HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定、高效的HBx蛋白体外表达细胞株。以便进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机理。方法建立HBX真核表达载体pcDNA3．1-HBX,通过脂质体介导将pcDNA3．1-HBX转染到人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中。结果RT-PCR、蛋白质印迹及免疫荧光的实验结果显示,HBX基因在人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中得到了表达。结论成功构建了表达HBx蛋白的HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株,为进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机制奠定了实验基础。     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的 在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6.用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 rnRNA和蛋白的表达情况.方法 将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在.RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况.结果 酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒.重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分另q为1600bp和60KD左右.结论 重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础.     

Ad-HBx的构建及在肾小球足细胞系的表达

目的 构建携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体,并感染小鼠肾小球足细胞株MPC5,使目的 基因HBx在该细胞株有效表达.方法 由质粒PCI-neo-HBx中扩增目的 基因HBx.插入至pShuttle-CMV(-)穿梭质粒中,而后再与pAdxsi质粒酶切连接为重组腺病毒质粒pAd-HBx,经酶切及测序鉴定正确后,以Pac Ⅰ酶切线性化转染293细胞进行包装扩增得到Ad-HBx.以Ad-HBx感染MPC5细胞,Western blot检测感染后目的 蛋白HBx的表达.结果 重组腺病毒载体经限制性内切酶酶切、电泳和基因测序鉴定,证实Ad-HBx构建成功;当MOI=50时.MPC5细胞即可100%被重组腺病毒感染,且持续至感染后72 h仍有较强水平的表达;感染Ad-HBx的MPC5细胞可稳定表达HBx蛋白.结论 成功构建了Ad-HBx,并能在MPC5细胞中稳定表达,为进一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用奠定了基础.     

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的 构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达.方法 采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞.获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞.通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的 蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达.结果 (1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础.     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立

目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响。方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMV-Tag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的HepG2细胞,最后通过RT-PCR和Western blot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期。结果 （1）成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120。（2）成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系。（3）通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数（G₂+S）明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞。结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强。为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

HBX基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建携HBX基因的腺病毒载体,为进一步研究HBX基因的功能,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础.方法:采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因;将HBX基因亚克隆至质粒pHAHA,构建质粒pHAHA-HBX,酶切pHAHA-HBX质粒,将HAHA-HBX片段克隆到腺病毒载体pAd-Track-CMV中,得到pAdTrack-CMV-HBX,同时与pAdEasy-1共转染293细胞,确定转染效率.检测培养上清病毒中HBX的存在.结果:将PCR扩增HBX片段成功克隆到腺病毒载体中,并经序列分析证实;建立了产病毒细胞株,证实重组病毒中含有HBX基因.结论:成功构建了携HBx基因的腺病毒载体.     

hSALL4基因逆转录病毒载体的构建及在小鼠髓系祖细胞中的表达

目的：构建含人SALL4B基因的逆转录病毒载体并证明其在小鼠髓系祖细胞中的表达。方法：①用PCR方法从质粒pcDNA3-hSALL4B扩增包括有全部编码序列的人SALIABcDNA,将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成含hSALL4的重组逆转录病毒载体;②将重组质粒在包装细胞系PT67中进行包装,用病毒上清感染32D细胞;③RT—PCR分析其mRNA表达;④Westernblotting分析其蛋白质的表达。结果：①限制型内切酶酶切,PCR及DNA测序均证实hSALIAB成功地克隆入pLXSN;②转染的32D细胞在mRNA水平及蛋白水平均有SALIAB表达。结论：成功地构建了含人SALIAB的逆转录病毒表达载体;且表达于32D细胞中,为研究SALIA基因过表达对造血功能的作用及其机制奠定了基础。     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

pLXSN-EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30.7%细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化;使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。     

携带HuIL-3基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

应用HA方案（三尖杉酯硷联合阿糖胞苷）剂量个体化治疗23例老年人慢性粒细胞白血病（慢粒），完全缓解（CR）率为69．6％，CR平均所需15．4天，平均持续CR时间为34.3月，均显著高于单用马利兰／羟基脲组；骨髓抑制发生率为34.8％，但经间歇期后均恢复正常．bcr／ablmRNA阳性病例的CR率为85．7％（12／14）优于bcr／ablmRNA阴性病例（0／3）．本资料显示：HA方案剂量个体化治疗老年人慢粒缓解率高，CR所需时间短，维持CR时间长，副作用小，是老年人慢粒治疗较满意方案．     

携带HuIL-3基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

目的:构建携带人白细胞介素3（HuIL－3）cDNA的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：将HuIL－3cDNA克隆到逆转录病毒载体pMNSM的PL位点，构建SV40早期启动子驱动的载体pMNS－IL－3；从质粒pGEM．7Zf－AFPe中游离人甲胎蛋白（AFP）增强子核心序列，先克隆到pMNSM的PL位点上，再将HuIL－3cDNA片段克隆到PL位点上，构建出SV40早期启动子和AFP增强子驱动的人肝癌特异性表达载体PMNSA－IL－3。结论：该载体为肝癌特异性转基因治疗提供了一条途径。     

人ERGIC3基因稳定表达支气管上皮细胞株的建立与迁移能力

目的 构建含ERGIC3基因真核表达载体,并转染至支气管上皮细胞株BEAS-2B,筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株,为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF框的DNA序列,构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3,用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒;用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞,通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的单克隆化细胞;采用定量RT-PCR和Western blot对ERGIC3稳定表达的细胞株进行鉴定,并用划痕实验分析稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化.结果 获得4个ERGIC3稳定表达的BEAS-2B细胞株,ERGIC3的表达量均远高于对照组细胞,分别为对照组细胞的45.3、48.8、41.5和28.2倍,且稳定转染细胞株的迁移能力也显著增强（P＜0.05）,但其形态学没有明显变化.结论 成功构建了含ERGIC3基因真核表达载体pLXSN-ERGIC3;筛选出多个ERGIC3基因稳定转染的BEAS-2B细胞株,且迁移能力明显提高.     

Construction of retrovirus vector with HBV Pol gene and its expression invitro

Objective: To construct retroviral vector with HBV Pol gene and study its expression in vitrn. Methods: The recombinant plasmid HBV2/pBR322 containing 2 copies of HBV full-length gene was provided as the amplification template. The PCR product was cloned into pMD 18-T and subeloned into pMSCVneo and pLNCX2 to construct the recombinantret roviral vectors with HBV Pol gene named by HBV P/pMSCVneo and HBV P/pLNCX2. HBV Pol gene was detected by RTPCR after transfecting the recombinant plasmids into SMMC7721 cells with liposome and G418 selection. Results: The retroviral vector with HBV Pol gene was successfully constructed and the expression of HBV Pol gene in vitro was detected by RTPCR. Conclusion: The retroviral vector with HBV Pol gene can be obtained, which will provide a new insight on the function of HBV Pol gene.     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.