLR)2.方法 实时荧光定量逆转录PCR分析PLM体外刺激THP-1细胞TLR2、TLR4、前炎症因子[白介素(IL)-6]和趋化因子(IL-8)的mRNA表达水平.酶联免疫吸附法检测IL-6、IL-8分泌含量.免疫印迹法分析TLR2的蛋白表达.结果 PLM可升高THP-1细胞的IL-6和IL-8 mRNA表达和分泌水平(均P＝0.0000).PLM上调THP-1细胞的TLR2 mRNA和蛋白表达水平(P＝0.0000),但对TLR4 mRNA表达无影响.PLM经β-D-甘露糖苷水解酶处理后,不能诱导上述受体及因子的表达.TLR2中和抗体能抑制PLM诱导的IL-6和IL-8产生(P ＝0.0003,P＝0.0010).结论 白念珠菌胞壁PLM依赖TLP2介导激活人THP-1细胞产生炎症反应.     

脂多糖对人单核细胞株THP-1细胞HIF-1α及其靶基因GLUT-1表达的影响

目的 研究脂多糖(LPS)对人单核细胞株THP-1细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及其靶基因葡萄糖转运载体-1(GLUT-1)表达的影响.方法 以1 μg/mL LPS分别处理体外常规培养的THP-1细胞0、2、4、6、8 h.采用Western blotting检测THP-1细胞HIF-1α蛋白表达,RT-PCR技术检测HIF-1α mRNA与GLUT-1 mRNA表达.以不同浓度的LPS(0、0.01、0.1、1 μg/mL)分别刺激THP-1细胞6 h,Western blotting检测HIF-1α蛋白表达.结果 1 μg/mL LPS作用2 h时,THP-1细胞的HIF-1α蛋白表达开始增加,4 h时显著增加(P＜0.05),6～8 h时达高峰(P＜0.01).0.01 μg/mL LPS刺激6 h,THP-1细胞的HIF-1α蛋白表达较对照组明显升高(P＜0.05);当0.1 μg/mL LPS和1 μg/mL LPS刺激6 h时,HIF-1α蛋白表达更高,与对照组相比差异有高度统计学意义(P＜0.01).提示LPS能够诱导THP-1细胞内HIF-1α蛋白表达,并且呈时间和浓度依赖性.1 μg/mL LPS作用2、4、6、8 h均能上调THP-1细胞HIF-1α与GLUT-1 mRNA水平(P＜0.01),且随时间的延长表达逐渐增加.结论 LPS能够促进人单核细胞株THP-1细胞HIF-1α及其靶基因GLUT-1的表达.     

炎症信号受体Toll基因在人肺腺上皮细胞和血管内皮细胞的表达

目的 研究炎症信号受体Toll mRNA在人单核吞噬细胞系（THP-1）、脐静脉血管内皮细胞（UVECs)和肺腺上皮细胞系（SPC-A-1）的表达情况。方法 分别设计人TLR2和TLR4两对特异引物,从THP-1、UVECs和SPC-A-1提取总RNA,采用一步法RT-PCR和地高辛标记的Northern杂交技术检测TLR2和TLR4在3种细胞的表达。结果 RT-PCR和Northern杂交显示,3种细胞均表达TLR4受体,但仅THP-1和人UVECs表达TLR2受体。结论 本实验结果表明除单核吞噬细胞外,大血管内皮细胞和肺腺上皮细胞亦表达Toll受体基因,提示在炎症反应中Toll信号受体可能介导这些细胞效应分子基因转录激活的信号传导。     

炎症信号受体Toll基因在人肺腺上皮细胞和血管内皮细胞的表达

目的　研究炎症信号受体 Toll m RNA在人单核吞噬细胞系 (THP- 1)、脐静脉血管内皮细胞(UVECs)和肺腺上皮细胞系 (SPC- A- 1)的表达情况。方法　分别设计人 TL R2 和 TL R4两对特异引物 ,从 THP- 1、UVECs和 SPC- A- 1提取总 RNA,采用一步法 RT- PCR和地高辛标记的 Northern杂交技术检测 TL R2 和 TL R4在 3种细胞的表达。结果　 RT- PCR和 Northern杂交显示 ,3种细胞均表达 TL R4受体 ,但仅 THP- 1和人 U VECs表达 TL R2 受体。结论　本实验结果表明除单核吞噬细胞外 ,大血管内皮细胞和肺腺上皮细胞亦表达 Toll受体基因 ,提示在炎症反应中 Toll信号受体可能介导这些细胞效应分子基因转录激活的信号传导。     

卡介苗增强人β-防御素-1基因在肺腺上皮细胞表达的分子调节机制

目的 研究人β-防御素-1(hBD-1)基因启动子结构及卡介苗胞壁蛋白增强其mRNA在肺腺上皮细胞(SPC-A-1)中表达的转录调控机制。方法 hBD-1基因5′-端上游序列被连接入无启动子的pEGFP-1质粒和pCAT basic质粒，构建了系列5′-端缺失的pEGFPhBD-1及pCAT hBD-1报告质粒．pEGFP hBD-1质粒转染细胞后用荧光倒置显徽镜观察绿色荧光表达强度。pCAThBD-1报告质粒和pSV-β-Galactosidase control质粒(内对照)共转染SPC—A-1细胞后，给予卡介苗胞壁蛋白活性组分刺激，用ELISA检测CAT和β-Gal浓度．结果 hBD-1基因上游-314段有较强的启动子活性，-69段则启动活性减弱IBCG刺激后，即使上游序列缩短至-69位点时，报告基因CAT相对表达量仍明显增高。该区域有-同源性极高的C／EBPβ(CCAAT／Enhancer—binding proteinp)结合元件．结论 hBD-1基因上游-314bp段具有较完整的启动子活性，其中含有C／EBPβ结合位点的-69／ 54bp序列介导卡介苗对hBD-1基因转录的增强作用。     

自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡

目的 探讨自身免疫调节因子(AIRE)对THP-1单核细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 将THP-1细胞以佛波醇酯(PMA)诱导分化后,进行瞬时转染.免疫荧光和Western blot法检测转染效率.通过Annexin Ⅴ-FITC、PI双染色法和流式细胞仪检测过表达AIRE的THP-1细胞凋亡率.通过间接免疫荧光染色和Western blot检测自噬蛋白LC3B的表达.结果 PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,形态多样,胞质内可见空泡、吞噬细胞碎片等典型成熟分化形态.转染48 h后,THP-1细胞的AIRE蛋白呈现明显高表达.对比空载体转染和阴性对照,过表达AIRE使THP-1细胞的凋亡率上升;同时,Western blot显示LC3B-Ⅱ的蛋白水平也较空载体转染组增高,且间接免疫荧光染色提示单个细胞的阳性LC3B-Ⅱ斑点数目较空载体转染组明显增加(P＜0.05).结论 AIRE可能通过上调THP-1细胞的自噬促进其凋亡.     

脂多糖对人单核细胞株THP-1细胞HIF-1α及其靶基因GLUT-1表达的影响

目的研究脂多糖(LPS)对人单核细胞株THP-1细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及其靶基因葡萄糖转运载体-1(GLUT-1)表达的影响。方法以1μg/mL LPS分别处理体外常规培养的THP-1细胞0、2、4、6、8 h。采用Western blotting检测THP-1细胞HIF-1α蛋白表达,RT-PCR技术检测HIF-1αmRNA与GLUT-1 mRNA表达。以不同浓度的LPS(0、0.01、0.1、1μg/mL)分别刺激THP-1细胞6 h,Western blotting检测HIF-1α蛋白表达。结果1μg/mL LPS作用2 h时,THP-1细胞的HIF-1α蛋白表达开始增加,4 h时显著增加(P<0.05),6~8 h时达高峰(P<0.01)。0.01μg/mL LPS刺激6 h,THP-1细胞的HIF-1α蛋白表达较对照组明显升高(P<0.05);当0.1μg/mL LPS和1μg/mL LPS刺激6 h时,HIF-1α蛋白表达更高,与对照组相比差异有高度统计学意义(P<0.01)。提示LPS能够诱导THP-1细胞内HIF-1α蛋白表达,并且呈时间和浓度依赖性。1μg/mL LPS作用2、4、6、8 h均能上调THP-1细胞HIF-1α与GLUT-1 mRNA水平(P<0.01),且随时间的延长表达逐渐增加。结论LPS能够促进人单核细胞株THP-1细胞HIF-1α及其靶基因GLUT-1的表达。     

血红素氧化酶-1抑制氧化低密度脂蛋白诱导THP-1单核细胞表达单核细胞趋化蛋白-1 mRNA

目的:探讨血红素氧化酶(HO)-1对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的THP-1单核细胞上单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 m RNA表达的影响。方法:不同浓度(0、25、50、100、200 mg/L)ox-LDL,作用不同时间(0、12、18、24、48 h),刺激THP-1单核细胞;实时荧光定量(RT)-PCR检测MCP-1 m RNA表达。用锌原卟啉和钴原卟啉(Co PP)IX(均为10μmol/L)干预THP-1单核细胞12 h后,再用ox-LDL(100 mg/L)刺激24 h;RT-PCR分别检测MCP-1和HO-1 m RNA表达。结果:ox-LDL呈浓度-时间依赖性上调MCP-1 m RNA表达(P<0.01)。与对照组比,Co PP IX组HO-1 m RNA表达明显升高(P<0.01);与100mg/L ox-LDL组比,Co PP IX组MCP-1 m RNA表达明显下降(P<0.01)。结论:ox-LDL可上调THP-1单核细胞MCP-1的表达;诱导HO-1高表达可抑制ox-LDL诱导的THP-1源单核细胞MCP-1 m RNA表达。     

卡介苗对鼠源性巨噬细胞株释放一氧化氮和IFN-γ的影响

目的:观察卡介苗(BCG)对鼠源性巨噬细胞株RAW264释放的诱导型一氧化氮(NO)合成酶(iNOS)及γ干扰素(IFN-γ)表达的影响.方法:在鼠源性巨噬细胞株RAW264培养液中加入BCG,Griess检测法测定NO释放量,半定量RT-PCR法检测iNOS及IFN-γ的表达.结果:BCG添加后使巨噬细胞NO产生量增加,IFN-γ、iNOS的mRNA表达增强.结论:在巨噬细胞吞噬、杀灭结核分枝杆菌时IFN-γ具有活化巨噬细胞的作用.     

解脲脲原体LAMPs激活核因子κB诱导人单核细胞表达诱导型一氧化氮合酶和前炎症因子

目的分析解脲脲原体（Uu）的脂质相关膜蛋白（LAMPs）对人单核细胞（THP-1）表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和前炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的影响。方法用Uu的LAMPs刺激人单核细胞后,Western blot法检测核因子κB（NF-κB）的激活和iNOS基因的表达,格氏试剂测定NO,ELISA法测定IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。结果Uu LAMPs通过激活NF-κB诱导人单核细胞表达iNOS,且能以时间和剂量依赖方式刺激人单核细胞产生NO,诱导表达前炎症因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）;NF-κB抑制剂PDTC可抑制NF-κB的激活、iNOS的表达及NO的产生。结论Uu LAMPs通过激活NF-κB途径诱导人单核细胞表达iNOS和前炎症因子,可能是产生某些疾病的一个重要的因素。     

白藜芦醇对脂多糖诱导的巨噬细胞极化改变的影响

目的：探讨白藜芦醇对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞极化表型改变的影响。方法体外培养的RAW264．7小鼠巨噬细胞在六孔板孵育12 h ,分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、LPS（100 ng／mL）组、LPS（100 ng／mL）＋白藜芦醇（30μmol／L）组,LPS＋白藜芦醇组在加入LPS前预先加入白藜芦醇孵育12 h;上述细胞在LPS刺激12 h后分别收集细胞和培养上清液;实时定量PCR（RT‐qPCR）检测经典的炎症活化型巨噬细胞（M1）型相关基因iNOS、TNF‐αmRNA表达,以及替代活化巨噬细胞（M2）型相关基因IL‐10、PPARγ和Arg‐1 mRNA表达,Western blot检测细胞iNOS、Arg‐1蛋白表达,ELISA检测培养上清液中炎性因子IL‐12 p40、IL‐10和 TNF‐α的水平。结果 RT‐qPCR检测结果显示,与LPS组相比,M1型相关基因iNOS、TNF‐αmRNA较LPS＋白藜芦醇组显著上升（P＜0．05）,而M2型相关基因IL‐10、PPARγ、Arg‐1 mRNA表达显著下调（P＜0．05）。Western blot检测发现,LPS组iNOS蛋白水平显著高于LPS＋白藜芦醇组（P＜0．05）,而Arg‐1蛋白水平显著低于LPS＋白藜芦醇组（P＜0．05）。ELISA检测发现,LPS组培养上清液中炎性因子IL‐12 p40、TNF‐α水平显著高于LPS＋白藜芦醇组（P＜0．05）,而IL‐10和水平显著低于LPS＋白藜芦醇组（P＜0．05）。结论白藜芦醇可能促进了LPS刺激的RAW264．7巨噬细胞向M2型极化改变。     

IL-17、RANTES及其受体在早期自然流产蜕膜组织中的表达及意义

目的检测IL-17、T细胞激活上调性表达分泌因子s（RANTES）及其受体CCR5在正常早孕及早期自然流产患者蜕膜组织中的表达,并探讨其意义。方法30例早期自然流产患者（流产组）和30例正常早孕妇女（对照组）的蜕膜组织,分别应用RT—PCR、ELISA方法检测蜕膜组织中IL-17、RANTES及CCR5的表达并进行线性相关分析,同时应用免疫组织化学方法染色定位其蛋白的表达。结果①早孕蜕膜组织中均有IL—17mRNA、RANTESmRNA、CCR5mRNA的表达,流产组蜕膜组织中IL-17mRNA、RANTESmRNA、CCR5mRNA的表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。②ELISA法定量检测结果与PT—PCR结果趋势一致。③IL-17与RANTES的表达呈正相关。④IL-17定位于蜕膜细胞胞质,RANTES定位于蜕膜细胞胞质及胞膜,CCR5定位于蜕膜细胞胞核。结论早期自然流产患者蜕膜组织中IL-17、RANTES及其受体CCR5的表达水平较正常早孕者高,这种改变可能是导致早期自然流产的重要原因。     

SpA 刺激单核巨噬细胞表达早期致炎因子的实验研究

目的：探讨金黄色葡萄球菌蛋白A（SpA）对单核巨噬细胞表达早期致炎因子 TNF‐α、IL‐1和IL‐6的影响。方法用一定浓度SpA与THP‐1细胞培养不同时间,用MTT法测定SpA对THP‐1细胞增殖的影响;用ELISA测定培养液中TNF‐α、IL‐1和IL‐6的水平;用RT‐PCR检测细胞TNF‐α、IL‐1和IL‐6相应mRNA的表达,并对结果进行统计学分析。结果 SpA对THP‐1细胞增殖的影响与其作用剂量有关。SpA可促进巨噬细胞分泌 TNF‐α、IL‐1和IL‐6及表达相应mRNA ,且呈一定剂量‐效应和时间‐效应关系。SpA刺激巨噬细胞分泌TNF‐α、IL‐1、IL‐6和表达相应mRNA均在12 h达高峰。SpA刺激组TNF‐α、IL‐1和IL‐6的表达和释放均显著升高（P＜0．01）。结论 SpA可明显促进单核巨噬细胞表达和分泌早期致炎细胞因子 TNF‐α、IL‐1和IL‐6。SpA在启动金葡菌性脓毒症及促进其发展中,具有不可忽视的作用。     

人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡对巨噬细胞极化的影响

目的: 探究人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡对巨噬细胞极化的影响。方法: Dil标记神经干细胞微囊泡,流式细胞仪和共聚焦显微镜观察THP-1巨噬细胞对微囊泡的内化;实时荧光定量PCR筛选微囊泡最适浓度;100 ng/mL 脂多糖刺激THP-1细胞6 h后,微囊泡处理12 h,实时荧光定量PCR检测巨噬细胞炎性因子IL-1β,肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)以及IL-6的mRNA表达水平;微囊泡处理24 h, 蛋白免疫印迹法检测诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)和精氨酸酶1 (Arginase-1, Arg-1)蛋白表达水平;流式细胞术检测THP-1巨噬细胞M1极化表面标志CD86表达。结果： THP-1巨噬细胞在12 h和24 h均能明显内化神经干细胞微囊泡;0.12 μg/mL微囊泡具有最适调控作用;与未处理细胞相比,脂多糖处理后明显增加THP-1细胞IL-1β,TNF-α,IL-6等mRNA和iNOS蛋白,Arg-1蛋白表达差异无统计学意义(P<0.05);经神经干细胞微囊泡处理后THP-1细胞IL-1β,TNF-α,IL-6等mRNA和iNOS蛋白表达明显降低(P<0.05);与未处理细胞相比,脂多糖和微囊泡处理后THP-1巨噬细胞CD86表达差异无统计学意义。结论： 人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡能够减少THP-1细胞炎性细胞因子和iNOS表达,抑制巨噬细胞M1极化。     

肿瘤细胞中ASPP2 mRNA的表达及意义

目的 建立p53凋亡刺激蛋白基因(ASPP2)mRNA丧达水平的RT-PCR测定方法；并应用该方法测定AS-PP2mRNA在正常人血液单核细胞与人淋巴瘤细胞株jurkat及成纤维细胞和结肠癌细胞株HT-29的表达水平。方法 应用单核细胞分离液分离正常人血液单核细胞。用DMEM培养液培养细胞株jurkat、成纤维细胞和结肠癌细胞株HT-29，所得细胞用Tripure分离试剂提取总RNA。最后用RT-PCR俭测ASPP2 mRNA的表达水平。结果 ASP2mRNA在正常人血液单核细胞中的表达水平比人淋巴瘤细胞株jurkat的表达水平高，而正常人成纤维细胞中ASPP2的表达水平比结肠癌细胞株HT-79低。结论 ASPP2的mRAN表达量是在p53野生型的肿瘤细胞中降低而不是在p53突变型的肿瘤细胞中，说明ASPP2调节着p53的肿瘤抑制功能。     

结直肠癌组织趋化因子IL-8的表达

目的：研究结直肠癌组织趋化因子IL－8的表达与结直肠 生物学行为的关系。方法：采用RT－PCR方法检测临床收集的新鲜结直肠癌组织标本中趋化因子IL－8mRNA的表达;采用免疫组织化学方法检测结果直肠癌组织中趋化因子IL－8蛋白的表达。结果：12例结直肠癌组织经RT－PCR检测均可出现趋化因子IL－8mRNA的表达。40例结肠癌组织IL－8蛋白表达的阳性率为87．5％;结直肠癌组织IL－8蛋白的表达与结直肠癌的转移及Dukes分期有关,表达强者,转移发生率高,Dukes分期晚。结论：结直肠癌组织中趋化因子IL-8的表达与结直肠癌的生物学行为有关。