多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况

目的 建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌（DAEC）的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况。方法 根据DAEC黏附基因afaB、afaC、afaD、daaE及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查。结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afaB/C、afaD、daaE基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20 101 CFU/反应（8.01 103 CFU/ml）。利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2%（24/389）。结论 本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查。     

嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究

目的 建立嗜肺巴斯德菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因设计特异性引物和探针,建立嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异度、敏感度和稳定性.对2008～2011年采集的1 680份样本进行检测.结果 嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有高度特异性,对多杀巴斯德菌、产气巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测灵敏度达22拷贝.标准曲线显示备浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.488,PCR效率为100％.荧光定量PCR检测1 680份样本,检出137份嗜肺巴斯德菌阳性.该方法可直接从样本中特异性地检出嗜肺巴斯德菌.结论 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定的特性,适用于嗜肺巴斯德菌的快速检测.     

儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的检测

目的了解儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的感染情况。方法对95份腹泻患儿粪标本中分离出的大肠埃希菌,用荧光聚合酶链反应（PCR）的方法检测毒力基因,鉴定致泻性大肠埃希菌。结果检测出15株阳性菌株,阳性率为15．8％,其中肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）6株、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）4株、弥散聚集性大肠埃希菌（DAEC）4株和肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）1株。结论致泻性大肠埃希菌是引起儿童腹泻的主要致病菌,临床实验室应加强对致泻性大肠埃希菌的检测。     

泌尿系感染23株大肠埃希菌ERIC—PCR多态性及耐药性分析

目的了解泌尿系统感染大肠埃希菌菌株变异情况及产超广谱p内酰胺酶的耐药情况,指导临床合理用药。方法药敏试验采用K—B法和NCCLS推荐的双纸片协同试验进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测;23株大肠埃希菌运用ERIC—PCR进行聚类分析,并用聚类统计学软件进行同源性分析。结果23株大肠埃希菌中,检出产ESBLs＋11株,检出率为47.8％;药敏结果显示ESBLs＋菌对20种抗菌药物的耐药率均显著高于ESBLs-菌;聚类分析,将23株大肠埃希菌主要分为四大类,相似系数从0．56～0．92。结论ESBLs＋的大肠埃希菌对头孢噻肟的水解能力很强,大部分ESBLs＋菌株对头孢他啶较稳定;亚胺培南、关洛培南是目前少数对ESBLs＋菌高度稳定的抗生素;应加大对第三代头孢菌素应用的监督,减轻抗生素的选择压力;ERIC—PCR指纹图谱基因技术分型方法分辨率高,重复性好,简便快捷,可用于大肠埃希菌医院感染流行病学监测。     

泌尿系感染23株大肠埃希菌ERIC-PCR多态性及耐药性分析

目的了解泌尿系统感染大肠埃希菌菌株变异情况及产超广谱p内酰胺酶的耐药情况,指导临床合理用药。方法药敏试验采用K—B法和NCCLS推荐的双纸片协同试验进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测;23株大肠埃希菌运用ERIC—PCR进行聚类分析,并用聚类统计学软件进行同源性分析。结果23株大肠埃希菌中,检出产ESBLs＋11株,检出率为47.8％;药敏结果显示ESBLs＋菌对20种抗菌药物的耐药率均显著高于ESBLs-菌;聚类分析,将23株大肠埃希菌主要分为四大类,相似系数从0．56～0．92。结论ESBLs＋的大肠埃希菌对头孢噻肟的水解能力很强,大部分ESBLs＋菌株对头孢他啶较稳定;亚胺培南、关洛培南是目前少数对ESBLs＋菌高度稳定的抗生素;应加大对第三代头孢菌素应用的监督,减轻抗生素的选择压力;ERIC—PCR指纹图谱基因技术分型方法分辨率高,重复性好,简便快捷,可用于大肠埃希菌医院感染流行病学监测。     

高分辨率熔解曲线分析法检测大肠埃希菌gyrA基因突变

目的探讨高分辨率溶解曲线(HRM)分析法在检测大肠埃希菌gyr A基因突变中的可行性。方法收集临床非重复分离的大肠埃希菌70株,常规聚合酶链反应(PCR)扩增大肠埃希菌的gyr A基因,采用序列分析法检测gyr A基因的变异情况。设计特异性引物,采用荧光定量PCR扩增这70株大肠埃希菌株的gyr A基因,通过对扩增产物进行HRM分析和熔解温度(Tm)值测定确定gyr A基因变异情况。将检测结果与序列分析法检测结果进行比较。结果基因测序显示70株大肠埃希菌中有43株gyr A基因发生了突变,突变类型分为5型。HRM分析法可以准确区分野生株和突变株,准确率达98.6%(69/70),正确检测出了43株突变菌株中的42株,且对不同的突变类型准确分型。Tm分析显示野生株和突变株之间以及各种突变型之间有明显差异。结论HRM技术具有准确性高、简单、快速、成本低廉、高通量等优点,可以作为检测大肠埃希氏菌gyr A基因突变耐药机制的新选择。     

多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因

目的 建立多重实时PCR检测志贺毒素（stx1、stx2）基因和紧密素基因（eae）的方法。方法 优化多重实时PCR反应条件，检测系列稀释的阳性菌DNA提取物及纯化阳性质粒。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌株，并比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和DNA提取方法，选出最适方法。同时用该方法对36份腹泻患者粪便标本进行直接检测且对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10^1拷贝／pJ的毒力基因和10。CFU／p．1的DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌的阳性和阴性符合率均为100％。粪便样品的DNA提取以BP肉汤增菌6h后煮沸提取效果最好。36份腹泻患者粪便中2份eae阳性，均鉴定为大肠埃希菌。结论 建立的同时检测stx1、stx2、eae基因的多重实时PCR方法，具有较高的敏感性，可用于产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

大肠埃希菌sdiA基因缺失株的建立

目的为研究HSL信号分子对大肠埃希氏菌的影响而建立大肠埃希菌sdiA基因缺失株。方法通过Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113和SM10λpir的sdiA基因,PCR测序鉴定;不同时间点检测A600值,绘制细菌生长曲线;荧光定量PCR检测csgD、csgB基因水平。结果 PCR测序结果经DNAman软件比对分析,与预想结果一致;与野生株相比,sdiA基因突变对细菌生长曲线无明显影响。结论成功建立BW25113、SM10λpir的sdiA基因缺失株,为后续研究铜绿假单胞菌信号分子HSL对大肠埃希菌的影响奠定了基础。     

泌尿系感染产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的检测与耐药性分析

目的了解该院尿培养中产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌的发生率和耐药性，为临床合理选择抗生素提供依据。方法对该院临床和门诊送检的1048例尿培养标本进行分析，用CLSI／NCCLs推荐的纸片扩散法进行抗生素敏感试验，双纸片协同筛选试验和纸片扩散法表型确证试验检测产超广谱β-内酰胺酶。结果共分离到大肠埃希菌136株，占阳性标本的42．7％；其中男性48株，占35．3％；女性88株，占64．7％；产ESBLs大肠埃希菌46株，占33．8％；未检出对亚胺培南耐药的大肠埃希菌。这类菌对呋喃妥因、磷霉素和头孢哌酮／舒巴坦有较高的敏感率。结论大肠埃希菌为泌尿系感染的主要病原菌，女性患者明显高于男性（P〈0．05）；产ESBLs菌株对庆大霉素等10种抗生素的耐药性明显高于非产ESBLs菌株（P〈0．05）。亚胺培南、头孢哌酮／舒巴坦、磷霉素、呋喃妥因、阿米卡星是治疗ESBLs菌的较好选择。临床应重视ESBLs的检测，根据药敏试验合理选用抗生素。     

Quantitative detection of Escherichia coli from urine of patients with bacteriuria by real-time PCR.

INTRODUCTION: Compared with the classical urine culture method, PCR is more rapid, and can detect smaller numbers of bacteria, however it is inferior for quantification. Because of the lack of quantification in routine PCR, the meaning of a positive PCR test result has not been validated for all infections. We report on the development of a novel quantitative detection system for the urinary tract infection (UTI) Escherichia coli using real-time PCR. PATIENTS: We enrolled 200 patients with suspected bacteriuria. METHODS: The gene encoding the universal stress protein (uspA) was found to be highly specific for E. coli. We quantified the copy numbers of E. coli in the urine of patients with UTI by using a real-time PCR assay (the TaqMan system) targeting uspA genes in genomic DNAs isolated from urine samples (n=200). To evaluate the feasibility of this method, the results were compared with those of a standard urine culture. RESULTS: The incidence of positive urine cultures was 75% (150 of 200), and various doses of E. coli were detected in 84 of 150 specimens. The real-time PCR method also detected 84 cases of urinary infections of E. coli in the same specimens. Furthermore, the result of the quantification of E. coli using real-time PCR strongly correlated (r2=0.925) with the result of urine culture. CONCLUSION: Our results suggest that using quantitative-PCR means a faster and simpler diagnosis of E. coli urinary infection can be made compared with the traditional urine culture method.     

Flora distribution and drug resistance in catheter‐associated urinary tract infection

To investigate flora distribution and drug resistance in catheter‐associated urinary tract infection. From January 2003 to January 2008 1,567 patients with urinary tract infection associated with the use of indwelling urinary catheters were analyzed retrospectively, whose urine specimens were cultured for bacteria and the isolated pathogens were tested for drug sensitivity by Kirby‐Baue method. 376 pathogens were isolated from the 1,567 urine specimens (24·0%), most of which were Gram‐negative bacteria. The extended spectrum β‐lactamase (ESBL) rate was 59·8% (79/132) for Escherichia coli and 47·4% (18/38) for Klebsiella pnuemoniae. The isolating rate of Methcillin‐resistant Staphylococcus aureus and Methcillin‐resistant Staphylococcus epidermidis was 54·7% and 88·2% respectively. Catheter‐associated urinary tract infection is mainly caused by Gram‐negative bacteria of multi‐drug resistance. Use of antibiotics should be based on drug sensitivity tests.     

泌尿系感染常见病原菌分布及大肠埃希菌耐药性分析

目的 了解本院泌尿系感染病原菌的分布及大肠埃希菌的耐药性,为临床合理用药提供依据.方法 采用API鉴定系统进行病原菌鉴定,用琼脂纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验.结果 分离出病原菌282株,其中革兰阴性杆菌199株,占70.57%;革兰阳性球菌67株,占23.76%.检出率最高的是大肠埃希菌,其次为肠球菌和葡萄球菌等.大肠埃希菌对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率较低,分别为1.32%、7.89%、11.18%;对复方新诺明、环丙沙星、哌拉西林的耐药率较高,分别为92.76%、80.26%、79.61%.结论 泌尿系感染主要致病菌为大肠埃希菌,临床医生应依据药敏试验结果合理使用抗生素.     

Urinary tract infection aggravates oxidative stress in diabetic patients

To investigate the effect of urinary tract infection on oxidative stress in diabetic patients, we measured the activities of antioxidant enzymes such as catalase and superoxide dismutase, and lipid peroxidation levels in urine specimens of type II diabetic patents with urinary tract infection. A total of 69 patients were included into this study: 23 non-diabetic patients with urinary tract infection, 28 patients with diabetes mellitus, and 18 diabetic patients with urinary tract infection. Twenty-five healthy subjects, matched for age, sex, body mass index and smoking status were also included as control. Urine cultures were performed by the standard techniques, and all grown bacteria were identified as Escherichia coli. Antioxidant enzymes and lipid peroxidation levels in urine were measured by spectrophotometric method. In urine samples of diabetic patients with or without urinary tract infection and in urine samples of non-diabetic patients with urinary tract infection, catalase and superoxide dismutase activities were lower and lipid peroxidation levels were higher than those of the healthy subjects (p < 0.05). Diabetic patients without urinary tract infection were similar to non-diabetic patients with urinary tract infection. Decreased antioxidant capacity and the increased levels of lipid peroxidation were profoundly higher in diabetic patients with urinary tract infection. These results indicate that urinary tract infection aggravates the oxidative stress in diabetic patients. Therefore we believe that diabetic patients with urinary tract infection need antioxidant treatment.     

尿液标本培养中大肠埃希菌的耐药性分析

目的了解本院2008～2009年临床尿培养标本中分离的大肠埃希菌对各类抗生素的耐药性。方法收集2008～2009年本院临床尿培养标本中分离的大肠埃希菌株,按统一的方法和判断标准进行大肠埃希菌的药敏试验和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测的确认试验。结果尿液标本分离出大肠埃希菌416株,对哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因的敏感率较高,未发现对亚胺培南耐药菌株。结论大肠埃希菌为泌尿系感染的常见致病菌,治疗时应尽量根据细菌药敏试验结果调整抗生素。     

尿路感染的病原菌分布特征及耐药性检测分析

目的了解川北地区尿路感染的病原菌分布及对抗菌药物的耐药情况。方法分离自川北医学院附属医院泌尿系统感染患者尿液标本的细菌，采用法国生物梅里埃（API）公司生产的Bio-Merieux VITEK-32全自动细菌鉴定系统对细菌进行鉴定，用琼脂稀释法进行药物敏感试验，双纸片表型确证试验检测产ESBLs菌株，结果用美国临床实验室标准化协会（csu）2006公布的标准判定。结果检出的442株尿路感染的细菌中，革兰阴性菌占71．9％，以大肠埃希菌为主，占42．1％。大肠埃希菌除对亚胺培南全部敏感外，对其它抗菌药均表现出不同程度耐药。186株大肠埃希菌中，产ESBLs85株，检出率为45．8％。结论川北地区尿路感染的主要致病菌为肠杆菌科细菌，不同病原对抗菌药物的敏感性不同。尿路感染的治疗中，医师应根据病原鉴定和药敏试验结果选择恰当的抗菌药。     

泌尿道来源大肠埃希菌继发血流感染的危险因素分析

目的了解住院患者泌尿道来源大肠埃希菌(ECO)继发血流感染情况,探讨泌尿道来源ECO继发血流感染的危险因素及此种现象的分离率变迁情况,为更好地预防和控制泌尿道来源ECO继发血流感染和流行提供科学依据。方法收集2011~2013年由泌尿道来源ECO继发血流感染的住院患者82例,与同期尿培养为ECO但无血流感染患者82例进行单因素χ2检验及多因素Logistic回归分析。分别计算2011~2013年各年及不同科室泌尿道来源ECO的分离率,绘制成表格进行分析得出分离率变迁情况。结果肾功能不全、尿管留置、发热、尿常规白细胞增多在试验组和阴性组中差异具有统计学意义(P0.05),属于危险因素。其中尿管留置、发热、尿常规白细胞增多具有显著关系,属于独立危险因素。结论泌尿道来源ECO继发血流感染为多因素所致,主要与尿管留置、发热、尿常规白细胞增多有关,对存在上述危险因素的患者应尽量减少侵入性操作(如泌尿插管等),严格无菌及消毒制度,密切关注临床症状及其实验室检查指标。通过分离率的图表发现,泌尿道来源ECO继发血流感染的现象明显升高,并在该院呈扩散趋势。     

高通量测序技术在尿路感染及腹膜透析相关腹膜炎病原学诊断中的价值

目的比较尿路感染、腹膜透析相关腹膜炎患者采用高通量测序技术、常规培养法对病原体的检出情况,探讨高通量测序技术在尿路感染、腹膜透析相关腹膜炎病原学诊断中的应用价值。方法收集77例尿路感染患者中段尿标本,36例腹膜透析相关腹膜炎患者透析流出液标本,分别应用高通量测序技术、常规培养法进行检测,记录病原体检出率及病原体分布情况,以培养法为金标准,计算高通量测序法对病原体检测的灵敏度。结果77例尿路感染患者中,高通量测序法检出病原体70例(90.9%),共分离出病原体169株;培养法检出病原体27例(35.1%),共分离出病原体27株;以培养法为金标准,高通量测序法对尿路感染患者病原体检出的灵敏度为96.3%。36例腹膜透析相关腹膜炎患者中,高通量测序法检出病原体28例(77.8%),共分离出病原体39株,培养法检出病原体11例(30.6%),共分离出病原体11株;以培养法为金标准,高通量测序法对腹膜透析相关腹膜炎患者病原体检出的灵敏度为72.7%。结论对尿路感染、腹膜透析相关腹膜炎患者,采用高通量测序技术检出的病原体株数多于培养法,可作为培养法的有效补充。     

实时定量PCR检测IgH基因重排在成人B系急性淋巴细胞白血病微量残留病监测中的意义

目的 应用实时定量PCR(RQ-PCR)方法 检测患者的免疫球蛋白重链(IgH)基因重排,探讨其在成人B系急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的微量残留病(MRD)动态监测中的意义.方法 15例B系ALL患者的初诊DNA标本经PCR扩增莺排的IgH基因,克隆产物经基因测序、序列比对后,根据每例患者的克隆特异性序列信息,利用软件设计15条等位基因特异性寡核苷酸(ASO)引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的JH下游引物和TaqMan探针,监测患者随访标本MRD靶分子.7例Ph+患者同时用RQ-PCR检测bcr-abl融合基因转录本.结果 使用ASO引物RQ-PCR法扩增15例患者IgH重排靶基因的敏感性为10-3～10-5,荧光背景信号未显示或较低.动态监测表明:高危组患者诱导完全缓解(CR)后体内MRD水平明显高于标危组患者,诱导CR后MRD>10-3的患者复发率(71.4%)高于MRD≤10-3的患者(12.5%),MRD>10-3的患者生存时间短.另外,Ph+患者bcr-abl融合基因转录本的对数级变化趋势与IgH重排靶基因水平的动态变化一致.结论 使用ASO引物RQ-PCR方法 检测IgH基因重排,具有敏感性高、特异性强、结果 可靠等优点,可对肿瘤克隆进行准确定量.B系ALL患者体内IgH基因重排水平与临床治疗反应和疾病预后密切相关,可用于患者病情的随访监测.