慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5 α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-APRIL shRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107 TU/ml.感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P＜0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P＜0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异.结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRILshRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达.     

靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

TGFβ1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.方法:根据人TCFβ1的mRNA序列选择3个靶序列并根据它们设计合成3对寡核苷酸序列.同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连人pRNA-U6/Lenti质粒,酶切和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293FT细胞,包装产生病毒颗粒.各组病毒载体转染Hela细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TGFβ lmRNA和蛋白的表达水平.结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6/Lenti质粒;各质粒与包装质粒共转染293FT细胞后能产生高滴度的慢病毒载体颗粒;各组慢病毒载体感染Hela细胞后,有两组可以显著抑制TGFβ1mRNA水平及蛋白水平的表达,其中以第一组效果最佳.结论:成功构建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的针对间皮素(MSLN)构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装,探讨MSLN功能.方法根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNAT-U6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒,转染OVCAR-3细胞后,检测RNA干扰效率,选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装,并检测病毒滴度,用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响.结果测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确.脂质体转染重组慢病毒质粒pRNAT-siRNA3的RNA干扰效率最高,为67.5%.鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108ifu/mL.pRNAT-siRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%,pRNAT-siRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为(15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组(30.0±5.8)%,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论pRNAT-siR-NA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR-3细胞MSLN表达以及粘附能力.MSLN RNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因治疗建立了一个良好的平台.     

人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P<0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。     

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的：构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上定其沉默效率。 方法：针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。 结果：构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10⁸ PU/L。shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%。 结论：成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

慢病毒介导靶向survivin基因的shRNA抑制子宫内膜在裸鼠腹腔种植生长

目的研究慢病毒介导生存素(survivin)基因特异性短发夹状RNA(shRNA) 对人子宫内膜在裸鼠腹腔种植生长的影响。
方法将45只裸鼠随机分为实验组、阴性对照组及空白对照组,每组15只,将子宫内膜异位症患者在位内膜注射入裸鼠腹腔,同
时将survivin-shRNA慢病毒、空载慢病毒及磷酸盐缓冲液分别注射至3组裸鼠腹腔内,2周后观察各组子宫内膜种植成功率,光
镜下观察异位病灶的形态学特点,免疫组化方法检测各组病灶中survivin 的表达水平。结果实验组子宫内膜种植成功率
（26.67%）明显低于阴性对照组（73.33%）及空白对照组（80%,P<0.01）;实验组成活的异位内膜腺体发育不良,间质伴有不同程
度的坏死;该组病灶中survivin蛋白表达亦明显下降,与两对照组比较差异有显著性（P<0.001）。结论慢病毒介导survivin基因
特异性shRNA能够通过靶向沉默survivin基因明显抑制人子宫内膜在裸鼠腹腔中的种植生长。
     

靶向抑制存活素基因对大肠癌细胞SW80侵袭和转移的实验研究

目的 构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞SW480中,研究靶向抑制survivin基因对SW480细胞侵袭和转移的影响.方法 根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19 nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine 2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞SW480中;用Western blotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对SW480细胞的侵袭和转移潜能的影响.结果 Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默SW480的survivin基因可以显著抑制SW480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,SW480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少.结论 Survivin基因可能在SW480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默SW480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响SW480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关.     

PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法：针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ 酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。 结果：PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV。包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9 TU•mL^-1。将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70%以上。结论：成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

pGenesi1-1-EGFP-shRNA／survivin真核表达载体构建及其表达验证

目的构建用survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin并验证其在宫颈癌Caski细胞中的表达。方法用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA／U6载体中的u6启动子从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP—shRNA／survivin;将pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin转染到宫颈癌Cash细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化。结果成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin载体,分别转染Caski及HuVEC细咆,在Caski细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达。结论survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌Caski细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达。     

小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体外对树突状细胞的作用

 目的 构建小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒表达载体，并在体外观察其对小鼠骨髓源性树突状细胞（dendritic cell，DC）的作用。方法 针对已经筛选确定的CD80基因RNA干扰有效靶序列，合成靶序列的双链DNA，接入pGCL-GFP载体，再与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度；同法构建出CD86基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的DC，通过荧光显微镜检测感染效率，Annexin V/PI双染色法检测感染细胞凋亡和坏死情况，流式细胞仪检测CD80和CD86的表达情况。结果 PCR和测序证实，pGCL-CD80shRNA和pGCL-CD86shRNA慢病毒载体构建正确，病毒滴度均达2×107TU/mL，适合感染DC的MOI值为20，此时慢病毒对DC具有低毒性，感染效率为85.42%。CD80和CD86表达的抑制率分别为82.05% 和77.78%。结论 成功构建出小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体，其有明显抑制DC表面CD80和CD86的表达，这为移植物排斥提供了新的治疗手段。     

慢病毒介导shRNA沉默survivin基因对鸡胚绒毛尿囊膜子宫内膜异位症模型的影响

目的研究慢病毒介导生存素基因特异性短发夹状RNA(shRNA)对子宫内膜异位症异位内膜生长及新生血管形成的影响。方法建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)子宫内膜异位症模型,随机分成单纯接种组、shRNA慢病毒组、空载慢病毒组和空白载体组,每组30只。通过Image-proplus软件测量新生血管面积与鸡胚尿囊膜面积比(VA/CAM)评价沉默survivin基因对CAM血管生成的影响,TUNEL检测异位内膜细胞凋亡,组织病理学观察异位内膜病灶生长行为。结果 shRNA慢病毒处理组种植内膜存活率最低,该组VA/CAM明显低于单纯接种组、空载慢病毒组和空白载体组(P<0.001),后3组间比较无显著性差异(P>0.05)。shRNA慢病毒处理组种植内膜细胞凋亡率明显高于其他3组(P<0.05),另3组间比较无显著性差异(P>0.05)。shRNA慢病毒处理组病灶在光镜下可见腺体结构不完整,间质伴有不同程度的坏死。结论慢病毒介导survivin基因特异性shRNA能够显著抑制人子宫内膜异位症种植CAM模型的新生血管形成,抑制子宫内膜在CAM上的种植生长。     

PINCH-1基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人PINCH-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并转染人骨髓基质细胞初鉴定转染效果.方法 利用RNAi设计软件,设计合成针对人PINCH-1基因的特异性siRNA序列,利用酶切反应合成包含特异性shRNA序列的pGCSIL-GFP慢病毒载体GC-shBC047440,通过GC-shBC047440与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.获取的病毒上清筛选最适感染复数(MOI值),并感染骨髓基质细胞,RT-PCR和Western blot检测重组慢病毒对骨髓基质细胞PINCH-1蛋白和RNA表达的影响.结果 酶切鉴定证实成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒干扰载体GC-shBC047440,载体感染人骨髓基质细胞后PINCH-1 RNA表达较未感染组和空载体对照组显著下降.结论 成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒载体,该载体能有效沉默PINCH-1基因的表达.     

survivin短发夹状RNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌细胞survivin表达的影响

目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin 表达的抑制作用.方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达.结果:成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好.结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础.