可注射温固化支架复合异体软骨细胞修复关节软骨缺损的初步研究

目的探讨可注射性温固化凝胶壳聚糖-甘油磷酸钠（C-GP）复合同种异体软骨细胞在体内形成透明软骨和注入关节腔后修复关节软骨缺损的可行性和有效性。方法将预制的壳聚糖和甘油磷酸钠按一定体积比制成混合液,实验组为支架复合同种异体软骨细胞,设单纯支架和生理盐水为两组对照。注入成年兔的背部皮下和预制关节软骨缺损的关节腔内,复合物在体内37℃形成凝胶,术后4、8、12周分别行大体、组织学（HE、TB）、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察,并进行Wakitani评分。观察其体内成软骨和填充并修复关节缺损效果。结果液态C-GP复合物注入体内可形成凝胶,实验组皮下生长4周,组织学观察示典型的透明软骨样结构且分泌基质;C-GP复合细胞注入关节腔可很好地填充关节缺损,并于4周后开始形成透明软骨样结构且表面平整与宿主整合良好,组织学切片上可见类软骨形成并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质和软骨特异性Ⅱ型胶原。结论可注射性C-GP复合软骨细胞体内可形成具有一定形态功能的类软骨组织,能够应用于微创技术再生修复软骨的缺损。     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

丝素蛋白无纺网支架体外构建组织工程化软骨

目的:探讨丝素蛋白无纺网作为耳廓软骨细胞外支架构建组织工程化软骨的可行性。方法:取成年新西兰兔耳廓软骨,酶消化法获取软骨细胞,体外培养扩增后取原代细胞接种到制备好的丝素蛋白无纺网支架上,体外复合培养。每天倒置显微镜下观察细胞黏附、生长、增殖情况,于复合培养第3、7、10天时取材进行扫描电镜观察;于复合培养第1、2、4、6周取材进行组织学评价,同时取材通过RT-PCR方法检测复合物上软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。结果:48 h后软骨细胞已黏附于丝素蛋白纤维上,72 h后细胞开始分泌少量细胞外基质;电镜下观察显示软骨细胞及分泌的薄层细胞外基质主要分布于支架材料表面。组织学观察显示2周时支架浅层已有一定厚度软骨组织,可见少量类软骨陷窝,4周和6周时支架浅层软骨组织增厚,软骨陷窝增多,但支架内部软骨细胞数目少,细胞呈星形或梭形,细胞分泌的基质也很少。RT-PCR检测显示在各检测时间点均有Ⅱ型胶原mRNA的表达。结论:兔耳廓软骨细胞在丝素蛋白无纺网支架上已初步形成软骨样组织,但培养条件应进一步优化。     

自体软骨细胞立体培养修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的探讨自体软骨细胞立体培养构建的组织工程软骨修复关节软骨的效果。方法24只4～6月龄新西兰大白兔进行标记,首先在股骨下端建立动物软骨3.5mm缺损模型,获取软骨细胞进行体外培养、扩增,3代后获取足够细胞数量,制成1×108/ml细胞悬液,植入细胞载体Ⅰ型胶原海绵培养,两周后移植到自体3.5mm的软骨缺损面上,分别1、2、3个月处死观察。结果软骨细胞与细胞载体Ⅰ型胶原海绵有良好组织相溶性,两者培养形成自体组织工程软骨能完成关节软骨缺损修复。第1个月修复组织初步具备纤维软骨特征,第2个月初步具备透明软骨特征,第3个月修复组织具备透明软骨的生物学特性。结论细胞载体Ⅰ型胶原海绵与软骨细胞体外培养形成的组织工程软骨,能完成关节软骨的修复,修复组织为透明软骨。     

间充质源性软骨种子细胞与脱细胞软骨复合培养构建软骨组织

目的兔外周血间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养,构建新型软骨组织,为临床修复器官缺损及再造提供实验基础。方法提取兔外周血间充质干细胞,行体外诱导培养14 d获得软骨种子细胞,显微镜下观察细胞生长特性,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。联合去垢剂—酶法获得兔脱细胞肋软骨支架,软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨支架体外复合培养7 d获得复合软骨,脱细胞软骨及复合软骨固定后行扫描电镜观察及组织学HE、甲苯胺蓝染色。结果兔外周血间充质干细胞体外诱导培养14 d,胞浆内较多软骨细胞特异性Ⅱ型胶原分泌;兔脱细胞软骨呈乳白色,结构完整、孔隙均匀,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分,其孔隙率(61.31±8.45)%,孔径长度(32.80±5.15)μm。支架与软骨细胞黏附良好,并伴有多量基质分泌。结论间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养可构建新型软骨组织,本研究为临床修复器官缺损及再造提供了实验依据。     

异体软骨细胞复合透明质酸苄基酯凝胶修复关节软骨缺损

目的 :研究采用同种异体软骨细胞复合透明质酸苄基酯凝胶修复关节软骨缺损的效果。方法 :将体外培养的同种异体第二代软骨细胞与透明质酸苄基酯凝胶复合注入兔关节软骨缺损区作为实验组 ,以软骨细胞悬液组和不作任何处理组作为对照 ,于第 4、8、1 2周取材 ,进行大体、组织学、电镜检查 ,观察其修复效果。结果 :实验组术后 1 2周时 ,缺损区可见新生透明样软骨组织 ,表面光滑 ,与周围软骨界面难以辨认。软骨细胞悬液组和空白对照组组均未见明显修复。结论 :同种异体软骨细胞复合透明质酸苄基酯凝胶修复关节软骨缺损效果明显 ,将透明质酸苄基酯凝胶作为移植载体是可行的。     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

壳聚糖-明胶多孔复合支架构建自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的探讨壳聚糖一明胶多孔复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法消化分离猪耳廓软骨细胞,接种于自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上培养1周,将细胞一生物支架复合物种植于猪自体腹外侧壁皮下,第10、16周取材,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学对再生软骨组织进行评价。结果HE染色见10周时有软骨组织形成,所形成的软骨组织见软骨细胞均匀分布,包埋在软骨陷窝内,还可见未降解的支架材料。16周时软骨组织完成成熟,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,支架材料完全降解,结构与正常软骨组织相似。Masson’s trichrome染色见所形成的软骨组织间质中都有被染成绿色的胶原分布。Vehoeff染色见16周时形成的软骨间质内含大量被染成蓝黑色弹性纤维。免疫组化证实形成的软骨组织有Ⅱ型胶原分布,生物化学证实所形成的软骨组织的蛋白聚糖含量与正常猪耳软骨的含量接近。结论利用自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织,但形成的软骨不充分,壳聚糖一明胶多孔复合支架有以作为软骨组织工程支架的应用前景。     

聚乳酸涂层的多孔羟基磷灰石负载软骨细胞移植修复兔关节软骨缺损

目的　研究复合材料负载软骨细胞修复兔关节软骨缺损。方法　把软骨细胞种植到聚乳酸 (PLA)涂层的多孔羟基磷灰石 (HA)表面 ,培养 2周后 ,移植软骨细胞 载体的复合体修复兔膝关节股骨髁的软骨缺损 (直径约 5mm ,深约 2 .5mm ,达钙化层 )。然后对缺损的修复情况在移植后进行大体、光镜评估和电镜观察。另外对兔膝关节正常的软骨和移植后 12周缺损处的修复软骨进行胶原量的测定。结果　移植的软骨细胞能在复合材料上良好地生长 ,形成透明软骨 ,软骨缺损被修复。无细胞移植的对照组仅纤维修复。另外 ,多孔HA在修复过程中充当了软骨下骨的临时替代。胶原量的测定显示移植 12周后的修复软骨胶原量约 44 .6 9% ,自身正常的软骨胶原量约为 5 4.74% ,两者差异有统计学意义。结论　PLA涂层的多孔HA负载软骨细胞移植能以透明软骨的方式成功修复兔膝股骨髁软骨缺损。软骨细胞不成熟导致胶原量的差异有统计学意义。