感觉性和运动性神经膜细胞的培养研究

目的 对感觉性和运动性神经来源的神经膜细胞进行培养和鉴定，并通过神经生长因子(NGF)的表达间接地研究两种细胞的差别，探讨对神经特异性再生的影响。方法 立体显微镜下对SD乳鼠后根神经和股神经运动支进行取材，经2．5g／L胰蛋白酶 0．3g／L1V型胶原酶联合消化，用高糖型DMEM／F12(含100g／LCS)对感觉神经源性和运动神经源性的神经膜细胞进行培养，并经抗S100荧光组织化学染色鉴定。双抗体夹心间接ELISA法测量两种神经膜细胞培养基中NGF的表达。结果 培养的两种神经膜细胞经荧光染色证明均为神经膜细胞，光镜观察并手工计数显示两种细胞纯度均超过95％，未见形态学差异，但NGF的表达量和表达模式差异均有显著性意义(F=45．368l，P=0．000)。结论 本实验方法可以获得高纯度的感觉性和运动性神经源性神经膜细胞，两者的生物学功能有差异。     

骨髓间充质干细胞表达神经营养因子及对神经干细胞的保护作用

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）表达脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）以及BMSC条件培养液对神经干细胞的保护作用。方法 取大鼠骨髓培养BMSC，用CD44、CD45和CD71免疫细胞化学染色进行鉴定。提取BMSCmRNA，RT-PCR检测BDNF和NGF表达，ELISA检测BMSC培养液中BDNF和NGF的含量。原代取材培养新生大鼠皮质神经干细胞，nestin染色鉴定。用不同比例的BMSC条件培养液培养神经干细胞24h后，热休克诱导凋亡，流式细胞仪检测凋亡细胞比率。结果 BMSC贴壁生长，免疫细胞化学染色CD44和CD71阳性表达．CD45阴性表达。BMSC表达BDNF和NGFmRNA，BMSC培养液中含有BDNF和NGF；随培养时间的延长，培养液中BDNF和NGF的浓度增加。BMSC条件培养液可以减少热休克诱导的神经干细胞凋亡比率．并且BMSC条件培养液浓度高者有更好的保护作用。结论 BMSC表达神经营养因子BDNF和NGF，对神绎千细朐凋亡有保护作用．     

胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。     

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景:调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供.方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 pm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养.传代的神经干细胞分成4组:空白对照组加入含体积分数为10%胎生血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 pg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 μg/L脑源性神经营养因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 μg/L脑源性神经营养因子,培养1周.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例.结果:单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.与空白对照组比较.碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t=3.409～7.558,P<0.05),且联合组升高幅度尤为显著.结论:适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用.     

脑源性神经营养因子促进低血糖幼鼠海马神经干细胞的定向分化

背景：有研究表明脑源性神经营养因子可以维持神经元的存活、影响神经元的迁移,在体外可以促进神经干细胞的存活和分化。目的：探讨脑源性神经营养因子对低血糖幼鼠海马神经干细胞定向分化的作用。方法：取新生1d低血糖模型大鼠脑海马组织进行原代、传代及单细胞克隆培养。培养的细胞一部分进行神经干细胞鉴定,另一部分依据培养液中脑源性神经营养因子质量浓度的不同将单克隆细胞分为0,100,200μg/L组,取第4代细胞进行诱导分化,行神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色,计数阳性细胞比例。结果与结论：单克隆培养后3组细胞均呈巢蛋白阳性,诱导分化后细胞呈行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性;100,200μg/L组神经干细胞生长较快,且分化为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞比例较高（P〈0.05）,但两组神经干细胞之间差异无显著性意义（P〉0.05）。提示脑源性神经营养因子促进低血糖幼鼠海马神经干细胞向神经元定向分化。     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12 2?7 20μg/L表皮生长因子 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.     

脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ促进神经干细胞向神经元定向分化的作用差异

目的:选用脑源性神经营养因子及胰岛素样生长因子Ⅰ作为诱导分化剂,观察其对神经干细胞定向分化的作用及其效应差异。方法:实验于2004-12/2005-10在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。以无血清培养法从孕14～17d的胚胎大鼠脑组织分离培养获得神经干细胞后,分别加入20μg/L脑源性神经营养因子,20μg/L胰岛素样生长因子以及20μg/L脑源性神经营养因子 20μg/L胰岛素样生长因子诱导其定向分化。微管相关蛋白2抗体来鉴定所获得的神经元,流式细胞仪检测计数神经元的分化比例。结果:①原代培养获得了Nestin染色阳性的神经干细胞。②干细胞经诱导分化后,各组均获得了微管相关蛋白2染色阳性神经元。③脑源性神经营养因子组,胰岛素样生长因子Ⅰ组和脑源性神经营养因子 胰岛素样生长因子Ⅰ组及对照组(体积分数为0.01的胎牛血清)诱导分化后,流式细胞仪计数神经元的分化比例为47.8%,57.78%,61.94%和32.69%,三个实验组与对照组差异显著(P<0.05),而胰岛素样生长因子Ⅰ组与脑源性神经营养因子 胰岛素样生长因子Ⅰ组间差异无显著性(P>0.05)。结论:神经干细胞具有多向分化潜能,脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ均能促进神经干细胞向神经元定向分化,但两者无明显的协同作用。     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景:传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制. 目的:拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞.方法:抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及鸶茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力.取传至4～6代的大鼠骨髓间充质千细胞.加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定. 结果与结论:P5骨髓间充质千细胞(91.5±3.1)%处于G1期.高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节.骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达.表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞:在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力.     

人脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的能力及可塑性

目的:脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞并表达神经元信号已有报道.实验拟观察人脂肪组织源性干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的可能性.方法:实验于2003-09/2005-06在沈阳脑科医院试验中心完成.腹部脂肪由沈阳市第一医院普外科提供,患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.提取人脂肪组织分离、原代培养、扩增脂肪组织源性干细胞,以免疫荧光化学染色方法鉴定细胞CD44,CD114,CD34的表达.取第二、三代细胞以PBS缓冲液冲洗后,用含有丁酸酯羟基茴香醚、KCL、丙戊酸、地塞米松、胰岛素的培养液诱导向神经细胞分化,采用免疫荧光化学染色方法鉴定神经元特异性烯醇化酶.结果:原代培养的脂肪组织源性干细胞为梭形散在细胞,培养至7 d左右细胞接近融合.荧光倒置显微镜下观察经免疫荧光染色,96.7%细胞呈CD44阳性, CD114抗体、CD34抗体呈阴性.神经元特异性烯醇化酶免疫荧光鉴定可见诱导后细胞出现类似轴突和树突样结构,有类神经元间网络形成,表达神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶.结论:人脂肪组织源性干细胞可在体外扩增,在一定培养条件下,有分化为神经元样细胞的能力.     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

坐骨神经瓦勒变性大鼠许旺细胞生物学特性及分泌功能变化

背景：研究表明外周神经损伤后,许旺细胞在基底膜管内形成Bunger带,引导再生轴突延伸,但具体作用机制目前尚不清楚。目的：观察大鼠坐骨神经损伤后瓦勒变性对许旺细胞生物学特性及分泌功能的影响。方法：建立大鼠坐骨神经横切模型,分为坐骨神经瓦勒变性组（坐骨神经横断组）和手术对照组。采用神经段单酶消化法分离培养许旺细胞,光镜下观察细胞形态变化,S-100免疫荧光鉴定。取第1代许旺细胞,利用计数法绘制14 d内许旺细胞的生长曲线,MTT法检测14 d内许旺细胞增殖活性,酸性磷酸酶法检测许旺细胞黏附能力,ELISA法检测神经生长因子浓度。结果与结论：坐骨神经段培养第14天,坐骨神经横断组神经段边缘可见大量许旺细胞,呈线形排列;手术对照组许旺细胞数量少,呈散在分布,两组许旺细胞S-100均呈阳性表达。许旺细胞传代培养第3天,两组许旺细胞均进入对数增长期,随时间延长,细胞数及细胞增殖吸光度值均呈上升趋势,坐骨神经横断组细胞数及增殖吸光度值明显高于手术对照组（P〈0.05）;坐骨神经横断组许旺细胞黏附能力明显高于手术对照组（P〈0.05）;ELISA 法检测示,坐骨神经横断组神经生长因子浓度在培养第4,6,8,10,12,14天时均高于手术对照组（P〈0.05）。结果表明大鼠坐骨神经损伤后两三周,瓦勒变性对许旺细胞生物学功能具有显著影响,可诱导许旺细胞幼稚化,促使许旺细胞在短期内迅速分裂增殖,并分泌大量神经营养因子及细胞外黏附成分,为再生轴突的延伸提供适宜的神经微环境;并增加细胞黏附能力,为外周神经损伤修复提供适宜的神经微环境。     

许旺细胞的体外培养提纯

许旺细胞是组织工程修复神经损伤的种子细胞,能否获得大量且高纯度的许旺细胞对于组织工程学至关重要.许旺细胞的培养纯化技术日趋完善,其经典的培养方法有植块法和酶消化法,在此基础上改进的去除成纤维细胞的方法有差速贴壁法、免疫选择法、阿糖胞苷补充法、刺激因子增殖法等.最近比较新的提纯方法有磁性活细胞分离法、层粘连蛋白纯化法、三维支架联合培养法.另外还有一些因子,如胎牛血清浓度等影响许旺细胞的扩增.这些技术的主要目的就是在体外获得大量的高纯度许旺细胞,以满足组织工程修复神经的需要.许旺细胞的体外培养和提纯方法众多,且已取得初步进展,但在此技术完全成熟之前尚还有许多问题有待解决,如周期长、细胞活性低、在传代培养中细胞生物学特性不稳定等.     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

神经生长因子和神经碎片套管对修复损伤神经的实验研究

目的探讨富含神经生长因子（NGF）和神经碎片的生物套管在周围神经损伤再生修复过程中的作用。 方法建立动物模型,将SD大鼠随机分成4组,分别为A对照组、B自体神经外膜小间隙吻合单纯添加自体神经碎片组、C自体神经外膜小间隙吻合同时添加NGF和自体神经碎片组、D生物套管吻合同时添加NGF和自体神经碎片组;观察各组一般形态、显微镜下吻合口处神经恢复形态以及组织学表现。采用方差分析比较各组有髓神经纤维数、施旺细胞数以及运动神经传导速度（MNCV）值的组间差异,组间的两两比较采用LSD-t检验。 结果（1）A组大鼠在第8周时足底溃疡出现明显自愈,右下肢开始出现自主活动,部分足底溃疡的大鼠在第12周时仍未出现明显的自愈,右下肢无活动;其余实验组出现右下肢足底溃疡的大鼠在第8周时出现明显的自愈,并且右下肢表现出自主活动。第12周时A组大鼠右下肢足趾仍然呈挛缩状态,不能自由活动,而其余3组右下肢足趾大部分恢复自主活动。（2）纵切面见B组、C组、D组所构建的小间隙管腔内均可见到再生神经纤维。第12周时,A组有髓神经纤维数目为（22.30±4.66）根／400视野,B组有髓神经纤维数目为（51.60±4.45）根/400视野,C组有髓神经纤维数目为（56.20±4.66）根/400视野,D组有髓神经纤维数目为（59.20±5.81）根/400视野,组间差异具有统计学意义（F=298.48,P<0.001）;抗S-100染色单位视野下,A组施旺细胞数目为（16.00±2.24）根/400视野,B组施旺细胞数目为（21.00±3.40）根/400视野,C组施旺细胞数目为（30.20±3.03）根/400视野,D组施旺细胞数目为（34.80±3.35）根/400视野,组间差异具有统计学意义（F=197.63,P<0.001）。术后第12周时,A组MNCV值为（7.57±1.79）m/s,B组MNCV值为（11.49±1.12）m/s,C组MNCV值为（13.86±2.03）m/s,D组MNCV值为（20.16±2.48）m/s,组间比较差异具有统计学意义（F=188.80,P<0.001）。D组对周围神经损伤的修复后的有髓神经纤维数目、施旺细胞数目以及MNCV均具有明显优势,与A组、B组、C组比较,差异均具有统计学意义（t=26.55、5.45、2.15,P<0.001、<0.001、=0.034;t=21.87、16.05、5.35,P均<0.001;t=23.19、15.97、11.60,P均<0.001）。 结论本实验证实自体神经碎片与NGF的联合应用,明显提高周围神经再生微环境中神经损伤修复效果。     

牙种植体与许旺细胞联合培养时脑源性神经营养因子及神经生长因子mRNA的表达

背景：许旺细胞很可能是促进骨整合种植牙周围神经再生的有效因子。目的：观察许旺细胞与牙种植体复合培养时脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达,分析牙种植体与许旺细胞的相容性。方法：取成年犬发生Wallerian变性的坐骨神经,用酶消化法和差速贴壁法相结合培养许旺细胞,以1×108L^-1浓度接种于喷钛砂酸蚀的牙种植体表面和培养皿。分别在细胞培养的第1,3,6,8,11天,以反转录-聚合酶链反应检测许旺细胞中脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达。结果与结论：许旺细胞与牙种植体复合培养时,脑源性神经营养因子与神经生长因子的表达趋势与许旺细胞单独培养时相同,呈单峰型;但两种基因的表达水平高于许旺细胞单独培养组,且达到表达峰值的时间较早。提示喷钛砂酸蚀表面的牙种植体能够促进许旺细胞的基因表达,两者具有良好的相容性。     

牙种植体与许旺细胞联合培养时脑源性神经营养因子及神经生长因子mRNA的表达

背景:许旺细胞很可能是促进骨整合种植牙周围神经再生的有效因子。目的:观察许旺细胞与牙种植体复合培养时脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达,分析牙种植体与许旺细胞的相容性。方法:取成年犬发生Wallerian变性的坐骨神经,用酶消化法和差速贴壁法相结合培养许旺细胞,以1×108L-1浓度接种于喷钛砂酸蚀的牙种植体表面和培养皿。分别在细胞培养的第1,3,6,8,11天,以反转录-聚合酶链反应检测许旺细胞中脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达。结果与结论:许旺细胞与牙种植体复合培养时,脑源性神经营养因子与神经生长因子的表达趋势与许旺细胞单独培养时相同,呈单峰型;但两种基因的表达水平高于许旺细胞单独培养组,且达到表达峰值的时间较早。提示喷钛砂酸蚀表面的牙种植体能够促进许旺细胞的基因表达,两者具有良好的相容性。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义（P〉0.05）。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

吡咯喹啉醌对许旺细胞增殖及Sox10表达的影响

背景：许旺细胞是神经组织工程的种子细胞,但其体外增殖缓慢,难以满足科研与临床对其的需要,而吡咯喹啉醌可以对多种细胞的增殖产生促进作用。目的：观察吡咯喹啉醌对许旺细胞的增殖作用并探讨其对许旺细胞Sox10基因表达的影响。方法：体外培养及纯化大鼠许旺细胞,S-100免疫荧光鉴定许旺细胞;细胞经无血清培养12h后,加入10nmol/L吡咯喹啉醌继续培养24h观察其形态学改变;加入不同浓度（0,1,10,100,1000,10000nmol/L）吡咯喹啉醌于许旺细胞培养24h,利用RT-PCR技术检测Sox10的mRNA表达。结果与结论：吡咯喹啉醌促使许旺细胞发生形态学改变,多数呈束状或并排生长,且细胞数目增多;1~1000nmol/L吡咯喹啉醌可使许旺细胞Sox10mRNA表达增高,100nmol/L时表达最高;10000nmol/L时对Sox10的表达表现为抑制作用（P〈0.05）。     

人胚雪旺细胞组织工程神经修复坐骨神经缺损的实验研究

目的：探索人胚雪旺细胞作为组织工程的种子细胞修复周围神经缺损的可行性。方法：通过组织工程方法用PLGA导管和polyglactin 910纤维负载人胚雪旺细胞预先构置好人工神经，然后用于修复大鼠20mm的坐骨神经缺损，并与神经切断后原位缝合以及用单纯的PLGA导管进行修复的实验组进行对照。通过活体肢体功能观察、靶器官肌肉测量、电生理检测、辣根过氧化物酶示踪、连续组织切片图像分析以及透射电镜等检查神经再生情况。结果：人工神经修复组神经再生良好，效果接近于神经原位缝合组，明显优于单纯的PLGA导管修复组。结论：人胚雪旺细胞构建的人工神经可以修复20mm的周围神经缺损。