小鼠α2(Ⅰ)型原胶原基因启动子活性研究

明确纤维化形成中调控Ｉ型胶原基因高水平转录的启动子片段，逐段研究小鼠α２（Ⅰ）原胶原基因２ｋｂ的启动子序列。方法从小鼠α２（Ⅰ）原胶原基因转录起始点上游－２ｋｂ－＋５４ｂｐ的片段中，取长度不等的片段作为启动子，与含氯霉素乙酰基转移酶报告基因的质粒组织６个重组体，脂质体转录法转当上连重组体至胶原产生细胞和非胶霉素乙酰基转移酶报告基因的质粒组织６个重组体，脂质体转染法转染上述重组体至胶原产生细胞和非胶     

改良EMSA法分析人α1(Ⅰ)胶原基因序列特异性DNA结合蛋白

目的：分析人α１（Ⅰ）胶原基因５‘侧翼区具有较高启动调控活性序列的ＤＮＡ结合蛋白。方法：以原代培养人瘢痕皮肤成纤维细胞为胶原产生细胞,采用限制性内切酶消化,ＤＮＡ混合片段末端标记和增强化学发光的改良电泳迁移率改变实验（ＥＭＳＡ）分析人α１（Ⅰ）胶原基因－２６８￣＋４２ｂｐ序列的ＤＮＡ结合蛋白,其结合活性具有特异性,并能被ｓｐ－１,ＮＦ－１,ＮＦ－ｋＢ识别序列中存在α１（Ⅰ）胶原基因－２６８￣＋４２     

小鼠α2(Ⅰ)胶原基因DNA结合蛋白研究

目的：初步分析小鼠α２（Ⅰ）胶原基因上游５‘－ＵＴＲ近端８００ｂｐ（－７８０￣５４ｂｐ）序列的ＤＮＡ结合蛋白。方法：ＰＣＲ扩增小鼠α２（Ⅰ）胶原基因－２５８￣＋５４ｂｐ,－５１９￣－２４８ｂｐ,－７４１￣－５０１ｂｐ片段,Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ末端标记ＰＣＲ产物,与经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ并转印至膜上的胶原产生细胞的核抽提物进行ＤＮＡ－蛋白质结合反应,以抗Ｄｉｇ抗体检测结合反应信号。结果：Ⅰ型胶原基因上游５’     

大肠癌组织CEA基因启动子序列克隆及与正常组织相应序列的比较

目的：研究人类不同组织细胞中癌胚抗原（ＣＥＡ）产生与其基因顺式作用序列改变的关系，评价该顺式作用序列在大肠癌组织特异性基因治疗中的应用价值。方法：采用套式ＰＣＲ方法分别从人新鲜大肠癌、相应癌旁粘膜组织、正常血细胞、正常胎盘组织及建畜产品 中扩增ＣＥＡ基因启动子核心序列，ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法确定扩增序列的启动子功能。结果：不同组织细胞基因组中的ＣＥＡ基因转录起点上游－１３０ｂｐ－＋６９ｂｐ     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３－磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳＰＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα     

人甲状腺特异性转录因子-1基因的分子克隆及鉴定

目的 克隆人甲状腺特异性转录因子－１基因片段,为进一步从事分子甲状腺学研究打下基础。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ法从人甲状腺组织ＲＮＡＫ 扩增出甲状腺牧场生围 因子－１基因片段（４４０－８０３ｂｐ）;应用ＴＡ克隆对ＣＰ拉物进行分子克隆;ＥｃｏＰⅠ双酶解法鉴定重组体。结果 获得ＴＴＦ－１ｃＤＮＡ的一重组体（ｐＣＲ＾ＴＭⅡ／ＴＴＦ－１）,经ＥｃｏＲＩ双酶解表明克隆成功。结论ＴＴＦ－１基因的分子克隆可进 一步研     

TNF—α拮抗胰岛素样生长因子—1对人α1（Ⅰ）胶原启动子？…

目的：探讨ＴＮＦ－α对胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ－１）激活人α１（Ⅰ）胶原启动子的作用。方法：构建含不同长短α１（Ⅰ）胶原启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因的重组体ｐＣＯＬＨ１ ０．２７,ｐＣＯＬＨ１ ２．５用脂质体法瞬时转染至ＮＩＨ３Ｔ３细胞的人皮肤成纤维细胞中,加入ＩＧＦ－１或（和）ＴＮＦ－α,测定ＣＡＴ活性。结果;１００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１可使转染至ＮＩＨ３Ｔ３细胞的ｐＣＯ     

人Aγ-珠蛋白基因-173 T→C突变对启动子功能的影响

目的　研究人Ａγ珠蛋白基因－ １７３ Ｔ→Ｃ突变对反式作用因子与启动子的结合及对启动子活性的影响。方法　采用电泳迁移改变分析和荧光素酶报告基因瞬时转染分析。结果　Ａγ珠蛋白基因－ １７３ Ｔ→Ｃ突变使ＧＡＴＡ１ 与突变启动子片段（－ ２０１～－ １５８）的结合降低了９６％ （Ｐ＜ ００１）,并且使Ｏｃｔ１ 与相同的ＤＮＡ 片段的结合降低５５％ （Ｐ＜ ００５）。在ＭＥＬＧＭ９７９ 细胞中,突变启动子活性是正常启动子的２ 倍（Ｐ＜ ００５）;在Ｋ５６２ 和Ｈｅｌａ 细胞中,突变和正常启动子活性基本相同。结论　Ａγ启动子－ １７３ Ｔ→Ｃ突变导致ＧＡＴＡ１ 与突变启动子片段结合显著减少,提示在成年期该转录因子可能是Ａγ珠蛋白基因的负调控因子;－ １７３ Ｔ→Ｃ突变可能仅在成年期红系细胞环境中才能增强Ａγ珠蛋白基因启动子活性     

人甲胎蛋白基因转录调控元件的改造

目的 为构建高效利用甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因转录调控元件（ＴＲＥｓ）,驱动治疗基因在肝癌细胞中特异性表达的基因治疗载体,对天然人ＡＦＰＴＲＥｓ进行改建和鉴定。方法 采用亚克隆技术,删除了天然人ＡＦＰＴＲＥｓ中含有沉默子活性的－０．８７－－３．０６ｋｂ区域,将具有增强子活性的－３．０６－－５．１ｋｂ片段和调控ＡＦＰ基因表达的启动子“核心”区域＋２９－８７０ｂｐ片段连接,获得经人工改造后的基因转录调控元     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ, Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应,构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）, 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中,构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中, 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。     

bax和p53基因转染对人舌癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨诱导凋亡的bax基因和p53抑癌基因共转染对人癌细胞增殖和凋亡的作用。方法 构建pSV-CIP-bax-CAT嵌合基因。在其bax基因上游含人al(Ⅰ）型胶原基因的第一内含子２１７bp片段（＋８２２－＋１０９３）和３１７bp启动子片段,经阳离子转染试剂ＤＯＳＰＥＲ介导,分别用pSV-CIP-bax-CAT转染、pSV-CIP-bax-CAT和pSV-p53－ＣＡＴ共转染培养的人舌癌Ｔca8113细胞系（ＬＣＣ）。结果 免疫狭缝印迹和ＥＬＩＳＡ检测证实,转染组和共转染组和共转染组比对照的bax和p53基因表达量明显增加,ＭＴＴ显色分析、ＴＵＮＥＬ荧光显微镜和流式细胞仪监测结果显示,bax基因或p53基因均具抑制ＬＣＣ增殖和诱导凋亡的作用（bax组和bax p53组的抑制率分别为２３.9%和２６.1%)。结论 人al(Ⅰ）型胶原基因的顺式作用元件能促使bax基因在ＬＣＣ异位表达;bax与p５３共转染４８小时,对ＬＣＣ抑制增殖和诱导凋亡的作用具明显协同效应。     

人δ珠蛋白基因启动子区－64位C－T点突变对其启动子功能的影响

以ｐＵＣ１９－δｇｌｏｂｉｎ为模板，用ＰＣＲ定点突变技术将δ珠蛋白基因启动子区－６４位的Ｃ突变为Ｔ，即将ＣＣＡＡＣ盒改变为ＣＣＡＡＴ，并获得野生及突变的δ珠蛋白基因启动子区约３００ｂｐ的两个片段。将此两片段分别克隆到以虫荧光素酶为报告基因的表达载体ＰＭＧ３中，转染人ＨｅＬａ细胞，以瞬时表达分析突变的ＣＣＡＡＣ盒的启动子功能。结果表明突变组发动荧光素酶表达而产生的发光强度为野生型的５倍，说明将δ珠蛋白基因启动子区－６４位的ＣＣＡＡＣ盒改变为ＣＣＡＡＴ能够增强该启动子的功能，从而证实了δ基因启动子区ＣＣＡＡＣ盒的结构特点是该基因表达水平低的主要原因之一。     

氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ上游顺序功能和特性和CAT检测

首次构建了一系列含有不同长度氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ（ＣＰＳ１）上游ＤＮＡ顺序的ＰＫＣＰＳｘ－ＣＡＴ表达质粒，并通过ＣＡＴ检测观察了ＣＰＳⅠ调控顺序的功能及特性。结果表明，ＣＰＳⅠ上海顺序具有高度组织特异性基因表达调控作用；－１４２－－３８ｂｐ上游顺序与特异调腔有密切关系，是维持ＣＰＳⅠ转录必不可少的顺序；－１７００－１６１ｂｐ顺序中含有增强ＣＰＳⅠ启动子转录作用的顺序。地塞米松和促分化剂硫杂脯氨酸对肝     

人类端粒酶活性重组及其重组特异性

目的 对Ｈｅｌａ细胞端粒酶进行活性重组并探讨其重组特异性。方法 以ＲＴ－ＰＣＲ法从纯化的人端粒酶复合体中扩增人类端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）基因片段，将其克隆至含有ＳＰ６启动子的ｐＧＥＭ３ｆ＾＋质粒中，构建ｈＴＲ的体外转录体系以获得体外合成的ｈＴＲ。与端粒酶蛋白组分进行活性重组。四膜虫端粒酶ＲＮＡ及１６ｒＲＮＡ作为重组反应对照组，以探测其重组特异性。结果 经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出４５０ｂｐ片段；体外转录重组     

国人载脂蛋白B基因Xba Ⅰ 多态性与动脉粥样硬化性脑梗死患者血脂水平研究

为研究载脂蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）基因限制性片段长度多态性与动脉粥样硬化性脑梗死（ＡＣＩ）的关系，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了国人８５例ＡＣＩ和５６例正常人（ＮＣ）的ａｐｏＢ基因的ＸｂａⅠ位点多态性。结果显示：中国人ＸｂａⅠ位点等位基因频率与国外种族有差异。本研究Ｘ＋等位基因频率高于日本人、新加坡人，低于印度人、南亚人及欧洲人。ＮＣ组Ｘ－Ｘ＋基因型血浆总胆固醇（ＴＣ）水平明显高于Ｘ－Ｘ－基因型（Ｐ＜０．００１）。Ｘ－Ｘ－基因型个体：ＡＣＩ组血浆ＴＣ、甘油三酯（ＴＧ）、ａｐｏＢ、Ｌｐ（ａ）水平明显高于ＮＣ组，ａｐｏＡ水平明显低于ＮＣ组。提示：Ｘ－Ｘ－基因型可能与ＡＣＩ患者血脂异常有关。     

人δ珠蛋白基因启动子区—64位C—T点突变对其启动子功能的影响

以ｐＵＣ１９－δｇｌｏｂｉｎ为模板，用ＰＣＲ定点突变技术将δ珠蛋白基因启动子区－６４位的Ｃ空的Ｔ，即将ＣＣＡＡＣ盒改变为ＣＣＡＡＴ，并获得野生及突变的δ珠蛋白基因启动子区约３００ｂｐ的两个片段，将此两片段分别克隆到以虫荧光素酶为报告基因的表达载体ｐＭＧ３中，转染人Ｈｅｌａ细胞，以瞬时表达分析突变的ＣＣＡＡＣ盒的启动子功能。结果表明突变组发支荧光素酶表达而产生的发光经度为野生型的５倍，说明将δ珠蛋白     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α─ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３─磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳｐＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα基因启动子和信号序列及ＵＡＳＰＧＫ片段，构建成含ＭＦα基因启动子和信号序列的表达分泌型载体ＹＥｐ５１０１及含ＭＦα启动子和信号序列与ＵＡＳＰＧＫ的强化表达分泌型载体ＹＥｐ５１０２。这两种载体可用于外源基因表达的比较研究，探讨ＵＡＳ对外源基因表达的调控作用。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。