二甲氨基偶氮苯诱发大白鼠肝癌形成过程中染色质非组蛋白变化的观察

前 言 真核细胞的染色质由三种主要成分组成:DNA,蛋白质和少量RNA。DNA是生物遗传的物质基础,基因是DNA的一个节段。高等动物体内各种细胞的功能各异,即使是同一类细胞,在其生命周期的不同阶段,亦可有不同的功能表现,基本问题是在于染色质中基因的表达不同。染色质的蛋白质分为两类,即组蛋白与非组蛋白(NHCP)。近十余年来许多研究工作表明,非组蛋白对基因表达的调控起重要的作用。非组蛋白是一类非均一性蛋白质,包含有各种复杂的酶系统,有些非组蛋白具有结构和调节作用。WangTung-Yue曾指出,非组蛋白能够影响基因的转录。他向含有纯化的DNA和RNA聚     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.     

癌细胞染色质的结构和基因表达(二)

三、染色质活性与基因调控在前几节中主要对染色质的结构进行了探讨。这一节中重点是探讨染色质有什么样的功能。大多数细胞的染色质,不仅仅是一个遗传信息的固定储藏所,而在其中还发生着转录、复制、重组、和修复等各种动态过程。这些过程发生的速率和频率有很大的不同。目前对其控制的机制还了解甚少。 (一)染色质的转录在染色质的一部分DNA中,似乎包含     

不同启动子和MAR组合对重组CHO细胞转基因表达的影响

目的 分析不同启动子与核基质结合区（MAR）组合对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中转基因表达的影响。方法 将β-珠蛋白MAR(gMAR)与人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、猿猴空泡病毒40（SV40）启动子组合,构建两种不同启动子与gMAR组合的表达载体。转染CHO细胞,48 h后观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的瞬时表达情况;G418筛选稳定转化的细胞株,流式细胞术分析稳定CHO细胞eGFP基因的表达水平,实时荧光定量PCR（qPCR）分析eGFP基因的相对拷贝数。结果 不含gMAR的表达载体,CMV-IE启动子eGFP表达明显强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子eGFP表达水平,但在SV40启动子中并未表现出提高作用。两侧含gMAR的表达载体比一侧含有gMAR的表达载体CMV-IE启动子eGFP表达荧光强;G418加压筛选后,含SV40启动子的gMAR表达载体eGFP基因表达不稳定,荧光逐渐减弱,因此,后期只对稳定表达eGFP基因的CMV-IE启动子表达载体进行流式细胞术和qPCR分析。流式细胞术检测结果显示,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因表达量比不含gMAR的表达载体分别提高9.85倍和12.94倍;qPCR结果显示,以不含gMAR的载体的eGFP基因拷贝数为1,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因相对拷贝数为3.68和9.25。结论 CMV-IE启动子活性强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子外源基因的表达水平,其机制可能与增加基因拷贝数相关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子／增强子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法：以重组质粒pcDNA3-core（含有HCV核心蛋白编码基因）转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β－半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子／增强子功能的影响。结果：质粒pcDNA3-core在HepG2 细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β－半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5．4倍。结论：HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子／增强子的特性,为进一步以差异显示逆转聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础。     

P~(53)基因与肿瘤的研究进展

自1979年Lane和Crawford用免疫方法首次从SV—40感染的小鼠细胞中检出能与SV—40T抗原相结合的P~(53)蛋白以来,引起了许多学者的浓厚兴趣。P~(53)基因具有抑制细胞恶性转化的作用,本文简述P~(53)基因与肿瘤的发生、诊断及治疗的研究进展。     

转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化

目的 用人珠蛋白转基因鼠模型建立染色质构象捕获的技术体系,探讨人α类珠蛋白基因簇的染色质构象变化与基因表达调控的关系。方法 使人α类珠蛋白转基因纯合子公鼠与KM母鼠交配,从怀孕14．5d的母鼠体内取出珠蛋白基因表达组织胎肝和非表达组织胎脑细胞,用甲醛交联固定细胞核内的染色质构象,限制性内切酶Nco Ⅰ消化后用T4DNA连接酶连接,解交联后提取并纯化连接的基因组DNA,在连接位点的两侧设计引物,用半定量PCR分析胎肝和胎脑中人α类珠蛋白基因簇染色质构象模式。结果以含HS40的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,表达的珠蛋白基因α2、α1的酶切片段与其交联效率明显高于胎脑,含有已关闭珠蛋白基因ζ的酶切片段与其交联效率与胎脑相当。以含α2的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,上游调控元件HS40和33与其交联效率明显高于胎脑;HS10和8与其交联效率略低于胎脑。结论 在表达组织中,人α类珠蛋白基因簇上游远端调控元件通过形成染色质环与下游表达基因靠近,从而调控α类珠蛋白基因的表达;而在非表达组织中,无此染色质环形成。     

SV_(40)LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源

目的制备并初步评估一种理想的肝细胞来源—SV40LT抗原基因永生化肝细胞。方法将SV40LT抗原基因在逆转录病毒介导下转入原代培养的大鼠肝细胞,获得能在体外增殖的肝细胞。通过绘制生长曲线了解转染肝细胞的体外生长特性,细胞冻存复苏试验评估转染肝细胞的冻存价值并与原代肝细胞和大鼠肝癌细胞CBRH7919比较。结果SV40LT抗原基因转入原代培养的大鼠肝细胞能在体外增殖。SV40LT抗原基因转染肝细胞比原代肝细胞生长速度快(P<0.05),与肿瘤细胞相比生长曲线差异无显著性(P>0.05)。复苏后冻存的SV40LT抗原转染的肝细胞的细胞活率为(74±4)%,原代肝细胞的细胞活率为(72±6)%。两者差异无显著性(P>0.05)。结论肝细胞经SV40LT抗原基因转染后获得永生化特性,冻存复苏后获得满意的细胞活率,是一种理想的肝细胞来源。     

染色质免疫沉淀分析胰岛β细胞中TCF7L2与GPR40的结合

目的探讨转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子的相互作用。方法采用染色质免疫沉淀(CHIP)技术,在胰岛βTC6细胞株中,用TCF7L2特异性抗体沉淀DNA,聚合酶联式反应(PCR)检测GPR40基因5′特异性序列。结果在TCF7L2特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中,扩增出GPR40基因5′特异性序列。结论在胰岛βTC6细胞中,转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子存在特异的结合区域,TCF7L2可能参与GPR40的表达调控。     

DNA甲基化与肿瘤

DNA甲基化是最早发现的基因修饰途径之一,可引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,控制基因表达。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变,DNA甲基化在肿瘤的发生发展中的作用是当前的研究热点。     

SIRT1与糖尿病

SIRT2(silent information regulator 2)在芽殖酵母(S.cerevasiae)的基因转录研究中首次被发现,是一种广泛存在于各物种的基因,在转录沉默、染色质稳态、DNA损伤后修复、延长细胞周期中起着重要的作用[1],其酶具有蛋白去乙酰化活性.     

地高辛标记探针原位杂交法检测人脑胶质瘤组织猴病毒40的表达

目的 :检测猴病毒 40 (SV40 )DNA在人脑胶质瘤中的定位表达 ,探讨其在脑胶质瘤发生发展中的生物学意义。方法 :采用地高辛标记探针原位杂交技术 ,检测 2 5 6例人脑胶质瘤和 11例正常脑组织标本。结果 :SV40DNA定位于胶质瘤细胞核 ,阳性细胞呈弥漫性或局灶性分布 ;SV40DNA阳性率 40 .6 % (10 4/2 5 6 ) ,正常脑组织均未检测出SV40DNA ;SV40DNA阳性率与病理分级无关 (P >0 .0 5 )。结论 :SV40感染与人脑胶质瘤病因学密切相关 ;地高辛标记探针原位杂交技术 ,是探讨SV40病毒核酸在组织中定位、分布和感染机制的一种新的特异性方法。     

入hsp90p基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系.方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Jurkat细胞内的活性和非活性染色质,然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人hsp90β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Northern印迹杂交的方法研究热休克诱导下的hsp90β mRNA表达.结果发现热休克诱导使细胞内人hsp90β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的hsp90βmRNA表达水平一致.结论首次证实人hsp90β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控,为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型.     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

腺病毒DNA对肝细胞系的转化活性的研究

用含有腺病毒EIA和EIB基因的DNA片段对一株由猴病毒40(SV_(40))转化的大鼠肝细胞系——CWSV-1细胞进行了转化实验,以了解腺病毒基因和SV_(40)DNA之间的关系。我们的结论是:(1)腺病毒DNA能转化CWSV-1细胞;(2)建立的NP细胞呈重叠生长趋势,当细胞复盖培养基达60％左右时,大部份细胞自行脱落,但细胞形态没有明显改变;(3)形成的NP细胞系大部份不再分泌可检测的白蛋白,少量细胞分泌白蛋白的能力也随着传代而消失。     

克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析

目的:克隆猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)增强子序列,修饰人乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因核心启动子,并分析其活性.方法:PCR扩增SV40增强子序列并测序鉴定,酶切连接插入到pEGFP-HPSEp中指定克隆位点构建重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh.将原质粒、重组质粒和阳性对照质粒分别转染肝癌细胞(HepG2)、喉癌上皮细胞(Hep2)和慢性白血病细胞(K562).荧光显微镜观察和流式细胞术分析各质粒促转录活性.结果:扩增的SV40增强子序列长度为237 bp,序列分析与GeneBank收录一致.重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh经酶切和测序鉴定与预期结果一致,SV40增强子序列插入到指定克隆位点.荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-HPSEp-SV40enh的HepG2、Hep2和K562细胞均有较强荧光表达;转染pEGFP-HPSEp的细胞荧光强度均较弱.流式细胞术检测表明,pEGFP-HPSEp-SV40enh在HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.7%、6.0%和5.5%,pEGFP-HPSEp转染率分别为4.8%、13.4%和7.7%,两者比值均小于1.结论:成功克隆了SV40增强子序列并构建了重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh,SV40增强子可以初步提高HPSE启动子的活性.     

基因工程的概念

基因工程(geneticengineering),也叫基因操作、遗传工程,或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中,并使之无性繁殖(称之为“克隆”)和行使正常功能(称之为“表达”),从而创造生物新品种或新物种的     

癌与致癌变的染色体

已知DNA和RNA肿瘤病毒将其基因并入宿主细胞,但并入并非均使细胞成为癌细胞。或许,细胞机制决定着病毒基因转变一个细胞成为一个癌细胞,转变的实现可能系依赖于一种致癌变的染色体(trai-torous chromosome)。威斯塔解剖学与生物学学院的卡洛M·克罗斯,安东尼J·吉拉德和希拉罗·科普罗夭斯基在1976年第12期“美国国家科学院院报”上报告了癌症病毒的显现取决于一种特殊的染色体的首次证据。他们将鼠细胞和感染了“SV40”癌病毒的人细胞进行杂交。当杂交细胞中存留有人类染色体C—7时,就同时并有     

染色质结构和基因活性

细胞内基因表现的调节是生物体的个体发育和生命活动的基础。真核细胞内积聚大量遗传信息,即使间期核内也只有小部分染色质表现基因活性。这种活性染色质具有特殊的空间构形,其中包括所有细胞必具的看家基因,以及各种特化细胞所表现的专一基因的活性,都受特殊顺序和调节因素的控制。因此,染色质