利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究

目的：制备抗重组人血管内皮生长因子（VEGF）165单克隆抗体。方法：构建人VEGF165原核表达载体pET-3a/VEGF165,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物。用初步纯化的rhVEGF165免疫小鼠制成杂交瘤细胞,小鼠腹腔接肿,收集腹水纯化后制成抗rhVEGF165单克隆抗体。结果：VEGF165诱导的内皮细胞增殖可被本研究制备的单克隆抗体中和,并表现出较好的剂量依赖关系。结论：本研究利用DNA重组技术制备人VEGF165,并利用它进一步制备了抗重组人VEGF165单克隆抗体。     

重组人类神经元14-3-3zeta信号蛋白的纯化及抗体制备

目的制备抗人脑14-3-3 zeta蛋白(31 ku)的多克隆抗体与单克隆抗体,为神经系统退行性疾病的诊断提供标志物.方法用纯化的rh14-3-3zeta蛋白免疫家兔,制备抗14-3-3多克隆抗血清;电洗脱、透析纯化rh 14-3-3/β-半乳糖苷酶融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rh 14-3-3 zeta单克隆抗体;测定所得抗体效价及其特异性反应.结果得到大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64;获得 1株能稳定分泌抗rh 14-3-3 zeta单抗的杂交瘤细胞株,其亚型为IgG1型,该株单抗可与重组14-3-3蛋白发生特异性反应.结论获得了敏感、特异的抗rh 14-3-3 zeta多克隆抗血清及稳定分泌抗rh 14-3-3 zeta单抗的杂交瘤细胞株,为神经系统退行性疾病提供诊断标记.     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

Mer免疫球蛋白样区原核蛋白表达和单克隆抗体制备

目的利用原核蛋白表达载体,体外表达Mer的IgG样区,并利用此重组蛋白制备抗Mer的单克隆抗体。方法从K562细胞中抽提总RNA,利用RT-PCR扩增Mer的IgG样区片断。经过测序将所得片断与PQE30原核表达载体连接并转化到大肠杆菌M15中,挑选阳性克隆,经诱导和纯化后获得原核蛋白。利用所得的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对Mer的IgG样区的特异性抗体。利用ELISA方法筛选阳性克隆,Westernblot方法进行验证。结果体外成功表达MerIgG样区的原核蛋白,片断大小经修饰后约为26kd,表达量占菌体总蛋白的15%,经Ni-NTAagrose柱纯化后得到纯化蛋白并免疫Balb/c小鼠。将小鼠脾脏细胞和杂交瘤细胞融合后得到1株特异性抗MerIgG样区的单克隆抗体——SZ-128,Westernblot显示此单抗可以和表达的重组蛋白和Mer胞外区真核蛋白反应。结论成功制备1株抗MerIgG样区的特异性单克隆抗体,为研究Mer的功能提供了有力的工具。     

抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定

目的制备抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为研发3型副流感病毒新型诊断试剂提供基础。方法利用重组克隆表达技术,获得可溶性的重组核衣壳蛋白;采用纯化的重组核衣壳蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人3型副流感病毒核衣壳单克隆抗体;采用ELISA及间接免疫荧光法筛选并鉴定可识别天然3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。结果获得9株分泌抗重组核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的细胞株,其中2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别天然的3型副流感病毒核衣壳蛋白。结论利用重组核衣壳蛋白作为免疫原制备出了识别天然核衣壳蛋白的单克隆抗体,并且具有较高的反应性。     

人高尔基体蛋白GP73基因的克隆?表达?单克隆抗体的制备及鉴定

目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物?通过克隆?表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性?方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白?以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体?以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平?结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73 单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高?结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础?     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。　结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。　结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。     

抗人FXYD6特异性多肽单克隆功能性抗体制备及生物学作用鉴定

目的 研制抗人转运调节因子(FXYD)6功能区单克隆抗体库,筛选分泌胞内、胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株并对鉴定胞外区单克隆抗体生物学作用.方法 原核表达并纯化去除跨膜区域FXYD6功能区重组蛋白,FXYD6重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,多次筛选及克隆化,建立稳定分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区的单克隆抗体杂交瘤.分别应用间接酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot和免疫组织化学法鉴定抗体特异性及亚型,细胞流式技术筛选可识别天然构象的胞外区单克隆抗体,用腹水诱导法对胞外区单抗进行制备、纯化并检测亲和常数,高表达FXYD6的HepG2细胞系检测胞外区单抗的功能.结果 成功获得分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区单克隆抗体的杂交瘤细胞库,制备出具有功能阻断性的胞外区单抗.结论 制备的抗人FXYD6胞外区单抗可抑制HepG2细胞的增殖.     

重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

目的 利用原核表达系统(E.coli)表达纯化重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m),并制备rh-BMP-2m的单克隆抗体.方法 将工程菌株进行常规发酵,自诱导表达,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化.纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,获得具有生物学活性的rhBMP-2m.并以此作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体.结果 获得还原SDS-PAGE下95％以上纯度的rhBMP-2m.细胞活性结果分析显示,所获得的rhBMP-2m具有较强的生物学活性.免疫小鼠最终获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株.结论 成功制备了具有生物学活性的rhBMP-2m及其单克隆抗体,为rhBMP-2未来的研究和制备奠定良好的基础.     

人血管内皮生长因子165的克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法利用ＰＣＲ的方法从胎脑ｃＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果经测序表明，克隆的ＶＥＧＦ１６５与文献报道相符，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后，ＶＥＧＦ１６５在大肠杆菌中表达出。结论克隆和表达出ＶＥＧＦ１６５，为以后进一步研究ＶＥＧＦ１６５的功能奠定了基础     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

血管内皮生长因子在大肠杆菌中表达?提纯及功能测定

目的:利用细菌表达系统合成大量重组血管内皮生长因子(VEGF)蛋白.方法:将VEGF165 cDNA克隆于表达载体PET-32a( )后转染BL-21株表达重组VEGF蛋白,用分离His蛋白的层析柱提纯重组VEGF蛋白.结果:重组VEGF蛋白经氨基酸序列测定证实.Western blot测定发现His蛋白.功能测定发现重组VEGF蛋白可阻断细胞表面Neuropilin-1的表达.结论:上述表达系统制备大量具有生物活性的重组VEGF蛋白     

重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、纯化及鉴定

目的构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子重组表达载体，进行蛋白质原核表达，并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法首先通过限制性核酸内切酶酶切及连接反应，构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确性后，再转染感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白质表达。表达产物经Ni—NTA亲合层析及肠激酶特异性酶切进行分离纯化，最后用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定等显示目的基因片段和阅读框架正确无误，表明非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF、构建成功。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达，分离纯化的表达产物xVEGF和mVEGF的纯度达到95％以上，其相对分子质量与预期值一致。抗小鼠VEGF抗体可特异性识别xVEGF和mVEGF。结论重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、分离纯化及鉴定成功，为进一步研究异种VEGF蛋白质疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2的原核表达及多抗制备

目的克隆表达恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基,制备多抗,为该蛋白的功能研究奠定基础。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pGEX-KG中,构建PfRPA2/pGEX-KG原核表达载体,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,谷胱甘肽柱纯化蛋白,Westernblot检测其抗原性,以纯化的GST-PfRPA2免疫小鼠,制备抗PfRPA2的多抗,间接ELISA法检测鼠血清效价,Westernblot鉴定多抗特异性。结果成功构建了重组PfRPA2/pGEX-KG原核表达质粒,并在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,纯化表达产物,制备抗PfRPA2的鼠多抗,效价为10-7,Westernblot证实此抗体可识别恶性疟原虫内与PfRPA2蛋白位置对应的特异性条带。结论恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化表达产物能诱导小鼠生产能识别天然蛋白的特异性抗体。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体的构建和表达及其活性鉴定

目的 对能与人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）特异结合,并对体内有抑瘤活性的单克隆抗体（Ｅ１１）进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体（ＳｃＦｖ）,为临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶链式反应,扩增并克隆Ｅ１１的可变区基因片段。用一编码亲水肽接头的ＤＮＡ片段将Ｅ１１轻、重链可变区基因连接,克建表达载体ＰＥＴ－１５ＹＶ,并导入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行表达。表达产物经变性及复性后,用免疫组     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

表达人血管内皮生长因子和血管生成素1的CHO细胞株的建立

目的：克隆人血管内皮生长因子(VEGFm)和血管生成素1(Ang1)基因，建立可分别表达VEGFm和Ang1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)株。方法：用PCR技术，分别从人心脏cDNA库中扩增VEGF165和Ang1 cDNA，并定向克隆人真核表达载体pSecTag2B中。用Lipofectamine2000将重组质粒转化入CHO细胞中，用Zeocin筛选并维持已转化重组质粒的CHO细胞株。在大肠杆菌DH10B中扩增转化入CHO细胞中的重组质粒，行DNA测序鉴定。用Westem-blot鉴定CHO细胞中重组VEGFm和Ang1的表达。结果：从人心脏cDNA库中扩增出VEGFⅢ和Ang1 cDNA片段，酶切和测序结果显示，已正确构建重组质粒pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1。用Zeocin筛选到候选的CHO细胞株，DNA测序结果表明，pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1已分别成功转化入CHO细胞中。Western-blot结果显示，在CHO细胞中表达出可被VEGF和Ang1单抗识别的特异蛋白。结论：克隆了VEGFm和Ang1基因，并建立了表达VEGF165和Ang1的CHO细胞株。