外源指导序列逆转淋球菌多重耐药性

目的 研究外源指导序列(external guide sequence,EGS) 在体外逆转淋球菌多重耐药株为敏感株中的作用.方法 构建针对多传递耐药(multiple transferable resistance,mtr)系统中MtrC基因,并含卡那霉素抗性基因的EGS重组质粒pET-28a( )-EGS-MtrC,采用常规CaCl2法将重组质粒导入临床分离的多重耐药淋球菌中,通过菌落PCR进行鉴定,并利用分光光度计检测阳性转化菌在含不同浓度氨苄西林的培养基中的生长情况,测定淋球菌转化前后对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的最小抑菌浓度(MIC).结果 PCR结果显示阳性转化菌含有预期大小的转化片段;多重耐药淋球菌在浓度为50、100 μg/ml的氨苄西林培养基中生长良好,而导入EGS-MtrC的转化菌在含100 μg/ml氨苄西林的培养基中不能生长,在50 μg/ml氨苄西林培养基中生长受抑制.导入EGS-MtrC的转化菌对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的MIC值均有明显下降.结论 pET-28a( )-EGS-MtrC转化淋球菌成功;导入EGS-MtrC的转化菌部分恢复了对氨苄西林的敏感性;转化菌对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的敏感性增加.     

葡萄球菌耐药质粒转化大肠杆菌的实验研究

目的 探讨葡萄球菌与大肠杆菌间耐药性传递的可能性.方法 抽提金黄色葡萄球菌耐氯霉素质粒,转化至对氯霉素敏感的大肠杆菌体内,以氯霉素抑菌试验筛选获得耐药性的大肠杆菌,以琼脂糖凝胶电泳分析2菌耐氯霉素质粒的DNA分子大小.结果 成功获得对氯霉素耐药的大肠杆菌,且可从其培养物提取出与耐氯霉素会黄色葡萄球菌相同大小的质粒DNA.结论 葡萄球菌可能具有天然穿梭耐药质粒,在人工条件下可成功转化大肠杆菌使之获得耐药性.     

多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因的初步定位研究

目的对临床分离的多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因进行初步定位，为制定临床治疗策略提供理论基础。方法用法国Bio—Merieux公司vitek-60全自动细菌鉴定仪鉴定菌种，双纸片法检测产超广谱8-内酰胺酶，纸片法做药敏试验。用Qiagen plasmid midi kit试剂盒提取该菌质粒，并将质粒电转入感受态大肠杆菌中，用含Amp（50μg／m1）的（LB）选择培养基筛选转化子，然后提取转化子质粒，与肺炎克雷伯菌质粒同时用0．5％的琼脂糖进行电泳分析。肺炎克雷伯菌，电转前、电转后大肠杆菌做药敏试验。结果质粒电泳图谱显示，转化子DH5a所含质粒与肺炎克雷伯菌所含质粒相同，电转化取得成功；肺炎克雷伯菌对17种抗生素均耐药，感受态大肠杆菌对17种抗生素均敏感，转化子DH5n对头孢呋辛和氨苄西林耐药，对其余15种抗生素表现不同程度的敏感。结论本株肺炎克雷伯菌的质粒上可以确定有耐头孢呋辛和氨苄西林的基因，并且能在转化子DH5a中成功表达：头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南的耐药基因可能位于质粒上，但未能完全表达；而环丙沙星、阿米卡星、庆大霉素的耐药基因比较复杂，初步判断不在质粒上；头孢西丁、美洛培南、亚胺培南则无法做出判断。     

大蒜芦荟液消除R质粒的实验研究

目的：探讨大蒜芦荟混合液对大肠杆菌耐氯霉素（CM）R质粒和痢疾杆菌耐氯霉素（CM）R质粒消除作用。方法：将大蒜芦荟混合液作为R质粒消除剂,消除痢疾杆菌耐CM质粒和大肠杆菌耐CM质粒。结果：经大蒜芦荟液作用的大肠杆菌和痢疾杆菌在含CM中国蓝培养基和含CMSS培养基均不生长,但在不含CM中国蓝培养基和不含CMSS培养基都能生长。结论：大蒜芦荟混合液对大肠杆菌和痢疾杆菌的R质粒在体外均具有消除作用,说明大蒜芦荟液有预防肠道菌耐药性作用。     

脆弱类杆菌亚胺培南抗性基因的分子克隆

为从分子水平对类杆菌抗性基因和抗性转移进行深入研究，进而寻找出能有效阻断耐药基因传播的措施，并从分子水平上认识医院内感染耐药基因传播与表达的影响因素，作者对临床分离的脆弱类杆菌亚胺培南抗性株的染色体ＤＮＡ进行了分子克隆，获得了１．７ｋｂ的亚胺培南抗性基因片段，而且其重组质粒能在大肠杆菌ＤＨ５中稳定传代和表达。以随机引物法，用地高辛配基标记亚胺培南抗性基因制备探针，对临床分离的４０株类杆菌进行亚胺培南抗性基因检测，结果显示２株亚胺培南抗性株出现杂交信号，３８株亚胺培南敏感株无杂交信号。提示亚胺培南抗性基因探针可用于类杆菌耐药性的分子流行病学调查。     

耐药性与敏感性大肠杆菌质粒DNA提取和转化试验的初步研究

本文采用冷酚、氯仿抽提沉淀——缓冲液悬浮提取质粒DNA。并用大肠杆菌73Sm~R对链霉素进行了耐药的培养训练。从耐药性大肠杆菌中提取质粒DNA向敏感菌株转化试验,成功的获得了链霉素耐药转化子。转化子均获得耐药性菌株DNA对链霉素的抗性。     

表皮葡萄球菌污染对质粒转化和抽提影响的实验研究

目的：探讨导致部分质粒转化和抽提失败的原因，方法：使用同一批DH5－α细菌制备感受态，转化、碱裂解法抽提和鉴定两种质粒，经抗性LB琼脂平板筛选和菌落分析，对照成功抽提和鉴定的质粒，分析部分质粒反复转化和抽提失败的原因，结果：发现在该抽提失败的质粒所转化的抗性LB琼脂平板上存在两种菌落，大量白色菌落为表皮葡萄球菌，其过夜振摇产物经碱裂解法抽提质粒失败，极少数淡黄色菌落为大肠杆菌，经鉴定，质粒抽提成功，结论：隐蔽的表皮葡萄球菌污染可能是导致部分质粒反复抽提失败的重要原因。     

耐多药结核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的　研究耐多药结核病 (MDR TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值及鉴定是否含有质粒。方法　采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析了 4 6株同时耐异烟肼 (INH)、利福平 (RFP)、链霉素 (SM)的多耐药临床分离株和 6 2株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。同时对 78株结核分支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果　以结核分支杆菌H37RV为对照 ,6 2株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常 ,其特异性为 10 0 %。KatG基因有 2株图谱异常 ,特异性为 96 8%。rPOB、KatG、rpsL基因突变率分别为 91 3%、6 0 9%、71 7%。结核分支杆菌 30株药物敏感株和 37株同时INH、RFP、SM的多耐药临床分离株均未提取分离与鉴定含有质粒。结论　结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。未发现结核分支杆菌含有质粒及由质粒介导的耐药机制。     

耐多药结核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的研究耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值及鉴定是否含有质粒。方法采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析了46株同时耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和42株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。同时对67株结核分支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，42株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％；KatG基因有2株图谱异常，特异性为95．8％。tPOB、KatG、rpsL基因突变率分别为91．3％，60．9％，71．7％。结核分支杆菌30株药物敏感株和37株同时INH、RFP、SM的多耐药临床分离株均未提取分离与鉴定含有质粒。结论结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。未发现结核分支杆菌含有质粒及由质粒介导的耐药机制。     

大肠杆菌头孢哌酮抗性基因亚克隆及序列初步分析

为了确定耐药质粒ｐ Ｆ Ｃ所编码β内酰胺酶衍化类型，用从临床分离出的大肠杆菌耐药质粒 ｐ Ｆ Ｃ头孢哌酮抗性基因，经分段亚克隆，构建重组质粒ｐ Ｆ Ｂ１、ｐ Ｆ Ｂ２、ｐ Ｆ Ｂ３ ，对上述 ３ 个重组质粒分别测序获得的抗性基因序列经 Ｉｎｔｅｒｎｅｔ互联网同源性检索，表明该抗性基因部分序列，与肺炎克雷伯氏菌编码超广谱β内酰胺酶 Ｔ Ｅ Ｍ５２ 的抗性基因序列存在高度同源性（９７％ ），提示ｐ Ｆ Ｃ头孢哌酮抗性基因所编码的 β内酰胺酶可能衍化自 Ｔ Ｅ Ｍ型。     

抗鼻咽癌质粒 pFY 转化和菌种筛选的研究

目的：筛选携带抗鼻咽癌质粒 pFY 的稳定高产菌株。方法以 CaCl2法制备大肠杆菌 JM109感受态,将抗鼻咽癌质粒 pFY 转化 JM109感受态,对琼脂平板上获得的菌落进行筛选,选出符合标准的单菌落为菌种,进行菌种稳定性实验。用质粒提取试剂盒检测质粒含量。将抗鼻咽癌质粒 pFY 转染到细胞 CNE-2中,四氮唑蓝(MTT)比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果筛选得到菌株的培养液中质粒 DNA 含量为30 mg/mL,超螺旋 DNA 比例为92%。经电泳和酶切鉴定,该菌株的50子代所携带质粒与原代一致。质粒 pFY 对 CNE-2细胞株生长有明显的抑制作用。结论成功筛选出携带抗鼻咽癌质粒 pFY 的稳定高产菌株,为大批量制备临床应用级质粒奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌CCC型及OC型质粒的检测

采用已报道的金黄色葡萄球菌质粒DNA的检测方法(简称LL法)。从1982年在南京地区临床分离的131株金黄色葡萄球菌中的125株(95.4%)中检出质粒,可分为21质粒谱。经单向及双向二步琼脂糖凝胶电泳法鉴别,按分子量共有16个CCC型质粒带(P_1～P_(16))。用改良的LL法制备E.coli V517菌株质粒DNA,建立了简便的测定金黄色葡萄球菌质粒DNA分子量的参考系统。结果表明:要本实验条件下,P_1～P_(16)的分子量为1.42 Md～22.24±0.73 Md;以含有14.88、2.66±0.06 Md质粒谱的菌株较常见,占总数的25.2%;2.66±0.06 Md的质粒最常见,在73.3%的菌株中检出。     

婴儿腹泻患者分离出大肠杆菌的药敏及R质粒检测

作者对从婴儿腹泻患者粪便分离的84株大肠杆菌,做了药敏性和接合性R质粒的检测。共检出对链霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素及氨苄、青霉素6种抗生素的耐药菌80株,占95.2％。对检出的80株耐药菌进行接合试验,R质粒的平均检出率为92.5％。讨论部分还将本文结果与正常人群大肠杆菌的药敏及R质粒检出结果,做了比较分析。     

Molecular detection and antimicrobial resistance of diarrheagenic Escherichia coli strains isolated from diarrheal cases

OBJECTIVE: To identify and classify Iranian isolates of diarrheagenic Escherichia coli (E. coli) on the basis of presence of virulence genes and to determine antibiotic susceptibility of isolated strains. METHODS: The current cross-sectional study was conducted in 2005 at the Pasteur Institute, Tehran, Iran. One hundred and ninety-three diarrheagenic E. coli isolated from diarrheal patients in different regions of Iran were included in current study. Virulence factor genes for diarrheagenic E. coli were detected by polymerase chain reaction. RESULTS: Of the 193 diarrheagenic E. coli detected by PCR, 86 (44.5%) were Shiga toxin-producing E. coli STEC, 74 (38.4%) enteropathogenic E. coli EPEC, 19 (9.8%) enteroaggregative E. coli, and 14 (7.3%) enterotoxigenic E. coli isolates. Susceptibility to 12 clinically important antimicrobial agents was determined for 193 strains of diarrheagenic E. coli. A high incidence of resistance to tetracycline (63%), ampicillin (62%), streptomycin (56%), amoxicillin/clavulanic acid (44.5%), trimethoprim/sulfamethoxazole (39.5%), and cephalothin (37%) was observed. CONCLUSION: The STEC and EPEC strains with high resistance to tetracycline and ampicillin, but highly susceptible to quinolones are among the most important causative agent of diarrhea in Iran. This study suggests that antimicrobial resistance is widespread among E. coli strains colonizing Iranian patients. Guidelines for appropriate use of antibiotics in developing countries require updating.     

内蒙地区老年人泌尿系感染耐药菌分布及耐药分析

目的：探讨内蒙地区60岁以上的老年人的泌尿系感染的细菌分布情况以及抗生素耐药情况,用于指导临床的合理用药。方法：回顾分析了内蒙古医科大学附属医院2010-01~2012-12底的60岁以上泌尿系感染的病人的标本409例,细菌鉴定及药敏试验采用VITEK2全自动细菌生化分析仪根据CLSI（2010）年标准,利用WHONET软件分析病原菌的分布及耐药情况。结果：分离出致病菌313株致病菌,其中大肠杆菌126例,占40.3%。铜绿假单胞菌89株,占28.4%。鲍曼不动杆菌分离出37株,占11.8%。金黄色葡萄球菌分离出26株,占8.3%对大肠杆菌进行了18种药物敏感的试验,其中亚胺培南100%的敏感,一、二、三四代头孢敏感性在55%以上,四代头孢敏感性76.3%,加酶抑制剂的抗生素哌拉西林/他唑巴坦敏感性91.7%。喹诺酮类抗生素对革兰氏阴性杆菌的耐药率超过60%。结论：60岁以上的老年人的泌尿系感染多为大肠杆菌,临床医师应该结合老年人的理状况合理选择抗生素,减少耐药株的出现。     

海南发现4株产NDM-1多重耐药的肺炎克雷伯菌

目的分离和鉴定海南地区临床上发现的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌携带新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）基因的细菌。方法使用法国梅里埃API20E生化鉴定条和VITEK2全自动细菌鉴定仪及其配套的GNS试剂,鉴定出临床上耐亚胺培南和美洛培南的肺炎克雷伯菌;并经改良Hodge试验和亚胺培南,亚胺培南＋EDTA纸片法协同试验检测产金属酶类碳青霉烯酶,对目的菌株进行NDM-1耐药基因PCR特异性扩增,扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定;同时将目的菌株进行质粒接合转移试验分析其耐药机制,并对接合前后的药敏结果进行比较分析。结果从13株耐亚胺培南或美洛培南的肺炎克雷伯菌中,经亚胺培南,亚胺培南＋EDTA纸片法协同试验检出4株阳性,确定为产金属酶类碳青霉烯酶细菌。该4株产金属酶的肺炎克雷伯菌的改良Hodge试验均为阴性,NDM-1基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和测序分析,确认此4株目标菌株均为携带NDM-1的耐药基因的耐药菌株;这4株接合子E．coli J53（NDM-1）对所有β-内酰胺类药物的MIC值较受体菌E．coli J53耐药性均有很大提高,经PCR扩增其接合子NDM-1基因片段分析证实4株接合子均接合成功。结论海南发现的4株耐碳青霉烯酶类的肺炎克雷伯菌为携带blaNDM-1基因,且其NDM-1耐药基因可通过质粒在不同菌株之间传递。     

致病念珠菌的临床药敏分析与基因分型探讨

目的调查阴道念珠菌感染致病菌种及对常用抗真菌药物的耐药谱;探讨念珠菌基因型检测方法的临床及流行病学价值,为临床念珠菌病的防治提供临床与实验依据.方法采用酵母菌鉴定板及ATB真菌药敏试剂条对临床589例再发性念珠菌阴道炎患者的分离株作菌种鉴定及药敏分析;ERIC-PCR指纹方法比较147株白色念珠菌咪康唑敏感株及60株咪康唑耐药株的基因型.结果白色念珠菌仍是优势致病菌株,占82.7%,非白色念珠菌中光滑念珠菌感染率高达12.7%;非白色念珠菌对酮康唑、咪康唑与益康唑的耐药率高(P＜0.01),白色念珠菌则对5-氟胞嘧啶较多耐药(P＜0.01);念珠菌对常用唑类药物益康唑、酮康唑、咪康唑存在较高的交叉耐药率;念珠菌对制霉菌素耐药率极低;白色念珠菌咪康唑敏感株及耐药株ERIC-PCR指纹一致.结论菌株的基因型可作为流行病学调查的稳定标记,但念珠菌阴道炎治疗的临床用药应以菌种鉴定及药敏分析为基础;唑类药物使用要慎防各唑类药物之间的交叉耐药;制霉菌素在无耐药检测条件下可作为部分顽固病例的经验用药.     

Prevalence and characterization of plasmid-mediated blaESBL with their genetic environment in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in patients with pneumonia

Background  The extended spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli (E. coli) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) are the major pathogens causing pneumonia and have a significant impact on the clinical course. Limited data exist on molecular characterization of ESBL-producing E. coli and K. pneumoniae that cause pneumonia. The aim of this study was to investigate the comprehensive multilevel characteristics of E. coli and K. pneumoniae causing pneumonia in China for the first time.

Methods  E. coli (17) and K. pneumoniae (21) isolates responsible for pneumonia were isolated from 1270 specimens collected in a prospective multi-center study in eight teaching hospitals in China from June to December in 2007. The susceptibilities, ESBL confirmation, sequence typing, bla_CTX-M and bla_SHV genes, their genetic environment and plasmid Inc/rep types were determined.

Results  Sixteen E. coli (94.1%) and eleven K. pneumoniae (52.4%) isolates were ESBL producers. About 77.8% and 66.7% of them were resistance to ciprofloxacin and levofloxacin, and 100% were susceptible to imipenem. The most prevalent ESBL gene was CTX-M-14, followed by SHV-2, CTX-M-15, CTX-M-3, CTX-M-65, SHV-12, SHV-26 and SHV-28. SHV-1 and SHV-11 were also detected and coexisted with bla_CTX-Ms in five strains, and three strains contained only SHV-1. All CTX-M-14 were detected ISEcp1 upstream and nine were found IS903 downstream and the majority of them (64.3%) were carried by IncF plasmids. All bla_SHV were flanked by recF and deoR, located on IncF, IncN, IncX and IncH plasmids. Two SHV-2, one SHV-1 and the only SHV-28 were further preceded by IS26. Genes lacY and lacZ were detected at further upstream of two bla_SHV-1. The K. pneumoniae carrying SHV-28 was susceptible to β-lactams, and no mutations or deletions in gene or promoter sequences were identified to account for susceptibility. Multilocus sequence typing experiments showed the ESBL-producing strains were genetically diverse.

Conclusions  The rate of occurrence of bla_ESBL in E. coli and K. pneumoniae causing pneumonia was high, and bla_CTX-M-14 was dominant and probably mobilized by ISEcp1 mainly on IncF plasmids. Importantly, unexpressed bla_ESBL genes may occur in susceptible isolates and hence may have clinical implications.

     

The production of Strains Highly Expressing Human Interleukin-2 cDNA

(张大军)(冯博)(皇甫永穆)ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＳｔｒａｉｎｓＨｉｇｈｌｙＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ｃＤＮＡ￥ＺＨＡＮＧＤａ－ｊｕｎ，ＦＥＮＧＢｏ，ＨＵＡＮＧＦＵＹｏｎｇ－ｍｕ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａ...