转LacZ基因骨髓间充质干细胞体内造血分化的初步研究

目的　初步探讨小鼠骨髓间充质干细胞在体内造血细胞分化的潜能。方法　利用转LacZ基因小鼠MSCs输注X射线亚致死量照射的BALB/C小鼠,2个月后取骨髓细胞作体外甲基纤维素培养和X -Gal染色,取肝脏X -Gal染色。结果　MSCs输注组和对照组骨髓细胞体外集落培养均能形成鹅卵石样造血细胞集落,经X -gal组化染色后,输注组部分造血集落产生蓝绿色,对照组没有颜色变化。肝脏X -Gal染色输注组部分产生蓝色,对照组没有颜色变化。结论　小鼠MSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血小鼠造血的影响

目的:通过从脐带中分离和培养脐带间充质干细胞(MSCs),探讨其对再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓造血的影响。方法:原代贴壁法培养人脐带MSCs,将小鼠分为模型组、对照组、MSCs输注组进行实验。经静脉输注免疫介导方法建立再障模型小鼠,分别于3、7、14、21、28 d观察其外周血象指标变化和骨髓组织形态;ELISA检测造血负调控因子(IFN-γ)的水平,计数骨髓造血干细胞集落生成单位。结果:原代培养中脐带组织块直接贴壁后8～10 d,边缘爬出长梭形MSCs,随传代培养呈平行、漩涡状生长;再障小鼠经MSCs输注治疗后外周血象明显增高,IFN-γ水平下降(P0.01);治疗组骨髓红细胞集落形成单位与粒-巨噬细胞集落形成单位均较模型组明显增高(P0.01),成纤维细胞集落形成单位计数差异无统计学意义(P0.05)。结论:人脐带来源的MSCs对再障模型小鼠骨髓可发挥造血支持作用。     

电离辐射对胎鼠皮肤间充质干细胞支持骨髓粒系造血作用的影响

目的：观察不同剂量的X射线照射对体外培养的胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)支持造血细胞增殖作用的影响,为提高造血干细胞体外扩增效率提供一种更为有效的方法,进而为造血干细胞移植提供一个新的途径。 方法：分别用不同剂量的X射线照射培养的胎鼠皮肤MSCs层,然后将骨髓细胞种植于该细胞层上,扩增后不同时间(0~12 d)进行骨髓CFU-GM集落培养,同时取经X射线照射的皮肤MSCs的上清液进行骨髓CFU-GM、CFU-E及BFU-E培养,观察射线对胎鼠皮肤MSCs造血支持作用的影响。 结果：6、8和10 Gy剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs与骨髓细胞共同作用7 d时,骨髓祖细胞集落显著增加,其中6 Gy组增加最为明显,CFU-GM是0 Gy组的2.17倍。6、8和10 Gy剂量X射线照射培养皮肤的上清液体外亦可刺激骨髓CFU-GM、CFU-E、BFU-E的生长,与0 Gy组比较差异均有显著性(P<0.05)。其中6 Gy组增加最为明显,分别达0 Gy组的1.81倍、3.94倍和3.51倍,集落亦明显加大。 结论：一定剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs,其体外支持造血的作用增强,无论照射后的单纯MSCs细胞层还是上清液都可使骨髓细胞集落数增多。     

联合应用粒细胞集落刺激因子和骨髓基质干细胞治疗急性心肌缺血的实验研究

目的 探讨粒细胞集落刺激因子和自体骨髓基质干细胞(MSCs)移植共同应用对心肌缺血的治疗作用.方法 采用MSCs在体外培养扩增.在结扎冠状动脉造成急性心肌缺血后,把被5溴-2脱氧尿苷(BrdU)标记后的MSCs移植到自体的缺血心肌中,同时腹腔注射粒细胞集落刺激因子5 d.4周后通过激光共聚焦显微镜验证移植后的MSCs是否向心肌细胞分化,通过心脏彩超和多导生理记录仪测定缺血心肌在移植自体MSCs后是否能提高心功能.另外,用Masson氏三色染色法从左室中断面切片量化心肌梗死范围.结果 移植4周后,MSCs向心肌细胞分化,表达出α-横纹肌肌动蛋白和存在于心肌闰盘中的connexin43,联合应用粒细胞集落刺激因子和MSCs的治疗组左心室收缩功能恢复较好,心肌梗死面积最小,单独应用MSCs移植的治疗组次之,对照组心肌左室收缩功能恢复较差,心肌梗死面积最大.结论 MSCs移植后可以向心肌细胞分化,粒细胞集落刺激因子可以动员机体内自体MSCs到心肌缺血区域,二者联合应用对于缺血心肌有协同治疗作用.     

骨髓基质细胞输注对化疗小鼠造血功能恢复的实验研究

目的以BALB/C小鼠为实验对象,探讨骨髓基质细胞输注对化疗小鼠造血功能的影响.方法BALB/C小鼠骨髓基质细胞体外扩增培养后输注给化疗后的同系小鼠,在输注后第3、7、14天进行各项指标的检测和观察.用常规方法进行外周血细胞计数;在体外骨髓细胞混合集落培养形成后计数集落形成单位;用流式细胞仪测定细胞周期,计算骨髓细胞增殖指数(PI).结果(1)骨髓基质细胞输注组外周血WBC、PT在第7天较单纯化疗组明显提高(P＜0.05);(2)骨髓细胞混合集落形成单位数在第3、7、14天显著高于单纯化疗组(P＜0.01);(3)输注组骨髓细胞增殖指数(PI)第7、14天显著高于单纯化疗组(P＜0.05).且输注了骨髓基质细胞的小鼠各项指标到第7天就已恢复至正常水平,而对照组则需14d,两组间差异具有显著性(P＜0.05).输注扩增培养的骨髓基质细胞无毒副反应.结论骨髓基质细胞输注可加快化疗小鼠造血功能的重建.     

大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能。 方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以 下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗+单纯输注MSC;实验组2(B组),放疗+输注天麻诱导1h MSC,A、B组每只小鼠注射0.3mL含1.5×106cells的无血清培养液。空白对照组,放疗+输注等量无血清培 养液。照射后4h内,分别经尾静脉注射。移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细 胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45表达。结果:所有实验小鼠均能存活到2个月,骨髓、外周血、脾细胞悬液 均可检测到低表达的大鼠源性CD11a、CD45。对照组为阴性。A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P< 0.05)。结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能。     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

骨髓间充质干细胞移植重建极重度放射损伤小鼠造血功能

目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cell,mMSC)单独输注对重度放射损伤小鼠造血功能重建的影响.方法:将体外培养扩增的雄性C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞输注给受致死剂量全身照射(8 Gy)的雌性C57BL/6小鼠,检测移植后外周血象、骨髓有核细胞数、病理变化、粒-单核细胞系祖细胞集落(CFU-GM)计数及性染色体比例,以未输注MSCs的小鼠作对照.结果:对照组小鼠(n=6)在照射后20 d内全部死于造血功能衰竭;MSCs组移植后血象明显下降,但2周后迅速恢复,28 d时恢复到照射前的60%左右,42 d外周血象基本恢复.MSC促进骨髓有核细胞数及CFU-GM快速恢复,有利于骨髓组织学的明显恢复改善.移植后42 d,仍可在受致死量照射的受体鼠内检测到供体MSC,但不能长期植入.结论:小鼠骨髓间充质干细胞单独输注可促进重度放射损伤小鼠的造血功能恢复,其植入时间长短可能与输注的细胞量有关.     

培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化

目的探讨体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞、脂肪细胞分化的方法,以及钙结节形成、Ⅰ型胶原表达等情况. 方法分离人骨髓间充质干细胞,经过原代培养和传代培养,分别加入成骨诱导、脂肪诱导培养体系,经过倒置显微镜观测与HE染色了解诱导后细胞形态变化,并通过von Kossa染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、苏丹黑染色与油红O法染色鉴定细胞的性质.另取2代细胞体外培养,加入成骨诱导分化试剂,以碱性磷酸酶(ALP)为检测指标计数细胞阳性率,比较成骨诱导1、2、3、4周时细胞碱性磷酸酶的变化.结果体外培养的MSCs在合适的条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞分化.细胞经成骨诱导2～3周时细胞碱性磷酸酶阳性率最高,达到85%.结论 MSCs体外培养在一定条件下向成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞分化,体外培养时形成钙结节,并表达Ⅰ型胶原.培养2～3周后细胞经成骨诱导分化细胞ALP阳性率较高.     

在心肌细胞/MSCs共培养体系中MSCs出现心肌分化表型

目的:观察MSCs在心肌细胞/MSCs共培养体系中向心肌细胞的分化情况.方法:体外分离培养大鼠心肌细胞,然后将传代后大鼠MSCs与心肌细胞混合培养,建立心肌细胞/MSCs共培养体系,同时以心肌细胞培养上清液及成纤维细胞培养上清液为诱导因素作对照.培养1周后行免疫细胞化学染色,鉴定MSCs中心肌特异性cTnT蛋白的表达.结果:在心肌细胞/MSCs共培养体系中,MSCs与心肌细胞交织成网状,部分MSCs出现cTnT的表达,而对照组MSCs未检出cTnT的表达.结论:体外模拟的心肌环境可以诱导MSCs向心肌细胞分化并表达心肌细胞特异性标志物,诱导MSCs向心肌分化的分子信号可能是心肌细胞膜蛋白.     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

体外诱导细胞转化为胰岛细胞的研究进展

巢素蛋白（nestin）阳性细胞、成体干细胞（包括间充质干细胞和胰腺导管上皮细胞）和胚胎干细胞是常用的体外诱导转化为胰岛细胞的种子细胞,本文就这三类细胞的来源、实验方法及实验结果的研究进展进行综述。     

外源性褪黑激素对小鼠生精细胞凋亡的影响

目的 观察褪黑激素对生精细胞凋亡的影响。方法 HE染色、TUNEL测定(核快红复染)。结果 HE染色下睾丸间质细胞的面积随褪黑激素的增多而减小，与睾酮的浓度变化相一致。TUNEL阳性细胞随褪黑激素的增加有增多的趋势，但超过一定量后(100ug)，不再增多。20～30d的处理组呈现与30～40d的处理组不同的结果。结论 外源性褪黑激素具有促进生精细胞凋亡的作用。这种作用与其对睾酮的抑制作用不相一致。     

大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的实验研究

目的探讨将人骨髓间充质干细胞(HBMCs)诱导为内皮细胞(ECs)的可行性。方法将HBMCs分离、培养后,加入诱导因子定向诱导为ECs,并对细胞进行鉴定。结果经鉴定,HBMCs在特定环境下分化为了ECs。结论以HBMCs诱导的ECs作为种子细胞,具有可行性。     

大鼠骨髓间质干细胞定向分化为神经元的实验研究

 【目的】 研究体外培养骨髓来源的表达nestin的成年大鼠骨髓间质干细胞(MSC)并诱导分化神经元样细胞的潜能,为中枢神经系统疾病的细胞移植治疗提供理想的供体&#65377;【方法】 采用全骨髓法分离培养成年SD大鼠MSC,传至第6代的MSC接种在前一天涂有100 μg/L多聚赖氨酸的塑料培养瓶或培养皿中,用含100 mL/L FBS的DMEM/F12培养液添加10 ng/mL bFGF的培养液培养并以DMSO&#65380;BHA与Forskolin等诱导剂联合诱导MSC分化为神经元&#65377;流式细胞仪鉴定诱导前MSC的细胞表面抗原,免疫荧光检测诱导前及诱导后6 h&#65380;12 h&#65380;24 h神经元特异性抗原nestin&#65380;NF*9鄄200和GFAP表达率&#65377; 【结果】 流式细胞仪检测传至第6代MSC表面抗原CD29和CD44阳性率分为98.8%,96.6%, CD34和CD45阴性&#65377; 免疫荧光鉴定传至第6代的MSC表达nestin阳性率为57.1% ± 6.9%,不表达NF*9鄄200和GFAP&#65377;诱导后30 min可见神经元样细胞出现,诱导后6 h&#65380;12 h&#65380;24 h经nestin和NF*9鄄200免疫荧光鉴定,诱导后6 h&#65380;12 h&#65380;24 h nestin阳性率分别为96.5% ± 1.9%,88.1% ± 5.4%,33.5% ± 5.4%,NF*9鄄200阳性率分别为90.1% ± 2.9%,97.5% ± 1.3%,98.1% ± 1.6%&#65377;【结论】 骨髓来源的nestin阳性的MSC具有神经祖细胞特性并且可诱导分化为神经元样细胞,可作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗&#65377;