一种感受态细菌的制备方法

目前,尽管分子克隆实验中通常采用的感受态细菌的制备方法可满足一般的实验要求,但对于获得比较困难的DNA分子而言,最大限度地提高质粒转化细菌菌株的效率,对提高实验成功率无疑具有重要意义[1]。我们通过摸索,建立起一种方便、快捷、重复性好,转化效率高的感受态细菌的制备方法,介绍如下。1 材料与方法1.1 缓冲液的配制 配制100ml(pH6.2)缓冲液,各组分终浓度分别为:KCl 100mmol,CaCl2 50mmol,Glucose 10％,KAc 10mmol。0.22μm滤器滤过除菌,4℃保存,3个月有效。1.2 实验步骤 取单克隆细菌DH—5α接种于含有1ml LB培养基的试管中,37℃温育,振摇过夜;将上述菌液1ml加至100ml LB培养基中,37℃摇床(250r/min)振荡培养3h至OD≈0.5;菌液离心,4℃,4000r/min,离心10min,弃去上清液;     

大量提取质粒的简便方法

0　引言　质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作 .我们介绍一种非常简便的大量提取质粒方法 ,此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定、转化、探针标记等 .菌种为转化了重组 p U C19质粒的 DH5α E.coli.重组 p UC19质粒为在 H inc II位点插入不同的 PCR产物连接而成 .1　方法　挑一个单菌落接种于 5 m L L B/ Amp(含氨苄青霉素0 .1g· L-1 )培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,转 1m L菌液于 10 0 m L L B/ Amp培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,将菌液倒入两个 5 0 m L离心管 ,10 0 0 0 g离心 2 min,弃去上清 ,沉淀中加入 4…     

外源性指导序列体外转换临床大肠杆菌氯霉素抗性表型的实验研究

目的 研究外源性指导序列(EGS)体外逆转临床分离大肠杆菌氯霉素抗性的能力。方法 构建针对氯霉素(Cm)乙酰转移酶(cat)并含卡那霉素(Km)抗性基因筛选指标的：EGS重组质粒以及只含Km抗性基因但不含EGS的对照质粒。采用CaCl2方法将重组质粒导入临床分离的耐Cm大肠杆菌株中。通过质粒抽提、菌落PCR鉴定EGS阳性克隆子,分光光度计A600检测导入EGS质粒后耐Cm菌株在液体培养基中的生长率以及KB法检测在固体培养基中的药物敏感试验,探讨EGS分子逆转耐药菌的逆转效应。结果 以pEGFP-CI-EGS cat1 cat2重组质粒对16株临床分离的Cma大肠杆菌供试菌进行转化试验,EGS转化子在含Km的培养基上筛选。其中4株转化菌在Cm100～200μg／ml的液体培养基中生长受抑;在Cm 100～200μg／ml的固体培养基中药敏试验对Cm敏感;转化菌质粒抽提检测出特异EGS条带;菌落PCR扩增鉴定存在EGS。表明16株供试菌中4株临床分离株获得了耐药菌型的表型转换、耐Cm的大肠杆菌临床分离株恢复了对Cm的敏感性。结论 EGS分子具有逆转临床耐药菌为敏感菌的能力。     

外源指导序列逆转淋球菌多重耐药性

目的 研究外源指导序列(external guide sequence,EGS) 在体外逆转淋球菌多重耐药株为敏感株中的作用.方法 构建针对多传递耐药(multiple transferable resistance,mtr)系统中MtrC基因,并含卡那霉素抗性基因的EGS重组质粒pET-28a( )-EGS-MtrC,采用常规CaCl2法将重组质粒导入临床分离的多重耐药淋球菌中,通过菌落PCR进行鉴定,并利用分光光度计检测阳性转化菌在含不同浓度氨苄西林的培养基中的生长情况,测定淋球菌转化前后对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的最小抑菌浓度(MIC).结果 PCR结果显示阳性转化菌含有预期大小的转化片段;多重耐药淋球菌在浓度为50、100 μg/ml的氨苄西林培养基中生长良好,而导入EGS-MtrC的转化菌在含100 μg/ml氨苄西林的培养基中不能生长,在50 μg/ml氨苄西林培养基中生长受抑制.导入EGS-MtrC的转化菌对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的MIC值均有明显下降.结论 pET-28a( )-EGS-MtrC转化淋球菌成功;导入EGS-MtrC的转化菌部分恢复了对氨苄西林的敏感性;转化菌对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的敏感性增加.     

特殊细菌L型一例

近几年来,有关细菌L型的报道很多,但对L型菌的丝状(F)型报道极少,现将我们分离的一例报道如下。 一、材料: 1.L型平板:使用改良Kagan培养基,牛肉浸液800ml,蛋白胨20g,NaCl 50g,琼脂8g。调节pH至7.4,10～15 1b 15min灭菌后冷至56℃,加入人血浆200 ml即成。 2.细胞壁染色液:(1) 10％鞣酸,秤取鞣酸10g,加蒸溜水至100ml。 (2)0.5％结晶紫:取4％的结晶紫酒精溶液5ml,加蒸馏水至40 ml,混匀。 二、分离:将脓标本接种血平板,放35℃孵箱培养24h后,长出针尖大小、乳白色,较干燥之菌落,涂片进行革兰氏染色,菌体呈长丝状、分枝状、疑为L型菌。进行细胞壁染色,菌体具有程度不同的细胞壁缺陷。随即转种于L型平板进行菌落观察及返祖试验,并用另一L型平板进行药敏试验。     

细胞凋亡显像剂99mTc-膜联蛋白Ⅴ的制备与体内分布

将本室改造的毕赤酵母接入100ml BMGY培养基培养24h,离心收集酵母细胞并重悬于100ml BMMY培养基,每12小时加入终浓度为0.5%甲醇诱导表达具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V。48h后离心沉淀培养基,获得的上清经硫酸氨沉淀、分子筛分离纯化蛋白;SDS-PAGE鉴定其相对分子质量     

圆弧青霉提取物诱发人羊膜FL细胞DNA损伤性研究

将从食管癌高发区河南林县粮食中分离到的4株圆弧青霉接种于Raulin—Thom培养基,25℃培养12天.菌液经氯仿萃取得棕褐色粉末状提取物,菌丝体经乙醇、氯仿、醋酸乙酯提取得褐色膏状物。应用程序外DNA合成(Unscheduled DNA synthesis,UDS)和DNA合成抑制(DNA synthesis inhibi-tion,DSI)试验对两种提取物进行诱变性研究,在不加S9性况下,3株菌液和菌丝体提取物诱发人羊膜FL细胞UDS,2株菌液和菌丝体提取物明显地抑制人羊膜FL细胞DNA合成(P<0.05或P<0.01),并呈剂量相关性.加S9组分后UDS和DSI减弱或消失.同时发现菌液提取物对细胞DNA损伤作用较菌丝体为强.提示两种提取物中均含有直接诱变物,与人类食管癌的关系值得进一步研究。     

人直肠癌细胞系HR-8348 DNA转化活性的研究及其初步鉴定

从国内建立的人直肠癌细胞系HR-8348提取基因组DNA,与pSV2neo质粒DNA共同转染大鼠成纤维细胞系rat-1细胞.HR-8348细胞DNA 80μg,pSV2neo质粒DNA4μg;采用磷酸钙沉淀法共转染10~6rat-1细胞,用含G418(400μg/ml)的DMEM培养液筛选.转染1周后,未加pSV2neo质粒DNA的对照组rat-1细胞全部死亡.2周后,从G418筛选后转染细胞长出的集落中,挑出具典型形态转化的细胞克隆4个.HR-8348DNA转化灶形成率为0.05个/(1μgDNA·10~6细胞).将其中C1-6转化灶扩     

聚合酶链反应用于人巨细胞病毒B基因编码区段的体外扩增

作者采用聚合酶链反应(PCR)成功地从含人巨细胞病毒B基因的重组质粒pBH_2DNA中扩增及分离了B基因编码区段及其产物糖蛋白52kd抗原编码区段。0.2μg的模板DNA经过30次循环,目的基因片段的扩增量达到10μg,足以用于酶谱分析及克隆的构建。     

用不同浓度的大剂量阿托品抢救2例有机磷农药中毒的体会

1982年6～7月间,我院收治2例甲胺磷农药中毒患者,分别使用不同浓度(0.5mg/ml和1mg/m1)的大剂量阿托品静脉推注,同时加用解磷定等抢救获得治愈,现小结如下: 例1 欧××,男,20岁,因口服甲胺磷中毒10小时于1982年6月21日上午5时入院。入院时,神志不清,呈深昏迷状态、双侧瞳孔缩小约1—2mm,对光反射减弱,两肺可闻少许湿性罗音及痰鸣音。入院后用1/5000高锰酸钾溶液洗胃5—6次后并注入硫酸镁20g导泻。同时给予静脉推注阿托品,每次10mg(每支每ml含0.5mg),每半小时或一小时一次,到6月22日上午九时出现“阿托品化”反应,阿托品总量为200mg。患者颜面潮红,     

酪氨酸羟化酶重组质粒标准品构建

目的:用T-A克隆法构建含酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组质粒,并用实时定量PCR(RQPCR)方法制备标准品。方法:提取小鼠肾上腺髓质组织总RNA,逆转录为cDNA后进行RT-PCR,回收纯化电泳胶,T-A克隆与pGEM-T载体连接,转化Top-10感受态细菌,蓝白斑筛选出阳性菌落后,大量提取质粒,再进行RQPCR反应,最后制得含TH的重组质粒标准品。结果:肾上腺髓质TH的表达,PCR扩增,菌液PCR,测序鉴定均证实TH重组到pGEM-T载体上,经RQPCR定量后得到TH重组质粒标准品的标准曲线。结论:该方法能大量制备TH质粒标准品,并且可推广应用。     

用维生素B_(12)、叶酸、三磷酸腺苷、辅酶A作外周血淋巴细胞染色体培养的方法介绍

目前在培养人体外周血淋巴细胞染色体的方法系采用RPMI—1640加小牛血清作培养基。此法虽好,但1640为进口培养基,价钱昂贵,且不易买到,给实验工作带来一定困难。笔者试用生理盐水,内加维生素B_(12)、叶酸、辅酶A、三磷酸腺苷等培养人体外周血淋巴细胞染色体,共作了30例获得满意结果。现将方法介绍如下,供同道参考。一、培养液制备:在无菌操作下取pH7.4磷酸盐缓冲液10ml,加入药用叶酸O.5mg。溶解后,以0.9％注射用生理盐水加至100ml,混匀,再加入维生素B_(12)500μg、辅酶A500u、三磷酸腺苷(ATP)100mg、植物血凝素(PHA)100mg,以6％碳酸氢钠液词pH至7.4,然后每培养瓶内分装5ml作培养液。     

不同酶切体系对胶回收纯化DNA浓度的影响

目的 通过建立不同的酶切体系,找寻酶切效果好、胶回收试剂盒纯化DNA得率高的实验设计.方法 使用XhoⅠ单酶切重组质粒pcDNA3-P2X4,酶切体系的体积分别为:150μl、160μl、170μl、180μl;酶切体系组成为:dddH2O(补足体积)、Buffer R(应用浓度是酶切体积的10%)、质粒DNA(无论所得质粒浓度如何,琼脂糖凝胶电泳胶回收的DNA上样量统一为23μg),XhoⅠ10μl(6μl、4μl两次加入);反应温度为:37℃ ;酶切的时间为2～3h.结果 酶切体系越大,所需要的酶切时间越短、酶切效果越好、酶切条带越接近Marker标准条带(通过电泳拍照观察所得),但是胶回收纯化后DNA的浓度却越低:150μl体系 DNA的浓度=308.96±8.71μg/ml,160μl体系 DNA的浓度=286.62±8.37μg/ml,170μl 体系DNA的浓度=245.80±15 64μg/ml,180μl体系 DNA的浓度=198.00±16.54μg/ml(方差分析,P<0.05,n=5).结论 将酶切的体系放大,杂质将相对稀释,不需增加酶的用量就能取得较好的酶切效果;提取质粒的浓度和纯度也决定着酶切效果.     

血清肌酸不除蛋白直接显色测定法

血清肌酸测定通常采用间接测定法,由于需要二次测定,干扰因素较多、影响其准确性,我们应用肌酸直接测定,介绍如下。 一、试剂 1.肌酸标准贮存液(1ml=5mg):准确秤取肌酸(含1分子水,E.Merck)568.5mg,溶于蒸馏水,并移入100ml容量瓶中,再加至刻度,冰箱保存。 2.肌酸应用液(1ml=0.05mg):吸取贮存液1.0ml于100ml容量瓶中,然后加蒸馏水至刻度,冰箱保存。 3.1％吐温-80:取吐温-80 1.0ml、以蒸馏水溶解加水至100ml。 4.碱性溶液:秤取氢氧化钠30g,无水碳酸钠64g。以蒸馏水溶解至500ml。 5.1％α-萘酚:秤取α-萘酚0.1g,加浓碱液10ml。     

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His．Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同；它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。     

罗哌卡因复合舒芬太尼或曲马多骶管阻滞用于肛肠手术后镇痛效果的比较

目的:探讨罗哌卡因复合曲马多或者舒芬太尼骶管阻滞用于肛肠手术后患者的镇痛效果以及不良反应.方法:ASAⅠ～Ⅱ级患者90例,随机分3组,C(对照组)、S(舒芬太尼组)、T(曲马多组)每组30例,骶管穿刺成功后给试验量2%利多卡因3ml,然后C组给0.5%罗哌卡因20ml,T组给含曲马多100mg的0.5%罗哌卡因20ml,S组给含舒芬太尼10μg的罗哌卡因20ml,术后送回病房,患者抱怨疼痛并且VAS评分≥4mm时给杜冷丁1mg/kg肌肉注射,每次注射间隔时间＞6小时,观察术后1、3、6、12、24小时VAS评分,记录24小时内杜冷丁使用的总量,并记录3组患者24小时内发生瘙痒、恶心呕吐和尿潴留的例数.结果:在第3小时时间点S组的VAS评分低于C组,在第3、6、12、24小时T组的VAS评分低于C组,T组患者杜冷丁使用量低于C组,S组瘙痒例数明显高于其他两组.结论:0.5%罗哌卡因复合曲马多100mg骶管阻滞用于肛肠手术患者可以提供良好的术后镇痛,值得临床推广     

HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的纯化工艺

对HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的预处理和层析纯化工艺进行了研究。用碱裂解法对湿菌体进行预处理,当菌体湿重（g）∶悬浮液体积（mL）∶裂解液体积（mL）∶中和液体积（mL）为1∶2∶2∶2,碱裂解时间为8-12 min时,质粒的产量最高,可达32.94 mg/g。用Sepharose 6 FF凝胶过滤层析去除RNA和蛋白质,再用Plasmidselect亲和层析捕获超螺旋质粒DNA,质粒DNA的得率为48.3%。用L-Histidine-agarose亲和层析可从澄清的碱裂解液中一步分离纯化超螺旋质粒DNA,质粒DNA得率为51.62%。经琼脂糖核酸电泳检测,HCGβ抗肿瘤核酸疫苗超螺旋质粒DNA的纯度为100%电泳纯。     

血管基膜衍生多功能肽基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

目的:利用PCR技术从含有目的基因的质粒pGEX- 4T- 1 -VBMDMP获得带有SnabI和NotI酶切位点并融合有GST的目的基因片段并测序鉴定,将PCR产物纯化、酶切、回收,克隆到pPIC9K载体,转化入大肠杆菌DH5a扩增,用琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。方法:BglⅡ线性新构建的表达载体pPIC9K- GST- VBMDMP ,然后用原生质体转化法转化毕赤酵母细胞,并用pPIC9K空质粒也转入酵母细胞进行对照。用煮 冻 煮法裂解已转化有目的基因的毕赤酵母细胞提取DNA并行PCR鉴定,获得阳性重组子,行多克隆筛选和表型鉴定。筛选His+ Muts 表型的转化子,在MGY液体培养基中30℃摇床培养,每2 4h从培养基中转移1ml培养基上清于- 70℃保存,并保持培养瓶中培养基的量和培养基中甲醇0 .5 %的浓度不变,8d后行SDS -PAGE检测表达的蛋白,用GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST- VBMDMP融合蛋白;用凝血酶切割GST- VBMDMP并分离获得VB MDMP。结果:发现VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成;同时(VBMDMP 10mg/kg ,6mg/kg ,2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为96 .6 % ,82 .1% ,6 1.2 % )。VBMDMP(GST -VB- MDMP 10mg/kg ,6mg/kg ,2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发?     

应用HPLC法同时测定血中3种抗癫痫药物

本文报告应用HPLC(高效液相色谱)法同时测定血中苯妥英。卡马西平,苯巴比妥3种抗癫痫。采用5—乙基—5—甲苯巴比妥酸为内标物的内标法和三点检量线外标法进行测定。标本经乙醇沉淀蛋白,高速离心一次提取,将上清液用直径13mm,0.5um的微孔滤膜抽滤后直接进行色谱分离。色谱条件:岛津60×150mmCLC—ODS不锈钢柱,55/45比例的甲醇/水并加入20ul/100ml冰醋酸的混合液为流动相,用紫外检测器波长210nm检测结果。本法特异性强,灵敏度高,试剂廉价易得。     

葡萄球菌DNA的原生质体转化

用三株金黄色葡萄球菌多剂抗生素耐药菌株80022,82022和82062的质粒DNA和总DMA,分别对受体菌金黄色葡萄球菌RN1304(Y-1)的原生质体进行转化试验。平衡期初期的受体菌用溶菌酶和溶葡萄球菌素处理,所获得的原生质体与质粒DNA混合,以PEG诱导,涂布于含药的双层DM_3再生培养基上,即可获得Tc~r或Cm~r转化子。转化率为10~2—10~3转化子/μg DNA。