调心方中β3淀粉样蛋白结合成分的初步探讨

目的：探讨调心方中是否具有通过结合p淀粉样蛋白（β-amyloidprotein，Ap）而减少其神经元毒性的成分。方法：调心方提取物与Aβ共同沉淀并对沉淀物中的Aβ进行免疫印迹检测，制备小量Affi—gel—Aβ，用高效液相色谱（high—performanceliquidchromatography，HPLC）检测调心方中Affi—gel—Aβ结合组分；大鼠原代皮罢神经元培养，以乳酸脱氢酶（1acticdehydrogenase，LDH）测定法反映细胞损害程度。结果：免疫印迹检测显示Aβ能与调心方中的成分一起沉淀，且沉淀中的Aβ会随调心方的稀释而减少；调心方与Affi-gel—Aβ反应后，用甘氨酸液（pH2．5）洗脱的组分中有可被HPLC荧光检测器所检测的物质。LDH漏出检测结果显示，在无血清和含血清的培养体系中5μmol／LAβ1-12处理48h均可导致原代培养神经元损害，LDH漏出率显著增加（P〈0．01），而大鼠调心方药物血清可抑制Aβ诱导的LDH漏出（P〈0．05）；经Affi—gel—Aβ吸附的调心方药物血清对A8毒性仍有抑制作用（P〈0．05），但较经Affi—gel吸附的药物血清有减弱的趋势。结论：调心方中有Aβ结合成分，这类成分不促进Aβ的毒性，而可能具有抑制Aβ毒性的作用。提示在对老年性痴呆有效的中药方剂中探寻Aβ结合成分可能是探寻治疗AD药物的一个手段。     

调心方对β淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元凋亡的调控作用

目的 探讨调心方的药效及作用机制。方法 原代培养大鼠海马神经元,Aβ 1-42诱导神经细胞毒模型。采用FDA与PI双染检测神经元存活率,Hoechst 33258染色、TUNEL判断神经元凋亡,免疫细胞化学研究Caspase-3表达,Northern Blot、RT-PCR研究凋亡相关基因(bcl-2、bax、c-jun、c-fos)表达。结果 神经元经Aβ 1-42处理后,活细胞数减少,染色质浓缩、核碎裂,TUNEL染色阳性神经元增多,Caspase3表达增加,bcl-2 mRNA表达减少,而bax与c-jun表达增加、c-fos的表达变化不明显。调心方可显著改善上述变化。结论 调心方对Aβ 1-42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,抑制凋亡。其机制可能通过提高bcl-2 mRAN水平,降低bax和c-jun mRAN水平,减少Caspase-3表达而实现。     

丹蒌片对Aβ_(1-40)致脑微血管内皮细胞损伤模型活性的影响

目的:观察丹蒌片对β淀粉样蛋白(β-Amyloid protein,Aβ)致脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)损伤模型活性的影响。方法:培养BMEC,用Aβ_(1-40)造成BMEC损伤,加入不同剂量的丹蒌片含药血清,6 h、12 h、24 h后用CCK8染色法检测细胞活性,并检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的漏出量。结果:与正常对照组比较,模型组细胞活性降低,细胞培养上清液中LDH释放量增加(P<0.01)。与模型组比较,12 h后各剂量丹蒌片含药血清组细胞活性显著升高,12 h细胞活性高于24 h的细胞活性(P<0.05);丹蒌片含药血清各组细胞培养上清液中LDH水平降低,12 h上清液中LDH水平显著低于6 h、24 h(P<0.05);高剂量、中剂量含药血清组细胞上清液LDH水平显著降低(P<0.05)。结论:丹蒌片能提高Aβ_(1-40)致BMEC损伤后细胞的活性,减少细胞LDH的漏出量,起到保护脑微血管内皮的作用。     

雌激素对Aβ25-35致PC12细胞损伤的影响

目的观察可溶性Aβ25-35作用下PC12细胞细胞活力的改变及17β-雌二醇(17βE2)对此改变的影响。方法培养的PC12细胞作为神经细胞体外模型,可溶性Aβ25-35作用于PC12细胞作为AD早期病理损害的细胞模型,实验设空白对照组、Aβ损伤组、雌激素干预组,雌激素干预组再分为五个剂量亚组,分别于培育各时间点(0.5,6,24,48,72 h),用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤程度。结果Aβ损伤组与空白对照组相比,PC12细胞代谢活力(MTT还原率)明显降低(P<0.01),细胞培养液上清中LDH漏出明显增多(P<0.01),以上损伤出现较早,并随着时间的延长而加重。与Aβ损伤组比较,在10-9-10-6mol/L各浓度下,17βE2组细胞MTT还原率均有显著提高,细胞培养液上清LDH漏出均有显著降低,且有剂量依赖性。结论超生理量的Aβ即使呈可溶解状态也可以对神经元细胞造成毒性损害,雌激素具有剂量依赖性的抗Aβ损伤和神经细胞保护作用。     

Akt激活在雌激素对β淀粉样蛋白毒性保护机制中的作用

目的 探讨雌二醇(17β-estradi01)对Aβ25-35毒性作用的影响及其可能机制.方法 17β-estradiol和Aβ25-35作用于大鼠皮质神经元,检测对细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响;检测Akt抑制剂和雌激素受体抑制剂存在时对细胞活力的影响;Westem印迹检测对磷酸化和非磷酸化Akt表达的影响.结果 20 μmol/的Aβ25-35使大鼠皮质神经元细胞活力降低至40.4%(P＜0.01),17β-estradiol.能使细胞活力恢复至84.2%(P＜0.01);Aβ25-35使细胞LDH增加至对照组的172.5%(P＜0.01),而17β-estradiol使LDH回降至118.5%(P＜0.01).Akt抑制剂和雌激素受体抑制剂均部分阻断了雌激素对Aβ25-35神经毒性的拮抗作用.与对照组相比,Aβ25-35降低了磷酸化Akt的表达(65.9%,P＜0.01),而雌激素部分拮抗此作用(94.7%,P＜0.01),Akt抑制剂则阻断了雌激素的作用(75.4%,P＜0.05);雌激素单独作用则增加了磷酸化Akt的表达;雌激素受体抑制剂部分阻断了雌激素作用,雌激素受体抑制剂单独作用对Akt的磷酸化无显著影响;各种情况下非磷酸化Akt的表达无显著影响.结论 雌激素17β-estradiol可以拮抗Aβ25-35的神经毒性作用,激活Akt可能是其发挥保护作用的机制之一;雌激素受体可能在Akt的激活中发挥一定作用.     

调心方有效部位TX0201对类AD模型大鼠脑内APP mRNA与Caspase-3表达的影响

目的：观察调心方有效部位TX0201对Aβ1-40双侧杏仁核注射所致的类阿尔茨海默病（AD）模型大鼠脑内APP mRNA、Caspase-3表达的影响。方法：应用β淀粉样蛋白1-40片段（Aβ1-40）注射入大鼠双侧杏仁核建立类AD的动物模型。实验设正常对照组、类AD模型组、TX0201组、调心方组、安理申组,均采用灌胃给药20d;分别用RT—PCR法、免疫组化法检测大鼠脑部皮层和海马的APP mRNA、Caspase-3表达。结朵：TX0201和调心方均能明显降低大鼠皮层、海马APP（MPI） mRNA和APP（KPI） mRNA的表达。模型大鼠大脑海马CA2区和皮层Caspase-3蛋白阳性细胞表达明显增多,调心方和TX0201均能明显调低Caspase-3蛋白阳性细胞的表达。结论：TX0201可能通过降低皮层、海马部位APP mRNA的表达,下调Caspase-3,减轻神经细胞凋亡,从而发挥保护神经元作用。     

糖皮质激素促β-淀粉样蛋白致海马神经元损伤的机制

目的探讨糖皮质激素(GCs)促进β-淀粉样蛋白(Aβ)引起海马神经元损伤的机制。方法地塞米松(DEX)和Aβ与胎鼠海马神经细胞共同孵育后,通过LDH释放法检测细胞活力,用激光共聚焦显微镜检测神经元[Ca2 ]i的变化,用RT-PCR来检测cdk5、p53在细胞内的表达情况。结果DEX促进Aβ25～35引起海马细胞活力的下降(P<0.05),促进Aβ25～35引起上升的[Ca2 ]i的水平(P<0.05),上调Aβ25～35引起的上升的cdk5mRNA的水平(P<0.05),但DEX未能进一步促进Aβ25～35引起的上升的p53mRNA水平(P>0.05)。结论DEX可促进Aβ的海马神经元毒性,DEX可能通过上调[Ca2 ]i的水平、上调cdk5mRNA的水平促进Aβ引起海马神经元tau异常磷酸化,导致海马神经元损伤。     

华佗健聪汤拮抗Aβ所致神经毒性的体外研究

目的探讨华佗健聪汤对β淀粉样多肽(Aβ)所致神经毒性的拮抗作用。方法以原代培养的SD乳鼠神经元为材料,随机分为正常组、模型组、华佗健聪汤组、人参皂苷Rg1对照组。除正常组外,其余各组用Aβ1-42造成神经元损伤,华佗健聪汤组用华佗健聪汤给SD成年大鼠灌胃(含生药20 g/kg)后获取的大鼠含药血清进行干预,人参皂苷Rg1对照组用人参皂苷Rg1进行干预。观察并拍摄细胞形态,检测MTT值,取细胞上清夜检测LDH、T-AOC、NO等指标。结果华佗健聪汤组与模型组相比,MTT、T-AOC显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05);而LDH和NO则明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论华佗健聪汤对Aβ所致神经元损伤的大鼠有较好的保护作用,抗自由基的氧化损伤作用可能是其保护神经元的作用机制之一。     

橙皮素早期干预对APPswe/PS1dE9小鼠学习记忆能力和Aβ42、NEP的影响

目的 探究不同剂量橙皮素(hesperetin)早期干预对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆能力、β-淀粉样蛋白(1-42)(amyloidβ-protein1-42,Aβ42)及Aβ降解酶脑啡肽酶(neprilysin,NEP)活性的影响.方法 设立三月龄C57BL/6J野生型小鼠为对照组(0.5％CMC-Na),三月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠分别为模型组、橙皮素低、中、高剂量组(0、20、40、80mg/kg/d),灌胃1次/d,连续6个月.采用Morris水迷宫行为学实验观察小鼠的学习记忆能力;HE染色观察小鼠海马神经元形态;ELISA法检测小鼠血清中Aβ42含量;蛋白印迹法(Western Blot)检测小鼠脑组织Aβ42、脑啡肽酶(N E P)的表达.结果 与对照组相比,模型组小鼠寻找平台潜伏期明显延长(P<0.05),穿越平台次数减少(P<0.05),海马C A1区神经元有明显损伤,血清中Aβ42含量明显增加(P<0.05),脑组织中Aβ42含量明显增加(P<0.01)、N E P含量无明显差异;与模型组相比,橙皮素低、中、高剂量组小鼠潜伏期明显缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.01),海马C A1区神经元形态结构有明显改善,血清中Aβ42含量明显降低(P<0.01),脑组织中Aβ42含量明显降低(P<0.01)、橙皮素中、高剂量组N E P含量明显升高(P<0.01).结论 橙皮素早期干预能明显改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆能力和海马CA1区神经元损伤,其机制可能与提高NEP活性,增强Aβ42代谢有关.     

Phloretin对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制

目的:探讨Aβ25-35(β-amyloid)诱导PC12细胞凋亡过程中氯通道阻断剂Phloretin的保护作用及其机制.方法:采用MTT比色,LDH(lactate dehydrogenase)活力检测、Hoechst33258染色和琼脂糖凝胶电泳比较正常对照组、Aβ25-35损伤组和Aβ25-35 PMoretin组的PC12细胞存活与凋亡;Western Blot印迹检测3组的JNK,P-JNK蛋白表达.结果:10 mmol/L Phloretin可明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,提高细胞存活率,减少LDH释放,减少PC12细胞核固缩、碎裂,降低P-JNK蛋白的表达(P<0.01).结论:小剂量氯通道阻断剂Phloretin对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡具有保护性抑制作用,其机制与下调JNK的磷酸化激活有关.     

调心方对杏仁核注射Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病模型大鼠的影响

目的 研究调心方(HBR)对杏仁核注射β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致阿尔茨海默病(AD)模型大鼠相关病理变化的作用。方法 单侧杏仁核注射Aβ25-35造成AD大鼠模型，采用Morris水迷宫法、放射免疫法、免疫组化法、RT—PCR法，以Aricept为对照，观察HBR对AD模型大鼠的空间学习记忆能力、胆碱能系统、Aβ1-40沉积、tau蛋白异常磷酸化及脑额叶皮层内APPmRNA表达的影响。结果 HBR可显著改善Aβ25-35诱导的AD大鼠空间学习记忆障碍，提高模型大鼠的胆碱乙酰化转移酶(ChAT)活性及M受体结合容量(Rt)值，减少APPmRNA的表达和Aβ1-40的沉积，抑制tau蛋白的异常磷酸化。结论 HBR对Aβ25-35诱导的AD大鼠空间学习记忆障碍及胆碱能系统损害具有显著改善作用，可以明显减轻Aβ1-40的沉积和tau蛋白的异常磷酸化。     

高胆固醇对Aβ诱导神经元损伤和胶质细胞活化的影响

目的 探讨高胆固醇对Aβ诱导体外培养神经元损伤和胶质细胞活化的作用.方法 混合培养的海马神经元和胶质细胞随机分为3组:正常对照组、Aβ组(2μmol/L)和高胆固醇组(1mmol/L) Aβ组(2μmol/L);检测细胞培养上清液中LDH释放度;免疫荧光检测神经元形态改变;ELISA检测细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的含量.结果 高胆固醇 Aβ组LDH释放度(33.2±3.5)显著高于Aβ组(28.1±2.4),差异有统计学意义;高胆固醇 Aβ组神经元数目减少,神经突起断裂,突起回缩均较Aβ组明显;高胆固醇 Aβ组上清液中IL-6和TNF-α含量(29.6±5.2,42.6±5.1)最高,与Aβ组(20.8±4.6,35.5±3.6)相比差异有统计学意义.结论 高胆固醇增强Aβ诱导胶质细胞活化IL-6和TNF-α表达可能是高胆固醇加重Aβ诱导神经元损伤的机制.     

阿魏酸钠对β淀粉样蛋白25-35诱导的体外培养神经细胞损伤的保护作用

目的研究阿魏酸钠(SF)对β淀粉样蛋白25-35(A β25-35)诱导的原代培养神经细胞损伤的保护作用.方法以原代培养孕17～18d的SD大鼠胎鼠的大脑皮层神经细胞为观察对象.倒置显微镜下观察给药前后神经细胞的形态学变化,用MTT比色实验检测神经细胞活性,依据LDH漏出率检测神经细胞膜的损伤程度,以MDA生成量推测生物膜不饱和脂肪酸过氧化程度.结果与正常对照组相比,A β25-35(20μmol/L)处理24h,可使神经细胞活性显著下降(P<001),SF(10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,500μmol/L, 1ol/L)能剂量依赖地减轻A β25-35的细胞毒性.结论 SF能够对抗A β25-35诱导的培养皮层神经细胞的损伤.     

白藜芦醇对β淀粉样蛋白诱导星形胶质细胞氧化损伤的保护作用

目的 研究白藜芦醇对β淀粉样蛋白诱导星形胶质细胞氧化损伤的保护作用,从而探索其对中枢神经保护作用的可能机制.方法 采用不同浓度的白藜芦醇预处理星形胶质细胞12 h.继之用25 μmol/L浓度的β淀粉样蛋白进行损伤,然后检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)以及采用DHE探针测定荧光强度间接反映胞内活性氧(ROS)含量,以评价白藜芦醇对细胞氧化损伤的保护作用.结果 受β淀粉样损伤的细胞存活率明显下降(P<0.05),而用10、100 μmol/L白藜芦醇预处理则能提高该细胞的存活率(P<0.05),但1μmol/L白藜芦醇预处理的细胞存活率并无明显变化;荧光检测显示,蛋白损伤使得荧光强度增高(P<0.05),1μmol/L白藜芦醇处理组荧光强度大于阳性对照组,其余各组荧光强度均小于阳性对照组(P<0.05);蛋白损伤可导致细胞LDH漏出量增加(P<0.05),1 μmol/L白藜芦醇使得LDH漏出增加(P<0.05),而10、100μmol/L白藜芦醇处理组,细胞LDH漏出量明显减少(P<0.05).结论 星形胶质细胞受到β淀粉样蛋白损伤后,白藜芦醇能减少LDH的漏出及有效降低胞内ROS水平,从而显示对星形胶质细胞具有保护作用.     

丹蒌片对Aβ1-40致脑微血管内皮细胞损伤模型活性的影响

目的:观察丹蒌片对β淀粉样蛋白(β-Amyloid protein,Aβ)致脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)损伤模型活性的影响。方法:培养BMEC,用Aβ_(1-40)造成BMEC损伤,加入不同剂量的丹蒌片含药血清,6 h、12 h、24 h后用CCK8染色法检测细胞活性,并检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的漏出量。结果:与正常对照组比较,模型组细胞活性降低,细胞培养上清液中LDH释放量增加(P0.01)。与模型组比较,12 h后各剂量丹蒌片含药血清组细胞活性显著升高,12 h细胞活性高于24 h的细胞活性(P0.05);丹蒌片含药血清各组细胞培养上清液中LDH水平降低,12 h上清液中LDH水平显著低于6 h、24 h(P0.05);高剂量、中剂量含药血清组细胞上清液LDH水平显著降低(P0.05)。结论:丹蒌片能提高Aβ_(1-40)致BMEC损伤后细胞的活性,减少细胞LDH的漏出量,起到保护脑微血管内皮的作用。     

黄芩茎叶总黄酮对注射Aβ_(25-35)致大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的:探讨黄芩茎叶总黄酮(SSTF)对大鼠双侧海马注射Aβ25-35引起的海马神经元损伤的保护作用.方法:大鼠双侧海马注射Aβ25-35建立痴呆模型,并给予SSTF灌胃,观察海马神经元的形态变化及检测血清MDA含量.结果:模型组海马CA1区神经细胞脱失、肿胀,脱失处胶质细胞增生,SSTF给药组神经元损伤较轻l模型组大鼠血清中MDA含量显著高于对照组(P<0.01),SSTF给药组MDA含量明显低于模型组(P<0.01).结论:SSTF对海马注射Aβ25-35引起的海马神经元损伤有保护作用,其机制可能是减少A β引起的脂质过氧化产物堆积和对抗A β引起的胶质细胞增生.     

调心方、补肾方治疗Alzheimer病的比较研究

为比较调心方、补肾方治疗早老性疾呆(AD)的疗效,将30例中医辨证属心肾两虚的AD患者,以配对法随机分为A、B两组,分两阶段交叉给予调心方(由党参、桂枝、菖蒲、远志等组成)、补肾方(由熟地黄、枸杞子、山萸肉等组成),每阶段12W(间隔2W).观察各阶段MMSE、ADL和神经心理学量表(FOM、RVR、D文BS)的变化.结果调心方对AD患者的MMSE、FOM量表的疗效优于补肾方(P《0.05);对其它量表两方无差异(P》0.05).提示调心方改善心肾两虚型AD患者记忆障碍的作用优于补肾方.     

调心方有效部位对类AD大鼠大脑神经生长因子及其受体p75的影响

目的研究调心方有效部位（TX0201）对Aβ25—35所致类AD模型大鼠脑组织神经生长因子（NGF）及其受体p75调节机制的异同。方法采用双侧杏仁核注射Aβ25—35造成类AD大鼠模型，观察大鼠Morris水迷宫空间记忆能力，并分别通过免疫组化和RT—PCR方法研究类AD大鼠神经元NGF及其受体p75和APP mRNA变化以及TX0201的影响。结果类AD模型大鼠Morris水迷宫测试出现空间记忆能力下降，APP mRNA表达提高，神经生长因子减少，神经系统失去了营养保护。TX0201能有效控制以上病理变化。结论TX0201提高模型大鼠定向学习记忆能力，可能通过降低皮层、海马部位APP mRNA的表达，增加NGF阳性样细胞、减少p75受体阳性样细胞调节神经营养而发挥作用。提示通过有效调节神经生长因子是TX0201的重要作用机制之一。     

加味四逆散对应激性海马神经元损伤的保护作用

【目的】研究调肝方药加味四逆散对应激性海马神经元损伤的保护作用。【方法】运用大鼠海马原代无血清培养技术进行海马神经元原代培养,以高浓度皮质酮(CORT)和谷氨酸(Glu)建立应激性海马损伤的体外药理模型,制备体积分数10%加味四逆散含药血清。检测各组海马神经元存活率(四甲基偶氮唑盐法)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、细胞凋亡率(流式细胞仪法)以及细胞游离Ca2+浓度(Fura-2荧光探针法)。【结果】高浓度CORT和Glu使海马神经元细胞存活率显著下降、LDH漏出量显著增加、细胞凋亡率显著升高以及细胞内游离Ca2+浓度显著升高(P0.01)。体积分数10%加味四逆散含药血清能显著提高高浓度CORT、Glu条件下海马神经元的存活率,降低细胞凋亡率,减少LDH漏出量,并能降低神经元内游离Ca2+浓度(P0.05或P0.01)。【结论】调肝方药加味四逆散对应激性海马损伤具有明显的保护效应。     

Aβ1-42对大鼠基底前脑神经元KATP通道各亚基蛋白表达的影响

目的研究β淀粉样蛋白（Aβ_1-42）对原代培养基底前脑胆碱能神经元ATP敏感性钾通道（KATP）各亚基蛋白表达的影响,探讨阿尔茨海默病发病的细胞毒性分子机制。方法 运用细胞原代培养的方法培养大鼠基底前脑胆碱能神经元并进行鉴定, 用2μmmol/L的Aβ_1-42对原代培养细胞进行干预, 免疫荧光双染及免疫印记观察干预后不同时间(分别为0, 24, 72h)细胞KATP通道各亚基Kir6.1、Kir6.2和SUR1、SUR2蛋白表达水平的变化。结果与正常对照组比较,Aβ_1-42作用胆碱能神经元24h后, KATP通道亚基Kir6.1及SUR2蛋白表达显著增多(P<0.05),而亚基Kir6.2及SUR1蛋白表达无明显变化。但Aβ_1-42作用时间达72h后, KATP通道各个亚基蛋白表达均显著升高(P<0.05)。 结论 Aβ_1-422作用胆碱能神经元不同的时间段（24h和72h）,细胞KATP通道各亚基蛋白表达有不同程度的增加,且增加速度不一致。可能由此改变KATP通道的结构和功能,从而影响Aβ_1-42的神经细胞毒性作用。