RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的构建RNAi表达载体,并分析其对胰腺癌细胞PANC-1 survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,并把survivin基因克隆到T载体进行测序,构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1,RT-PCR、western-blot分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达,其基因序列与GenBank中公布的一致,干扰载体pTZU6＋1-svv2可以有效的抑制survivin的表达,抑制率约为74％,并诱导了肿瘤细胞的凋亡。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达并诱导胰腺癌细胞凋亡。     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达的实验研究

目的用RNA i方法抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达。方法用免疫细胞化学技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,构建针对survivin基因的siRNA表达载体并进行酶切和测序鉴定,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1,RT-PCR初步分析siRNA表达载体对survivin表达的抑制作用。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中有较高表达,siRNA表达载体可以有效的抑制survivin的表达,抑制率达60%。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达。     

靶向survivin基因的RNAi诱导喉癌Hep 2细胞凋亡的研究

目的通过构建RNAi表达载体,转染喉癌细胞株Hep 2,观察其对survivin表达的抑制作用。方法构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染喉癌细胞Hep 2,分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,检测细胞凋亡。结果survivin在喉癌细胞Hep 2中呈高表达,其基因序列与GenBank序列对比一致,干扰载体pGensil/survivin能抑制survivin的表达,抑制率为68%,并诱导了喉癌细胞的凋亡。结论针对survivin的小分子RNA可以有效抑制喉癌细胞Hep 2中survivin蛋白的表达,并促进喉癌细胞凋亡。     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肾癌786-O细胞的影响

目的 运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性阻断肾癌786-O细胞系中survivin基凶的表达,并研究survivin沉默后对786-O细胞的影响.方法 用真核转录载体pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体法转染肾癌786-O细胞,通过RT-PCR、免疫组化分别检测survivin基因的mRNA和蛋白水平的表达,MTT法检测细胞生长的影响.结果 干扰载体有效地阻断了786-O细胞中survivin基因在mRNA与蛋白水平上的表达,细胞活性受到抑制.结论 RNAi技术沉默survivin基因可以下调肾癌786-O细胞survivin基因的表达,抑制细胞的活性.     

靶向RNAi抑制survivin基因增强胰腺癌对厄洛替尼化疗敏感性的实验研究

目的:胰腺癌的化疗药物耐药是一个亟待解决的问题.存活素(survivin)基因是肿瘤化疗耐药的重要原因.运用RNAi载体抑制survivin的表达对增强胰腺癌对厄洛替尼敏感性的影响.为增强胰腺癌化疗敏感性奠定一定的实验基础.方法:培养胰腺癌细胞PANC-1,构建以U6为启动子的RNAi载体并转染PANC-1,运用FCM检测加入厄洛替尼前后胰腺癌细胞凋亡指数和Hoechest 33258检测凋亡形态,MTT检测转染前后IC50.结果:转染survivin的RNAi载体后48h,流式细胞仪检测的凋亡指数为15.24％±1.35％,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05);Hoechst33258染色显示,PANC-1细胞出现核皱缩、浓染和碎裂等典型的凋亡形态,MTT检测转染前及转染后48h厄洛替尼的IC50分别为(1.35±0.05) μg/mL,(0.46±0.08) μg/mL,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论:Survivin的RNAi载体,能有效地增强胰腺癌对厄洛替尼的化疗敏感性.     

RNAi沉默survivin基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的 通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达,研究survivin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法 将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4 DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后EJ细胞的凋亡变化.结果 酶切及测序证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体均能有效地阻断EJ细胞中survivin基因的表达,使survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的EJ细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-SVV2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论 重组真核载体能有效抑制EJ细胞的survivin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.     

生存素反义核酸提高胰腺癌细胞株对阿霉素敏感性的实验研究

目的研究生存素反义核酸诱导胰腺癌细胞株PANC-1的凋亡和增强对阿霉素敏感性的影响.方法我们应用构建的生存素反义核酸真核表达载体电转染PANC-1细胞;RT-PCR检测生存素mRNA表达、细胞计数和MTT实验测定转染后细胞对阿霉素敏感性;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果生存素反义核酸可抑制PANC-1细胞中生存素mRNA的表达,并能抑制PANC-1细胞生长,提高PANC-1对阿霉素敏感性,流式细胞仪检测凋亡率明显提高.结论生存素反义核酸能增强阿霉素诱导的PANC-1细胞凋亡,联合生存素反义核酸和阿霉素可以改善胰腺癌的治疗效果.     

靶向survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 采用RNA干扰技术（siRNA）阻断survivin基因的表达,观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。方法 构建靶向survivin的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine^TM2000转染胰腺癌细胞PC-2,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞survivin基因表达的变化;采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用：采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞survivin基因表达,在mRNA水平其表达抑制率为81．25％,在蛋白质水平其表达抑制率为74．24％。转染靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖,细胞接种24、48h后其增殖抑制率分别为28．00％和33.38％：转染后24、48h可以诱导8．46％、7．53％的细胞凋亡。结论 所构建的靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞survivin基因表达。阻断survivin基因表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡,靶向survivin的siRNA在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

维生素D3对胰腺癌PANC-1细胞中PTCH、Gli-1基因表达及细胞增殖凋亡的影响?

目的：观察不同浓度维生素D3对胰腺癌PANC-1细胞中相关基因表达及细胞增殖凋亡的影响。方法使用0、25、50、75、100μmol/L的维生素D3干预胰腺癌PANC-1细胞后,用MTT 法检测细胞的生长抑制率;用RT-PCR法检测干预后PTCH及Gli-1基因的表达情况,并用GeneGenius软件对电泳图进行灰度分析;流式细胞术检测干预后细胞的早期凋亡率。结果 MTT 结果显示,不同浓度维生素D3干预后,PANC-1细胞的增殖均受到不同程度的抑制。 RT-PCR 电泳图及灰度扫描结果显示,随着药物浓度的增加及作用时间的延长, PTCH 及Gli-1基因的表达水平基本呈逐渐下降趋势。流式细胞术结果显示,维生素D3可以促进PANC-1细胞的早期凋亡。结论维生素D3可以有效抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖并促进细胞的凋亡,此作用可能与其阻滞Hedgehog 信号通路有关。维生素D3可作为一种新型的Hedgehog 信号通路阻滞剂发挥抗胰腺癌作用。     

survivin基因沉默对腺样囊性癌细胞生长和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰下调survivin基因表达后腺样囊性癌细胞生物学行为变化及其与caspase-3基因表达的相关性.方法 设计、合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-2细胞株,G418筛选阳性克隆.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测转染后的ACC-2细胞中survivin、caspase-3 mRNA及蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,原位细胞凋亡(TUNEL)法及透射电子显微镜研究细胞凋亡.结果 测序证实表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-survivin的ACC-2细胞株中,survivin mRNA及蛋白表达明显降低(P＜0.05),caspase-3 mRNA及蛋白表达明显增加(P＜0.05),survivin与easpase-3的mRNA和蛋白表达呈显著负相关(r=-0.333,P＜0.05).ACC-2细胞增殖受到抑制,透射电镜及TUNEL法可见细胞出现凋亡.结论 成功构建了survivin基因的RNAi真核表达载体,pGenesil-shRNA-survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性痛细胞生长.     

Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达?方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达?结果:不同序列的siRNA和shRNA转染入HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降?结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础?     

RNA干扰技术用于survivin基因表达的研究

目的：构建pSUPER-SVV表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证survivin基因表达是否受到抑制。方法：设计特异性以survivin基因为靶序列的寡核苷酸序列,退火后将其连接于pSUPERbasic载体中,经测序鉴定插入序列的正确性。以脂质体转染方法将pSUPER-SVV干扰质粒转染人类宫颈癌（HeLa）细胞,应用流式细胞术和RT-PCR方法检测survivin基因的表达情况。结果：成功构建survivin的RNAi表达载体。该载体可以使HeLa细胞中survivin基因在mRNA转录水平明显降低,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.05）。利用流式细胞术检测蛋白表达水平,转染pSUPER-SVV组抑制率可达31.62%,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.001）。结论：成功构建干扰survivin基因表达的载体,转染HeLa细胞后survivin基因在mRNA转录水平、蛋白表达水平均受到明显抑制。     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其表达

目的 构建针对人caspase-8 基因mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用.方法 化学合成针对caspase-8发夹状的RNA寡核苷酸,将其退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果 成功地构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSUPER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2.结论 成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达.     

RNAi沉默Survivin基因对人甲状腺癌SW579增殖的影响

目的:应用RNAi技术封闭Survivin基因,对甲状腺癌细胞增殖的影响,探讨RNA干扰survivin基因表达治疗甲状腺癌的可行性。方法:实验设为空白组、脂质体组、阴性对照组和RNAi组。RNAi组是针对Survivin基因的有效序列合成DNA正义链及反义链,经变性、退火,形成双链DNA,与pGenesil-1线性质粒构建重组体,经脂质体转染SW579细胞。各组利用RT-PCR、Western-bloting检测survivin表达情况;MTT法检测细胞增殖的变化,流式细胞仪检测转染后SW579细胞凋亡的变化。结果:RT-PCR、Western blotin结果显示,转染survivin基因重组体组的mRNA和蛋白水平的表达与其它各组比较均明显下调(P<0.01),转染后SW579细胞生长率下降,凋亡指数明显增加(P<0.01)。结论:特异封闭survivin基因,能够有效地抑制甲状腺癌细胞的增殖,诱导其凋亡的发生。     

野生型及突变型survivin基因重组逆转录病毒的构建及表达研究

目的构建含绿色荧光蛋白和野生型及第34位氨基酸突变型survivin基因的双顺反子逆转录病毒载体,并进行真核细胞表达.方法用PCR的方法由含survivin基因的真核表达载体扩增所需目的片段,然后将该片段插入逆转录病毒载体pMIG.酶切鉴定重组子,脂质体介导下转染包装细胞Phoenix E,病毒上清感染NIH3T3细胞,RT-PCR检测外源基因mRNA的表达、流式细胞仪检测GFP的表达从而确认外源基因的转录.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的片段成功的连接到pMIG载体上.载体转染NIH3T3细胞,RT-PCR显示目的片段mRNA能够表达,流式细胞仪检测GFP获良好的表达.结论成功构建了人survivin基因野生型及突变型逆转录病毒,并在NIH3T3细胞进行了表达,为下一步的研究工作提供了有效的分子工具,并且为将来能在体内应用抑制survivin基因表达的肿瘤治疗奠定基础.     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。