人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

抗PSMD10单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗PSMD10的单克隆抗体(McAb),并对其特异性进行鉴定。方法用柱层析纯化的重组PSMD10蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,用Protein-G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western-blot分析其特异性。通过免疫组织化学染色法检测PSMD10在肝细胞肝癌组织中的表达部位。结果筛选出2株能稳定分泌抗PSMD10单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗均为IgG2,Western-blot分析显示,2株单抗都与重组的PSMD10发生特异性结合。免疫组织化学染色分析显示,PSMD10表达在肝细胞肝癌的细胞浆内。结论制备的抗PSMD10杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单克隆抗体,可望用于进一步研究肝细胞肝癌的发生发展、诊断和治疗。     

抗人晚期糖基化终产物受体胞外段不同表位单克隆抗体的制备

目的 制备抗人晚期糖基化终产物受体(RAGE)胞外段单克隆抗体。方法 用纯化人重组RAGE胞外段(氨基酸序列23~342)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1融合制备杂交瘤,经筛选和两次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得两株杂交瘤细胞B2.2和E10,其分泌单抗的亚型均为IgG2b。经ELISA、Western blot和流式细胞仪鉴定,证明两株单抗均可结合重组RAGE及表达于细胞表面的RAGE,且两株抗体识别的位点为远隔表位,所建立的双夹心法可用于检测可溶性重组RAGE。这两株抗体将为研究RAGE相关疾病提供有效的工具。     

抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。方法利用重组Derf1蛋白为免疫原,免疫BALB／c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价。ELISA和Western—blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Derf1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Derf1检测及纯化方法奠定了基础。     

抗人晚期糖基化终产物受体胞外段不同表位单克隆抗体的制备

目的 制备抗人晚期糖基化终产物受体(RAGE)胞外段单克隆抗体。方法 用纯化人重组RAGE胞外段(氨基酸序列23～342)免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与NS—1融合制备杂交瘤，经筛选和两次克隆化，从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得两株杂交瘤细胞B2．2和E10，其分泌单抗的亚型均为IgG2b。经ELISA、Westernblot和流式细胞仪鉴定，证明两株单抗均可结合重组RAGE及表达于细胞表面的RAGE，且两株抗体识别的位点为远隔表位，所建立的双夹心法可用于检测可溶性重组RAGE。这两株抗体将为研究RAGE相关疾病提供有效的工具。     

重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定.方法 用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠.取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗.使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性.结果 ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合.而且,4C6株单抗具有中和活性.结论 获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究.     

人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。　结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。　结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。     

肝肠钙粘连蛋白单克隆抗体的制备及其对HepG2的生长抑制作用

目的 制备及鉴定肝肠钙粘连蛋白(CDH17)的单克隆抗体,研究其对肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用.方法 利用重组CDH17蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗CDH17的单克隆抗体杂交瘤细胞株,通过ELISA和Western blotting分别对其效价和特异性进行鉴定,以不同浓度的单抗分别作用于HepG2细胞24、48、72和96 h.观察细胞数量和形态的变化,MTT法检测其对HepG2细胞的增值抑制作用.结果 成功建立了2株稳定分泌抗CDH17的单克隆抗体杂交瘤细胞株.两株单抗通过Western blotting实验都能特异性地结合真核细胞内源性的CDH17蛋白.不同浓度的单抗作用后细胞数量明显减少、形态不规则.不同浓度的单抗均能抑制HepG2细胞增殖,呈剂量-时间依赖效应,药物浓度和用药时间之间有交互效应(P<0.05).结论 成功建立了两株效价高、特异性好的抗CDH17蛋白的单克隆抗体,其能抑制HepG2细胞增殖,并呈剂量-时间依赖效应.     

血管生成素样蛋白2单克隆抗体的制备和分析

目的：研制抗人血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造条件.方法：以纯化的ANGPTL2重组蛋白皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养基筛选,克隆和亚克隆化培养,ELISA鉴定,得到能稳定分泌抗人ANGPTL2的杂交瘤细胞;以硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清中初步纯化、制备抗人ANGPTL2单抗,以Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色相结合的方法对制备的单抗进行滴度和特异性鉴定.结果：得到1株能稳定分泌抗ANGPTL2的杂交瘤细胞,从其培养上清中制备的抗ANGPTL2单克隆抗体具有较好的特异性和较高的滴度,可用于Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色.结论：成功地研制了抗ANGPTL2单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示ANGPTL2的功能及其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件.     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

分泌抗人精子单克隆抗体杂交瘤细胞的建立

用人精子免疫BALB/C小鼠,用杂交瘤技术制备出9株抗人精子单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光实验证明,9株抗人精子单克隆抗体均能与人精子产生特异性免疫反应。连续传代及液氮中保存的杂交瘤细胞分泌抗人精子单克隆抗体的滴度持续稳定。     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的 制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法 以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株，诱发小鼠产生单抗腹水，用(NH4)2SO4盐析纯化腹水，用间接ELISA法测定单抗效价，用Westemblotting测定抗体特异性。结果 建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株，其中286杂交瘤细胞株抗体效价最高，其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价，分别为l：50000和l：10000。用Westem blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量3l000左右位置出现明显的一条染色条带。结论 自行制备的抗人SP-A单抗，其具有特异性强、效价高的特点。     

Preparation on monoclonal antibodies against laminin receptors and their inhibitory effects on attachment and spreading of tumor cells

Monoclonal antibodies against laminin receptors (LN) isolated from a highly metastatic human giant cell carcinoma of lung (PG) were prepared by routine hybridoma technique. Two positive clones secreted monoclonal antibodies against laminin receptors, one of which was named McB1. McB1 was bound more efficiently to LN-R of cultured PG tumor cells immunohistochemically. McB1 could markedly inhibit the attachment and spreading of S-180 mouse ascitic tumor cells and PG tumor cells on laminin substrate. Monoclonal antibody against LN-R is definitely useful in studying the interaction between tumor cells and extracellular matrix and the molecular mechanisms of invasion and metastases of tumor cells.     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人纤维连接蛋白(fibronectin,FN)羧基端细胞结合域的单克隆抗体,并以该抗体检测心脏瓣膜基质蛋白中FN蛋白的表达情况.方法:用RT-PCR方法获取人FN羧基端细胞结合域基因序列,通过pET32质粒表达获得TRX融合蛋白.并以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠后,按常规方法制备成单克隆抗体,获得分泌抗FN单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果:蛋白电泳结果显示,所获TRX融合蛋白条带与理论计算值相符,免疫动物后获得2株分泌抗FN羧基端细胞结合域不同位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型为IgG2a,免疫组化显示该抗体能特异性地结合人心脏瓣膜基质中的FN.结论:成功制备了分泌抗FN单克隆抗体,为FN结构、功能和机制的研究提供了有效工具.     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

抗人抗苗勒管激素N端439～451表位单克隆抗体的制备及其性能研究

  目的  制备抗人抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone,AMH）N端特定表位肽的特异单克隆抗体并对其特性进行鉴定。  方法  利用生物信息分析软件预测AMH特定多肽片段,合成AMH成熟N端区域的4个抗原性好的表位肽段作为筛选靶抗原。用重组AMH蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP/20细胞进行细胞融合,通过杂交瘤技术制备抗AMH单克隆抗体,用N端4个表位肽（表位1:439～451 RGRDPRGPGRAQR,表位2:273-285 PPRPSAELEESPP,表位3:42～54 DLDWPPGSPQEPL,表位4:494～506 WPQSDRNPRYGNH）分别作抗原,间接ELISA和Western blot对筛选获得的特异抗表位单抗的抗原结合特性进行鉴定。  结果  筛选到两株能够稳定分泌抗人AMH表位1（anti-AMH-1）和表位2（anti-AMH-2）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单抗分别命名为anti-AMH-1和anti-AMH-2。该2株单抗细胞表达纯化后,检测其抗体效价分别为1∶12 000和1∶1 600。Western blot确认两种单抗除效价有差异外,识别抗原也有差异,anti-AMH-1不但能识别AMH的N端439-451表位肽,而且能识别重组AMH的氨基酸序列（rAMH）,也能识别卵巢组织。anti-AMH-2能识别rAMH和卵巢组织。  结论  成功构建了抗人AMH N端的特异表位的2种单克隆抗体。