恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的 扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长，并进行序列比较研究。方法 小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株，用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因，并采用TA克隆技术构建测序载体，对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长，并TA克隆到测序载体pMD18—T vector，测序结果与Karp标准株的同源性为99．4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功，为进一步构建表达载体，进行Sta56蛋白表达研究提供基础。     

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。     

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的　构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。　方法　从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。　结果　 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性     

抗恙虫病东方体噬菌体抗体库的构建和初步筛选

目的 构建抗恙虫病东方体噬菌体抗体库并进行初步筛选,获得与恙虫病东方体膜抗原特异性结合的抗体克隆,为研制恙虫病的快速诊断试剂盒奠定基础.方法 从感染恙虫病东方体小鼠的脾细胞中提取RNA,经逆转录、PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻链基因和表达载体pComb3进行酶切、连接.转化大肠杆菌XL1-blue,构建轻链库;再对轻链重组质粒和重链Fd基因进行酶切、连接,转化大肠杆菌XL1-blue,构建组合文库,以辅助噬菌体VCS M13进行超感染.用恙虫病东方体56 kDa型特异性抗原作为筛选抗原,进行4轮富集筛选后用ELISA法进行阳性克隆的鉴定.结果 构建了库容为3.46×106的鼠源性抗恙虫病东方体的噬菌体Fab片段抗体库.经过4轮富集筛选,抗体库中的目的 抗体得以富集约160倍,并用ELISA法对其进行鉴定,得到了7个阳性克隆.结论 构建的抗恙虫病东方体噬菌体抗体库,库容为3.46×106,滴度为2.5×1012 cfu/ml,基本上达到了建库要求,能够满足多样性的需求,并成功的筛选出抗恙虫病东方体56 kDa蛋白的抗体,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行了初步鉴定,认为具有一定的特异性.     

LTB-NspA融合基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建融合基因LTB-NspA的原核表达载体。方法:用PCR法从淋球菌和大肠杆菌标准株分别扩增出NspA和LTB基因,用重组PCR法通过接头将LTB与NspA融合,将其插入pET-30 a中,并进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:经PCR、酶切和测序分析,证实成功构建了LTB-NspA的原核表达载体。结论:LTB-NspA原核表达载体的成功构建,为研制淋球菌高效粘膜免疫疫苗奠定了基础。     

Genotype identification of Orientia tsutsugamushi isolated from Nan Peng Lie Islands in China

目的：为确定我国南澎列岛是否为恙虫病疫源地,对来自该地的８个恙虫病东方体分离株进行基因鉴定。方法;应用套式聚合酶链反应（NPCR）和限制片段长度多态性分析（RFLP）,NPCR的引物来自恙虫病东方体５６kDa蛋白基因,NPCR阳性产物由HincII和PstI消化并产生特异性酶切图谱予以分析。结果;南澎列岛的8个恙虫病东方体分离株属三个型,即Karp,Kato和一新型恙虫病东方体。结论：南澎列岛是恙虫病疫源地。     

2012～2013年广州市人感染恙虫病东方体基因型分析

目的了解广州市人感染恙虫病东方体基因型的分布及特点。方法收集2012~2013年广州市恙虫病临床诊断病人全血,测定型特异性抗原基因部分序列,并进行基因序列同源性及系统进化分析。结果 133份标本中检测到40份阳性,其中Karp型21株,Kato型10株,Gilliam型5株,TA763型3株,未知型别1株。同源性分析显示其传播来源可能与台湾、日本、泰国等有关。结论广州市恙虫病东方体流行型别具多样性,来源复杂,开展更多分子流行病学研究将有助于其防控。     

海南省琼中黎族苗族自治县2019年恙虫病东方体分子流行病学及遗传进化分析

目的 通过分析海南省琼中黎族苗族自治县（简称“琼中”）98例不明原因发热患者的恙虫病流行特点,了解该地区恙虫病东方体菌株流行的情况,为该地区制定恙虫病防治策略和控制措施提供科学依据。方法 收集2019年 1月1日至2019年12月31日琼中黎族苗族自治县人民医院诊断为疑似恙虫病和不明原因发热患者血液样本,利用胶体金免疫层析法和巢式PCR方法对样本进行恙虫病东方体特异性IgM、IgG抗体和恙虫病东方体56kD型特异性抗原基因检测,同时使用预先设计的样本信息表收集患者的临床表现及流行病学信息。针对巢式PCR检测结果为阳性的样本,进行克隆及Sanger测序。对获得的患者临床信息及检测结果进行流行病学分析,将测序得到的序列进行基因遗传进化分析。结果 98例样本中,恙虫病IgM抗体阳性率为24.49%（24/98）,恙虫病IgG抗体阳性率为46.94%（46/98）,恙虫病PCR阳性率26.53%（26/98）,焦痂或皮疹13.27%（13/98）。根据诊断标准,最终诊断为恙虫病的患者为33例。感染人群主要以31~50岁的青壮年为主,职业主要为农民。该地区恙虫病的流行以营根镇、长征镇和红毛镇为主并涉及9个乡镇。流行时间有明细的季节性,以7月和11月为主要高发期。流行的基因型主要为Karp型和Gilliam型。结论 琼中为恙虫病的自然疫源地,该地区流行的恙虫病东方体基因型主要为Karp和Gilliam型,具有基因多态性。     

艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b( ),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.     

人源TNF-α抗体基因的克隆与表达

目的:在原核系统中高效表达抗TNF-α单克隆抗体VH/K21,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景.方法:以已筛选获得的TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,产物与其表达质粒进行双酶切,连接后克隆进入PET22b(+)/BL21(DE3)感受态中并在该原核系统中实现可溶性表达;对表达产物进行Western blotting、ELISA鉴定.结果:成功克隆与表达出可溶性的高效表达的人源TNF-α单克隆抗体.序列分析表明该克隆具有全新的人源TNF-α抗体基因,它可以特异识别人TNF-α.结论:人源TNF-α单克隆抗体的获得为进一步研制应用于临床的TNF-α人源抗体奠定了基础,也将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础.     

海南省发热患者血标本中恙虫病东方体groEL基因检测

目的了解海南省发热病人中感染恙虫病东方体的状况,并确定其基因分型。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省各家医院2009~2010年送检的117份不明原因发热病人血标本的groEL基因的特异性片段,对所检测到的部分目的片段进行基因测序,从基因水平进一步证实阳性结果,并对序列同源性及进化分析。结果从117份发热病人血标本中发现有恙虫病东方体阳性15份,检出率为12.8%。取10份PCR阳性产物进行测序,核酸序列基本一致,彼此间仅存在3个核苷酸的差异,构建进化树进行聚类分析,结果示海南省恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体在同一分支上,同源性高。结论海南省发热病人中存在恙虫病东方体感染的状况,应加强相关监测和防控措施,为给海南省制定恙虫病防治策略提供科学依据。     

结核分枝杆菌突变gyrase A基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ser95Thr突变DNA促旋酶A(DNA gyrase A)基因原核表达载体并鉴定,为进一步研究奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用重叠延伸剪切技术,分别通过3次PCR扩增Ser95Thr突变gyrase A基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET-32 a(+),获得重组表达质粒pET-mgyr。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ser95Thr突变gyrase A基因,经过酶切、PCR和测序鉴定,表明突变gyrase A基因正确地插入原核表达载体pET-32 a(+)。结论成功构建了原核表达载体pET-mgyr,为Ser95Thr突变gyrase A基因的功能研究奠定了基础。     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

小鼠周脂素基因的原核表达及纯化

目的构建小鼠周脂素（prilipin,Plin）原核表达载体,表达周脂素蛋白并进行初步纯化,为研究周脂素的功能奠定基础。方法通过酶切从pMD18-Plin重组载体上酶切下周脂素目的基因,定向插入原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果构建的pET-32a-Plin载体能够表达周脂素重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的50%,经初步纯化后,纯度达95%以上。结论成功构建了周脂素原核表达载体,并在原核系统中表达了重组蛋白,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续试验。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.