人鼠肝组织嵌合体模型的制备

目的研究制备人鼠肝组织嵌合小鼠模型。方法将人骨髓干细胞直接注射到一定日龄胎鼠肝组织,每只注射移植约1×109人骨髓干细胞。用免疫组化对出生一定日龄移植小鼠肝脏进行甲胎蛋白免疫组织化学检测,检定分析人肝细胞在小鼠体内嵌合生长情况。结果移植人骨髓干细胞胎鼠出生2月龄、12月龄可检测到甲胎蛋白。结论将人骨髓干细胞移植小鼠肝脏内能够存活并分化成人肝细胞并能够长期存活。     

HepaRG细胞移植治疗鼠特异性Fas抗体诱导的小鼠急性肝衰竭

目的 探讨HepaRG细胞移植对鼠特异性Fas抗体诱导的急性肝衰竭小鼠的治疗作用和人肝细胞异种移植的策略.方法 利用特异性鼠抗Fas抗体(Jo2 mAb)腹腔注射,剂量为0.3 mg/kg,诱导20只SCID小鼠制备急性肝衰竭模型,24 h内按照实验动物随机数字表分组方法 ,经脾移植2×106HepaRG细胞的小鼠为实验组(10只),未经HepaRG细胞移植的小鼠为对照组(10只).观察小鼠的存活率、肝脏功能、肝组织变化情况.实验组移植4周免疫组化检测肝组织人白蛋白、人CK18、人Hep Par1的表达,免疫荧光检测人白蛋白的表达.结果 实验组小鼠有9只存活超过4周,而对照组小鼠3 d内先后死亡9只,实验组血清ALT和AST趋于正常,显著低于对照组(P<0.01),且存活时间显著高于对照组(P<0.01).实验组经HepaRG细胞移植能避免Jo2 mAb所致肝组织出血、坏死,移植后4周免疫组化可见人白蛋白、CK18、Hep Par 1阳性表达细胞,肝组织免疫荧光可见人白蛋白阳性细胞的表达.结论 移植HepaRG细胞可治疗Jo2mAb腹腔注射小鼠诱导的急性肝衰竭,HepaRG细胞不仅在小鼠肝内存活,且得以增殖.     

大鼠胚胎内注射h UCMSCs在肝内存活和肝分化研究

目的观察大鼠胚胎期注射绿色荧光蛋白(GFP)标记的人脐带间充质干细胞(GFP-hUCMSCs)在SD大鼠肝中存活和肝分化,探索在胚胎发育期建立人-大鼠嵌合体肝的可行性。方法运用携带绿色荧光蛋白的慢病毒转染标记人脐带间充质干细胞,然后注射到实验组大鼠胚胎。胎鼠出生后,制作冰冻切片观察GFPh UCMSCs在肝组织的迁移和分布,同时免疫组织化学法检测人相关蛋白在鼠肝内的表达。对照组注射等体积生理盐水。结果实验组胎鼠出生45 d、75 d、120 d的肝组织内检测到GFP信号的分布,对应肝组织内可检测到人肝细胞相关蛋白ALB、HNF3β和HNF4α的表达,但120 d大鼠含量极少、部分甚至检测不到。对照组为阴性。结论胚胎期注射h UCMSCs的胎鼠出生75 d的肝内仍可检测到GFP信号的存在和人肝细胞相关蛋白ALB、HNF3β和HNF4α的表达,且随时间延长而呈现逐渐减少的趋势。     

大鼠肝细胞移植对受鼠肝脏增生的影响

实验选用Wistar成年大鼠及胎鼠为肝细胞移植供鼠,SD成年大鼠为肝细胞移植受鼠,观察成年鼠及胎鼠肝细胞移植对受鼠肝脏增生的影响,发现接受胎鼠肝细胞移植鼠的肝重量于移植后24小时,肝细胞分裂指数及肝组织~3H-TdR掺入量于移植后24、48小时均高于对照组及接受成年鼠肝细胞移植组鼠,而成年鼠肝细胞移植组与对照组无明显差异,表明胎鼠肝细胞移植     

大鼠和人胎肝细胞超微结构的体视法计量

取第16～20天Wistar大鼠胎肝和出生后2天的新生大鼠肝,以及第2个月至新生儿的人胎肝组织,切半薄片和超薄片,分别用光镜和电镜进行细胞和细胞内超微结构的体视法计量。各参数的数值均经统计学处理。胎肝细胞体积逐渐递增,核体积无显著变化,核质比逐渐变小。胎肝细胞线粒体分化早,其体积密度、个数密度和表面积密度较稳定(大鼠)或渐递增(人);单个肝细胞线粒体的总体积和个数均显递增。胎肝细胞的粗面内质网(RER)发达,其相对数值明显大于成体肝细胞,鼠胎单个肝细胞RER总体积也较成体的大。胎肝细胞的滑面内质网(SER)和微体发育差,出生后发育显著。胎肝细胞溶酶体发育好,其参数的数值随胎龄逐渐递增,出生后增加尤为显著。出生前胎肝细胞的糖原含量迅速增加,出生后又骤然减少。讨论了胎肝细胞发育中诸细胞器和糖原数量变化与肝细胞功能发展的关系。     

利用bcl-2抗Fas凋亡特性联合Fas抗体促进人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖

目的 移植bcl-2转基因HepaRG细胞到小鼠体内,并联合使用Jo2抗体诱导鼠肝细胞凋亡策略,促进人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖.方法 SCID鼠经脾移植2×106 bcl-2转基因HepaRG细胞,移植后1d始腹腔注射0.2mg/kg Jo2抗体,每周1次,持续10周为实验组;移植未转染bcl-2基因的HepaRG细胞,同样给予Jo2 抗体腹腔注射为对照1组,移植未转染bcl-2基因的HepaRG细胞,未腹腔注射Jo2抗体为对照2组,建立人鼠嵌合肝动物模型.从2周开始,后4、8、12、16、20、24周,分别采用免疫组化、免疫荧光和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时相点实验组和对照组嵌合肝中肝组织人清蛋白以及人清蛋白mRNA,并用酶联免疫法(ELISA)定量检测鼠血清人清蛋白的含量.结果 实验组和对照组小鼠均能存活至24周,鼠肝组织和血清中均能检测到清蛋白的表达.实验组肝组织和血清人清蛋白的表达均可持续到24周,人血清清蛋白高峰值为95.32ng/mL,出现在16周;而对照1组肝组织和血清人清蛋白的表达可持续到20周,人血清清蛋白高峰值为42.37ng/mL,出现在12周;对照2组肝组织和血清人清蛋白的表达可持续到12周,人血清清蛋白高峰值为22.91ng/mL,出现在8周.结论 利用bcl-2抗Fas凋亡特性,转染bcl-2基因的HepaRG细胞移植并联合小剂量Jo2抗体腹腔注射SCID鼠,有利于人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖和存活.     

宫内注射治肝细胞对大鼠移植免疫反应的影响

目的：研究宫内注射胎肝细胞对大鼠移植免疫反应状态的影响。方法：将LOU/CN大鼠的胎肝细胞注射于宫内CHN胎鼠的腹腔。以分娩7-9wk龄时的CHN雌性大鼠作为受体,LOU/CN雌性大鼠作为供体,进行皮片移植。观察大鼠皮片移植物的存活时间,并以混合淋巴细胞培养检查移植排斥反应。结果：与对照组相比较,宫内注射组大鼠皮片移植物的存活时间明显延长。混合淋巴细胞培养显示,移植排斥反应被明显抑制（P＞0.01)。结论：胎肝细胞宫内注射于胎鼠可延长大鼠皮片移植物的存活期,对移植排斥反应产生明显的抑制作用。     

宫内注射胎肝细胞对大鼠移植免疫反应的影响

［杨雁灵,李开宗,窦科峰,张新海,廖琪桦. 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(4)：335-337］ 目的研究宫内注射胎肝细胞对大鼠移植免疫反应状态的影响. 方法将LOU/CN大鼠的胎肝细胞注射于宫内CHN胎鼠的腹腔. 以分娩7～9 wk龄时的CHN雌性大鼠作为受体,LOU/CN雌性大鼠作为供体,进行皮片移植. 观察大鼠皮片移植物的存活时间,并以混合淋巴细胞培养检查移植排斥反应. 结果与对照组相比较,宫内注射组大鼠皮片移植物的存活时间明显延长. 混合淋巴细胞培养显示,移植排斥反应被明显抑制(P>0.01). 结论胎肝细胞宫内注射于胎鼠可延长大鼠皮片移植物的存活期,对移植排斥反应产生明显的抑制作用. （何扬举）     

Caspase12在ERS介导的肝细胞凋亡中的作用

目的：探讨Caspase12在肝纤维化内质网应激（ERS）介导的肝细胞凋亡中的作用.方法：雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照4周、8周组和肝纤维化模型4周、8周组,每组各10只.肝纤维化组按0.3ml/100g体重的剂量皮下注射40％ CCl4植物油溶液,每隔3天注射一次,造模时间分别为4周和8周;对照组大鼠皮下注射等量植物油溶液.采用TUNEL法检测肝组织中肝细胞凋亡情况;免疫组化检测肝组织中Caspase12蛋白的表达变化;Real-time PCR检测肝组织中Caspase12 mRNA的表达变化.结果：免疫组化及Real-time PCR检测显示肝纤维化4周组大鼠肝组织中Caspase12蛋白及mRNA的表达与正常4周组比较无显著差异;随着肝纤维化程度的加重,肝纤维化8周时大鼠肝组织中Caspase12蛋白及mRNA的表达显著增加;同时TUNEL法检测发现肝纤维化大鼠肝组织中肝细胞凋亡的数目较正常组显著增加.结论：Caspase12可能参与了肝纤维化时ERS介导的肝细胞凋亡过程.     

同种异体胎肝组织微片移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的探讨同种异体胎肝组织微片移植对大鼠急性肝功能衰竭的治疗作用,为胎肝微组织移植的临床试验提供动物实验依据.方法选择急性肝功能衰竭SD大鼠40只,随机分为对照组(n=20)、移植组(n=20).孕14 d的SD胎鼠肝组织作为供体;移植组每只受体接受两个胎鼠肝脏组织微片移植,移植部位在受体肝组织中;对照组只行开腹手术;手术后24 h、72 h、7 d及30 d分别检测受体ALT、AST、TBIL及ALB的变化,统计存活大鼠数量.结果与对照组比较,手术后24 h、72 h、7 d移植组ALT、AST及TBIL明显下降,ALB显著升高,死亡率下降.术后30 d两组间上述指标差异无统计学意义.结论同种异体胎肝组织微片移植可以改善急性肝功能衰竭大鼠的肝功能,降低大鼠死亡率.这种作用随术后时间的延长而下降.     

永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

目的:构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法:利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞,使其永生化,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果:经G418 700～300 mg/L筛选,40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现,该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%,染色体核型分析表明细胞核型无明显异常,软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长,免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞,而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论:新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能,可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.     

微囊化鼠肝细胞腹腔移植的实验研究

目的：建立急性肝功能衰竭大鼠腹腔内微囊化肝细胞移植的动物模型，观察微囊及肝细胞形态和超微结构改变，并探讨移植物转归。方法：实验组60只Wister大鼠（受体）建立急性肝功能衰竭模型，分离纯化SD（供体）大鼠肝细胞，进行微囊化包裹，以每只鼠2．5×10^7个微囊化肝细胞进行腹腔移植，在移植后1周、2周分别处死30只受体大鼠．回收微囊．进行细胞形态及超微结构的观察。对照组15只Wister鼠只接受同等量空微囊．对比观察两组生存率、肝功能。结果：实验组大鼠存活率和肝功能指标改善情况明显好于对照组，移植后1周，微囊膜较完整。微囊间可见小血管增生，其内细胞活性好（81％±3％），腹腔中未见到炎症和免疫反应的迹象．且电镜观察细胞内结构正常、胞浆内细胞器丰富、核内容物存在。移植2周后微囊膜开始纤维化，部分肝细胞有变性。结论：微囊化肝细胞移植，可以治疗急性肝功能衰竭。微囊及肝细胞随着移植时间出现退行性改变。微囊的纤维化可能是导致移植后肝细胞存活下降的主要原因。     

微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

原代培养人肝细胞体外乙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒表面抗原黏附模型初探

目的研究建立人肝细胞体外乙型肝炎病毒（HBV）感染模型和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）黏附模型，为后期研究小分子抗体Fab的作用打下基础。方法体外原代培养人肝细胞，对人原代肝细胞进行HBsAg黏附实验及HBV感染实验。采用正常人胎肝细胞系（L-02）及鼠原代肝细胞进行实验对照。倒置相差显微镜下观察细胞形态，生化法检测其白蛋白分泌功能。免疫组化法检测HBsAg黏附情况和HBV感染肝细胞内HBsAg的表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝细胞感染HBV后HBsAg的持续表达。PCR检测肝细胞内HBV复制中间体-闭合环状双链DNA（cccDNA）。结果人原代肝细胞体外培养达2周以上。HBsAg黏附实验检测到HBsAg可黏附于人原代肝细胞、L-02、鼠原代肝细胞胞膜。HBV体外仅感染人原代肝细胞，从第2天起即可检测到细胞培养上清中存在HBsAg，并持续到观察结束第16天，免疫组化检测人原代肝细胞内HBsAg呈阳性；PCR检测到人原代肝细胞内存在HBV—cccDNA，而L—02及鼠原代肝细胞实验检测结果均为阴性。结论人原代肝细胞体外分离培养成功，HBsAg黏附和HBV感染模型初步建立于人原代肝细胞。     

人胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究

目的 将人胎肝于细胞脾内移植2/3肝切除的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,观察其在受体小鼠内定植、迁移及分化的可行性.方法 ①以临床上自然流产废弃的孕期16～24周健康胎肝为供体,分离纯化胎肝干细胞,并行光镜、电镜观察及免疫细胞化学和流式细胞检测鉴定.②人胎肝干细胞经脾内移植到2/3肝切除的SCID小鼠.③免疫组化检测15、30、60、90 d受体小鼠脾脏和肝脏的人Hepatocyte、α1-AT、AFP的定位和表达.PAS染色检测受体小鼠各时间点脾脏组织糖原表达.④RT-PCR检测30、60、90 d受体小鼠脾脏组织AFP和白蛋白(Alb)基因的表达.结果 ①镜下观察分离细胞体积较小、约为肝细胞的1/6～1/3,核与浆比例大,内质网、线粒体和核糖体不发达.免疫细胞化学和流式细胞检测分别显示分离的人胎肝干细胞表达AFP、Thy-1、C-kit和CD34、CK19.②各时间点免疫组化均可检测到肝干细胞移植小鼠的肝脏和脾脏组织人Hepatocyte、α1-AT和AFP阳性表达.PAS染色显示各时间点受体小鼠脾脏组织不同程度的糖原表达.③人胎肝干细胞移植后30、60、90 d受体小鼠脾脏组织表达人AFP和Alb基因.结论 人胎肝干细胞经脾内移植可在异体内存活、定植并向受体受损肝脏迁移,在受体内增殖和定向分化为肝细胞.     

经大鼠脾动脉行肝细胞移植建立动物模型

 目的 建立经SD大鼠颈动脉途径脾动脉插管行肝细胞移植的动物模型,并探讨其临床意义。方法 采用D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-gal)诱导大鼠急性肝损伤(acute liver injury,ALI),24 h后40只SD大鼠分为两组:A组(n=20)经左侧颈动脉插管,进入腹腔干,通过脾动脉移植1×107个肝细胞;B组(n=20)通过同样的方法经脾动脉注射0.5 mL Hank′s液作为对照,观察不同时间点（1、3、6、10、15天）大鼠肝功能的变化情况以及脾内白蛋白合成作用,HE染色观察脾内肝细胞分布情况。结果 经颈动脉途径脾动脉插管成功率约90%,荧光示踪剂CFDA SE标记的肝细胞脾内移植1天后,受体大鼠脾脏可以看到散在绿色荧光分布。A组移植10天后,HE染色可以看到肝细胞在脾脏散在分布;A组移植15天后,共聚焦白蛋白免疫荧光结果表明,脾内有白蛋白绿色荧光信号。结论 经大鼠颈动脉途径脾动脉插管移植的肝细胞能在脾内存活,证实该途径是肝细胞有效移植途径之一。     

移植人造血干细胞的山羊肝组织中人特异蛋白的表达

目的：观察在移植人造血干细胞的山羊肝脏组织中是否有人特异蛋白的表达。方法：从脐带血中获取人造血干／祖细胞,移植入胎山羊体内,产生嵌合体山羊;取4头出生后10个月的嵌合体山羊的肝脏,应用免疫组化技术检测其是否有人增殖细胞核抗原（PCNA）和肝细胞特异性抗原（HSA）的表达,并用FACS检测山羊肝细胞标本中是否存在有人HSA阳性细胞;应用RT－PCR技术分析嵌合体山羊的肝组织是否有人特异的肝细胞核因子（hHNF-3β）和人血清白蛋白（hALB)mRNA表达;应用荧光原位杂交（FISH）技术鉴定嵌合体山羊肝组织的间期细胞核是否存在特异于人17号染色体基因的杂交信号。结果：在受体山羊血循环中发现有人血细胞嵌合,证明移植成功。受体山羊肝脏切片中发现有人PCNA和HSA表达,但对照组未见;FACS分析结果显示在嵌合体山羊的肝脏组织中有表达人HSA的阳性细胞;RT－PCR结果表明嵌合体山羊肝细胞表达hHNF-3β和hALB mRNA;FISH结果显示嵌合体山羊组织的个别间期细胞核具有两个人特异的杂交信号。结论：人造血干细胞移植于胎山羊后可以产生嵌合型肝脏,其在受体羊肝组织中生长和扩增,分化成人的肝细胞,并具备了人肝组织特异性的转录活性。     

Retrorsine对小鼠肝损伤后肝细胞增殖的影响

目的:比较倒千里光碱(retrorsine)对小鼠与大鼠肝损伤后肝细胞增殖的影响,探讨应用retrorsine建立小鼠肝细胞移植模型的可行性.方法:雄性小鼠和大鼠均各自分为retrorsine处理组和生理盐水注射组(未处理组),每组30只.Retrorsine处理组动物分别接受2次(间隔2周)retrorsine注射(小鼠剂量为70 mg/kg,大鼠剂量为30 mg/kg);未处理组用生理盐水代替retrorsine.末次注射4周后,所有的动物均予CCl4注射(0.5 mg/kg),分别在CCl4注射前即刻(记为0时)、注射后第1、2、3、4、6和15天取动物肝组织样本.H-E染色检查动物肝组织病理学变化,Ki-67染色检测动物肝细胞增殖情况.结果:H-E染色发现retrorsine处理组大鼠肝组织出现明显的巨细胞增多、小胆管增生和小肝细胞增生并形成结节,而未处理组大鼠未出现这些表现,两组间有显著差异;然而,retrorsine处理组及未处理组小鼠肝组织均表现为肝细胞变性、肝小叶中央静脉周围区坏死,未出现巨细胞增生,两组表现类似.Retrorsine处理组大鼠Ki-67染色阳性肝细胞主要出现在小肝细胞结节中,CCl4注射后第3天Ki-67染色阳性肝细胞数明显少于未处理组(P<0.05);而retrorsine处理组小鼠Ki-67阳性细胞计数几乎在各时间点均高于未处理组,尤其在CCl4注射后第4天(P<0.001),两组变化趋势一致.结论:应用retrorsine可明显抑制大鼠肝损伤后肝细胞增殖,适用于建立大鼠肝细胞移植模型;retrorsine对小鼠肝损伤后肝细胞增殖无明显抑制作用,不适用于建立小鼠肝细胞移植模型.     

人胚胎肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的效果分析

目的 探讨人胚胎肝细胞移植治疗急性肝衰竭(ALF)的疗效及能否成为移植细胞源.方法 采用四甲基偶氮唑盐法检测人胚胎肝细胞增殖情况;免疫细胞化学检测其ALB、细胞角蛋白-18(CK-18)的表达; D-氨基半乳糖(D-gal)药物诱导ALF的实验动物模型;人胚胎肝细胞移植治疗ALF的动物模型,包括移植组与对照组在肝功能指标[ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)]的差异性比较.免疫组织化学法检测植入脾脏中的人胚胎肝细胞ALB及CK-18的表达.结果 培养第5天左右细胞数量达到最高峰,每天完成4～5次分裂,胚胎肝细胞的生长曲线呈抛物线型.免疫细胞化学检测提示其具有表达ALB、CK-18的功能; D-gal 1.6 g/kg腹腔注射72 h后大鼠ALF模型制备成功;移植第3～5天后,移植组与对照组比较,肝功能(ALT、AST、ALP、TBIL)指标差异有统计学意义(P<0.01).植入脾内的肝细胞具有分泌并表达CK-18、ALB的功能.结论 人胚胎肝细胞脾内移植能有效治疗ALF,并可能成为肝细胞移植的靶细胞源.