B7特异性siRNA对树突状细胞功能的影响

目的探讨体外合成的B7特异性小干扰RNA（siRNA）对树突状细胞（DC）功能的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达,用ELISPOT检测DC与淋巴细胞共培养后T细胞分泌IFN-γ,用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应和CTL特异性杀伤率。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（80．9±5．23）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（74．7±4．63）％。经转染B7-1、B7-2分子特异性siRNA的DC激活后,T淋巴细胞分泌IFN-γ分别为（84．6±23．1）10^3／L和（76．7±19．7）10．3U／L明显低于对照组（204．5±46．2）10^3U／L;各组DC刺激淋巴细胞增殖指数（PI）分别为1．73±0．32和1．53士0．25,也低于对照组4．23±0．74。CTL杀伤实验结果表明：对照组的特异性杀伤率为（76．4±7．6）％,siRNA1和siRNA2组的特异性杀伤率分别为（14．4±3。6）％和（18．6士4．7）％,低于对照组。结论B7特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,并可降低DC激活T淋巴细胞增殖和CTL的细胞毒性,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受和治疗自身免疫性疾病提供了新思路和方法。     

大黄素在小鼠皮肤移植中的免疫抑制作用的实验研究

目的：研究大黄素对小鼠皮肤移植的免疫抑制作用,探讨其可能的作用机制。方法：建立小鼠C57BL／6→BALB／c异体皮肤移植模型。以大黄素和环孢素A（CsA）分别灌胃,观察不同药物及药物浓度对小鼠皮肤移植物存活时间的影响。采用ELISA法检测大黄素和CsA对皮肤移植小鼠血浆IL-2表达水平的影响,组织学观察不同药物浓度对移植物病理变化的影响。结果：大黄素显著降低小鼠血浆内IL-2的浓度,同时伴有移植物的存活时间的延长,组织学观察发现大黄素可以减轻移植排斥反应的强度,其作用表现出量效依赖性,并与CsA具有协同性。结论：大黄素能够减轻C57BL／6→BALB／c异体皮肤移植的排斥反应强度,其作用机制可能与抑制IL-2的分泌有关。     

免疫抑制剂在大鼠同种异体肢体移植中的应用

在大鼠同种异体肢体移植术后应用免疫抑制剂仍然是克服急性移植排斥反应的主要手段。第二代免疫抑制剂环胞霉素A(CsA)和FK - 5 0 6主要阻断免疫活性细胞的白细胞介素 2 (IL - 2 )的效应环节 ,因其以淋巴细胞为主而具有相对特异性。在大鼠同种异体肢体移植术后应用CsA和FK - 5 0 6能有效抑制急性移植排斥反应 ,延长移植肢体存活时间 ,并在与其他药物联合应用中寻求更好效果     

阻断ICOS对小鼠移植胰岛功能影响的实验研究

目的：在小鼠胰岛移植模型基础上，通过阻断可诱导共刺激分子（ICOS）。探讨ICOS单克隆抗体（ICOSmAb）对移植胰岛功能的影响。方法：供体为近交系昆明小鼠，受体为C57小鼠。受体小鼠随机分成5组，每组10只。假手术组：受体小鼠仅行开腹手术，不行胰岛移植；对照组：单纯胰岛移植，不给ICOS mAb；实验1、2、3组：分别于胰岛移植后1、3、5d腹腔内注射ICOSmAb50、100、200μg/kg。观察小鼠胰岛移植后移植物存活时间和移植胰岛病理改变，流式细胞仪检测ICOS在T淋巴细胞上的表达。结果：实验2组小鼠移植胰岛存活时间和实验3组相同，统计学分析无显著性差异，而较对照组及实验1组明显延长（P〈0．05）。ICOS在移植术后7d受体小鼠T淋巴细胞上表达明显上调。结论：ICOS分子在小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中表达上调。参与了排斥反应的发生。ICOSmAb通过阻断ICOS共刺激信号途径，诱导小鼠同种异体胰岛移植免疫耐受，减轻排斥反应，延长移植胰岛有功能存活时间。ICOS mAb的最佳给药剂量为100μg/kg。     

胸腺肽α1对皮肤移植小鼠免疫功能的影响

目的 本研究拟通过建立C57-BABL/c小鼠同种异体皮肤移植模型,观察胸腺肽α1（Tα1）对皮肤移植小鼠免疫功能的影响,同时探讨Tα1在体内诱导移植免疫耐受的机制。方法 取80只C57小鼠作为供体,80只BABL/c小鼠作为受体,建立C57-BABL/c小鼠同种异体皮肤移植模型,将移植术后的受体小鼠分为4组:A组,对照组（移植后不给予任何药物,n=20）;B组,环孢素A（CsA）治疗组（移植后给予CsA 10 mg/kg,n=20）;C组,Tα1治疗组（移植后给予Tα1 400 μg/kg,n=20）;D组,联合治疗组（移植后给予CsA 10 mg/kg+Tα1 400 μg/kg,n=20）。上述药物每日腹腔注射1次,共注射21 d。观察、记录移植皮片存活情况;各组分别于移植术后第1、7、14、21 d处死5只小鼠,取血行液相芯片细胞因子检测;取移植皮片作HE染色;取小鼠脾脏淋巴细胞行流式细胞术检测T细胞分化。结果 在移植后第1、7、14、21 d,同时点B、C、D组与A组相比,D组分别与B组、C组相比,白细胞介素（IL）-1、IL-2、IL-6、IL-17均降低（ P<0.05）,而IL-10均升高（ P<0.05）;而 B、 C两组相比差异无统计学意义。CsA与Tα1单药对细胞因子的作用类似,而联合用药能加强单药效果。B组及D组CD4/CD8比例倒置。D组CD4+CD25+ T细胞数高于其他组,差异有统计学意义（ P<0.05）。结论 移植后使用Tα1,在一定程度上能减轻T细胞对移植物的损伤,但不能完全阻止排斥反应的发生。     

RNA干扰靶向抑制酪氨酸蛋白激酶对哮喘小鼠树突状细胞功能的影响

目的 通过特异性微小干扰RNA(siRNA)靶向抑制小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的酪氨酸蛋白激酶(Syk)的基因表达,阻断树突状细胞的成熟,从而阻断Syk所介导的细胞内及细胞间的信号传导通路,研究Syk与DC之间的关系.方法 化学法合成21-23 bp的小鼠树突状细胞Syk基因siRNA片段A、B、C、D,用Lipofectamine 2000作为转染试剂,将siRNA片段转染哮喘小鼠骨髓来源DC,作用48 h后再与正常小鼠脾脏来源T淋巴细胞混合反应48 h,之后用ELISA法检测T淋巴细胞分泌细胞因子(IL-4、lL-13、IL-2和INF-γ)的水平.用Western Blot检测DC表达Syk蛋白的量,判断Syk基因是否被沉默,剔除无效片段.结果 siRNA片段A、C、D干扰组小鼠DC细胞Syk蛋白表达减少;B组没有明显变化,为无效片段.siRNA干扰组IL-4、IL-13的水平较未干扰组明显下降(P均<0.05),IL-2和INF-γ水平无显著差异(P>0.05).结论 Syk特异性SiRNA能够有效抑制Syk基因表达,可阻遏DC的抗原递呈作用以及活化、分化T淋巴细胞的功能.     

选择素在大鼠同种异体皮肤移植皮片的表达

目的通过检测选择素P、选择素E在同种异体大鼠皮肤移植后免疫排斥反应中的表达,研究组织工程皮肤的组织相容性.方法取SD大鼠皮肤和实验室培养的组织工程SD大鼠皮肤移植于成年Wistar大鼠,移植成功后取不同时间点标本用免疫组织化学方法检测选择素P、选择素E在组织中的表达.结果同种异体皮肤移植组,选择素P、选择素E有显著表达,组织工程皮肤移植后,局部组织中水平显著低于同种异体皮肤移植组.结论选择素P、选择素E的改变与同种异体皮肤移植后的免疫排斥反应呈正相关,组织工程皮肤只具有很弱的免疫原性,不引起显著的排斥反应.     

RNA干扰抑制树突状细胞CD80和CD86基因表达研究

目的探讨体外合成的小干扰RNA（siRNA）对人树突状细胞（DC）共刺激分子CD80和CD86基因表达的影响。方法设计并合成了3条siRNA（siRNA1、siRNA2和siRNAc）,在脂质体的介导下转染树突状细胞,于转染后24、48、72h收集细胞,用半定量RT-PCR检测CD80和CD86 mRNA的变化,用蛋白印迹检测CD80、CD86蛋白的表达。结果转染24、48、72h后,DC CD80 mRNA均有明显减少（P〈0.01）,抑制率分别为（50.0±3.63）%、（66.8±4.12）%和（76.6±4.87）%;CD86 mRNA均有显著降低（P〈0.01）,抑制率分别为（53.0±3.70）%（、60.5±3.92）%和（73.4±4.46）%,而单纯脂质转染和siRNAc转染对CD80、CD86 mRNA表达均无影响（P〉0.05）。Western Blot结果显示转染48、72h后,siRNA1对CD80蛋白表达的抑制率为（67.3±4.80）%和（80.9±5.23）%;siRNA2后对CD86蛋白表达的抑制率为（60.7±4.15）%和（74.7±4.63）%。结论 siRNA可特异抑制树突细胞B7基因的转录和表达,为进一步研究siRNA诱导移植免疫耐受提供了理论和实验基础,为诱导器官移植免疫耐受提供了新思路和途径。     

KSHV编码的趋化因子vMIPII在小鼠异体皮肤移植免疫排斥反应中的作用

目的　重组vMIPII在大肠杆菌中表达及其纯化。观察纯化的vMIPII蛋白对小鼠异体皮肤移植免疫排斥反应的抑制作用。方法　以 pET3 2a为vMIPII克隆基因的表达载体 ,以大肠杆菌BL2 1(DE3 ) plysS为表达菌 ,诱导表达出硫氧还蛋白 vMIPII的融合蛋白 (2 6× 10 3 D)。经金属离子亲和吸附、肠激酶消化以游离vMIPII、阳离子交换层析等步骤纯化目的蛋白。纯化的vMIPII从尾静脉连续 14d注入异体皮肤移植小鼠 (昆明鼠 /Balb/c)。结果　从 1L发酵菌液中可获得高纯度目的蛋白约 4mg。注射vMIPII的异体皮肤移植小鼠组移植皮存活时间较未注射对照组延长 7d。结论　纯化的重组vMIPII对小鼠异体皮肤移植免疫排斥反应有明显的抑制作用 ,能显著延长移植皮的存活时间     

大鼠输注经紫外线照射的供体脾细胞后神经移植中T淋巴细胞亚群的变化

目的：通过尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞后进行同种异体坐骨神经移植，观察免疫排斥过程中大鼠T淋巴细胞亚群的变化，探讨周围神经缺损修复的可行性。方法：实验分自体神经移植组（自体移植组、A组）、异体神经移植组（异体移植组、B组）、尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞后进行异体神经移植组（后行移植组、C组）。分别在移植术后第3d、第7d、第14d、第28d，用荧光标记CD4、CD8单抗作用后，流式细胞仪检测T淋巴细胞及其亚群百分数和CD4／CD8比值。结果：与A组比较，第7d，B组和C组小鼠外周血CD。阳性细胞百分率和CD4／CD8比值显著增高（P〈0．05，P〈0．01）；第14d，B组小鼠外周血CD4、CD8阳性细胞百分率和CD4／CD8比值明显增高（P〈0．05，P〈0.01），C组小鼠外周血CD4、CD8阳性细胞百分率明显增高，CD4／CD8比值明显下降（P〈0．05）；第28d，B组和C组小鼠外周血CD4、CD8阳性细胞百分率和CD4／CD8比值明显增高（P〈0．05，P〈0．01）。结论：紫外线照射供体特异性抗原可以有效地诱发机体产生免疫耐受，从而减轻免疫排斥反应。     

雷帕霉素联合未成熟树突状细胞诱导小鼠皮肤移植免疫耐受

目的 研究雷帕霉素联合供者骨髓来源的未成熟树突状细胞在诱导小鼠同种异基因皮肤移植免疫耐受中的协同作用.方法 健康雄性C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠分别为供者、受者,建立同种异基因皮肤移植模型.对照组术前术后未给予任何免疫干预措施;雷帕霉素组术后第0天至第6天给予雷帕霉素灌胃;未成熟树突状细胞组将供者骨髓来源的未成熟树突状细胞于术前第7天经尾静脉输注给受者;联合组将供者骨髓来源的未成熟树突状细胞于术前第7d经尾静脉输注给受者,并在术后第0天至第6天给予雷帕霉素灌胃.结果 对照组、雷帕霉素组、未成熟树突状细胞组、联合组的皮肤移植物存活时间分别为(6.9±1.9)、(12.3±3.0)、(17.0±3.4)、(20.8±3.6)d.方差分析提示组间差异有显著性意义(P<0.05);SNK检验提示各组之间的差异均有显著意义.结论 雷帕霉素能延长小鼠皮肤移植物的存活时间;联合供者骨髓来源的未成熟树突状细胞可延长免疫耐受的持续时间.     

脂质体瞬时转染siRNA抑制肾小管上皮细胞AngⅡ 1型受体表达

目的建立有效的脂质体瞬时转染法,转染小分子RNA（siRNA）,抑制人肾小管上皮细胞（human kidneytubular epithelial cells,HKC）血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1型受体（AT1R）的表达。方法针对人AT1R mRNA135到156位点,由美国Ambion公司设计并合成AT1R siRNA序列,以脂质体法瞬时转染至HKC,利用RT-PCR及Western blot技术检测HKC内AT1R mRNA及蛋白表达。结果AT1R siRNA转染对人肾小管上皮细胞AT1R的抑制效果在48h达到最大抑制作用;转染后,HKC细胞AT1R mRNA表达下调（68.5±6.4）%,AT1R蛋白表达下调（80.7±5.3）%,与对照组比较存在显著性差异（P〈0.001）。使用AngⅡ刺激,特异性AT1R siRNA转染组AT1R表达明显下降,无转染及非特异性转染组AT1R表达升高。特异性AT1R siRNA转染HKC细胞后,其炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达明显下降。结论本研究利用脂质体瞬时转染siRNA方法,成功抑制肾小管上皮细胞表达AT1R,为后续相关研究提供实验方法。     

气道内注射负载卵白蛋白多肽的树突状细胞可诱导肺内炎症

目的探讨树突状细胞(DCs)作为免疫治疗载体气道内注射的可行性。方法取BALB/c小鼠骨髓单个核细胞,以重组小鼠粒-巨细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)+重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导培养DCs。经磁珠纯化后得到的DCs用卵白蛋白323-339氨基酸区(OVA323-339多肽)冲击24 h。DC-OVA组小鼠按每鼠2×106细胞数进行小鼠气道内接种。DC组小鼠以DCs直接进行气道内接种作为阴性对照。接种后次日起以1%OVA雾化,连续5 d。经典哮喘模型组小鼠采用经典OVA腹腔注射致敏及激发方法复制哮喘模型作为阳性对照。末次雾化后24 h处死小鼠,分析肺脏病理学表现、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞成分。结果 DC-OVA组小鼠肺内呈现小支气管及血管周围大量炎细胞浸润,杯状细胞增多,BALF中细胞数明显增多,血清中OVA-特异性IgE水平与经典复制哮喘模型组OVA-特异性IgE水平相似[(48.22±4.76)U/mL比(52.75±4.03)U/mL,P0.05]。采用该方法复制的模型与采用经典方法复制的哮喘模型表现相似。DC组肺组织无明显的炎症,血清中的OVA-特异性IgE水平低于检测的敏感度。结论体外抗原负载后的DCs气道内注射具有活力并能有效递呈抗原,DCs可能作为免疫治疗的载体。     

过表达Plk-1对gemcitabine诱导的胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的观察Plk-1基因过表达对gemcitabine诱导胰腺癌细胞AsPC-1化疗敏感性的影响。方法①将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组,转染空载体设为对照组,无处理组设为空白组,转染24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,利用RT-PCR法及Western blot鉴定AsPC-1细胞内Plk-1基因和蛋白表达水平。②采用流式细胞术检测转染组细胞凋亡的改变。③不同浓度gemcitabine作用于转染细胞,MTT法测定转染48 h后细胞增殖能力。结果①测序结果表明成功的从AsPC-1细胞总RNA中扩增Plk-1基因。RT-PCR结果表明：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1 mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Western blot结果显示：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1基因的蛋白表达水平为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。②在gemcitabine作用下,pcDNA3.1/Plk-1转染组细胞凋亡率明显低于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。③AsPC-1/Plk-1转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论胞浆过表达Plk-1活性分子可明显降低gemcitabine诱导的AsPC-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的耐受性。     

MyD88在OK-432诱导树突状细胞成熟中的作用

目的探讨小鼠骨髓树突状细胞（Dcs）髓性分化蛋白88（MyD88）在OK-432诱导DCs成熟中的作用机制。方法分离小鼠骨髓单核细胞（BMMCs）,在含10％胎牛血清、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素-4（rmIL-4）的培养体系中诱导培养,所得的细胞即为DCs。于培养的第5天,将细胞分为3组：对照组不加OK-432和MyD88siRNAOK-432组加入终浓度为5μg／mL的OK-432;RNA干扰组加入MyD88siRNA12h后,再加入5μg／mLOK-432刺激。半定量RT-PCR法检测DCs中MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性。结果OK-432组DCs的MyD88高表达、TNF-α和IL-12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应,而用MyD88siRNA干扰后以上效应均降低（P〈0．05）。结论靶向MyD88siRNA可明显抑制小鼠DCs中MyD88的表达和OK-432诱导的DCs成熟,表明MyD88介导OK-432诱导的DCs成熟。     

半相合基因骨髓细胞移植治疗小鼠肾癌的实验研究

目的探讨半相合基因骨髓细胞移植的嵌合体水平对移植物抗肿瘤效应（Graft-Versus-Tumor effect,GVT）、移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host Disease,GVHD）的影响及其机理。方法 25只8-12周龄BALB/C小鼠随机分为3组：混合型嵌合体组（A组10只）、完全型嵌合体组（B组10只）、对照组（C组5只）。A、B组小鼠行直线加速器全身照射,剂量分别为4Gy、8Gy,照射后4-6h内经尾静脉注射入CB6F1代小鼠的骨髓细胞（5×106/只）,C组无处理。A、B、C三组均给予Renca肾癌细胞腋窝下注射,每只2.6×106个肾癌细胞。观察肿瘤生长速率,流式细胞仪测定A、B组小鼠移植后不同时间的嵌合体水平。荷瘤32d时断颈处死小鼠,剥离肿瘤称重;留取血浆,ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）方法测定血浆白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）,干扰素-γ（Interferon Gamma,IFN-γ）浓度;取肿瘤组织做成石蜡切片后行HE染色,测定肿瘤坏死面积比;留取小鼠的皮肤、肝脏及小肠用于制备石蜡切片,并行HE染色,观察GVHD。结果血液白细胞中供者源细胞比例：A组移植2周后形成混合嵌合体并达高峰,3-4周时下降至10%以下。B组小鼠移植后14d形成完全供者型嵌合体（供体细胞〉90%）,28d后仍达90%以上。与C组和A组相比,B组的肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤重量显著减小（P〈0.01）,抑瘤率高达52%,IL-2、IFN-γ水平显著升高（P〈0.01）,肿瘤组织坏死面积比显著升高（P〈0.01）。病理学检查未见肝、小肠及皮肤出现GVHD明显变化。结论完全型嵌合体水平的半相合基因骨髓细胞移植能够激发小鼠系统性的抗肿瘤免疫反应,抑制肿瘤生长,其机理可能是肿瘤坏死增加。     

胆管癌肿瘤裂解物修饰和P53基因导入对树突状细胞免疫效应的影响

目的 :研究胆管癌裂解物对转染全长野生型P5 3的树突状细胞 (DC)免疫功能的影响。方法 :用腺病毒作为介质 ,将全长野生型P5 3转染入DC ,然后用胆管癌裂解物修饰已转染全长野生型P5 3的DC(LywtP5 3DC) ,检测这种DC表面分子B7 1、B7 2、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ表达的高低 ,诱导特异的细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)的能力 ,对小鼠的免疫保护和对动物模型治疗作用。结果 :经流式细胞仪检测胆管癌裂解物刺激的野生型P5 3DC表面高表达B7 1(86 .70 %± 0 .0 7% )、B7 2 (18.77%± 0 .0 8% )、MHC Ⅰ (87.2 0 %± 0 .0 5 % )、MHC Ⅱ (5 6 .70 %± 0 .0 7% ) ,单纯DC低表达 ;LywtP5 3DC能够特异性地杀伤胆管癌细胞 ,杀伤率为 81%。LywtP5 3DC治疗组和其它组在肿瘤生长的直径大小之间有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,在LywtP5 3DC治疗组中 ,肿瘤生长明显减慢。结论 :全长野生型P5 3基因转染 +胆管癌裂解物联合修饰的DC能诱导细胞毒性T淋巴细胞的特异性 ,显著地提高DC的抗原提呈功能 ,体外能诱导高效而特异的抗胆管癌免疫效应。     

大鼠肾移植后移植肾内树突状细胞的早期观察

目的 观察大鼠肾移植后早期移植肾内树突状细胞(DC)的变化规律,藉此探讨排斥反应的防治.方法 受体Wistar大鼠30只,按5只/组随机分为6组,35只SD大鼠作为供体,其中5只供肾作为对照组,不行受体手术.其余均行同种异体原位肾移植术,并分别于开放供肾循环后1、6、12、24、48、72 h切取移植肾,行石蜡包埋切片,抗S-100蛋白免疫组化染色和HE染色.观察移植肾病理学改变及肾小球内DC数量变化.结果 各组切片均未见肾小管肾炎、动脉内膜炎等AR表现.对照组及术后1 h组肾小球内DC数量基本为零;此后逐渐增加;24 h组达到顶峰,其均数与其他各组相比,差异显著(Pmax=0.038);随后DC数量缓慢下降.结论 大鼠肾移植术后72 h内,供肾肾小球DC数量呈单峰曲线变化:受体DC不断迁入、迁出供肾是其变化的主要原因;揭示移植肾内DC变化规律有助于进一步完善免疫抑制剂及抗炎药物的使用方案.