骨髓间充质干细胞神经营养因子的表达及对脊髓神经元的保护作用

研究骨髓间充质干细胞（BMSC）表达脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF），以及BMSC条件培养液对脊髓神经元的保护作用，探讨BMSC冶疗脊髓损伤的机制，为BMSC的临床应用提供依据和指导。方法：取大鼠骨髓培养BMSC，用CD44、CD45和CD71免疫细胞化学染色进行鉴定。提取BMSC mRNA，RT-PCR检测BDNF和NGF表达．ELISA检测BMSC培养液中BDNF和NGF的含量。原代取材培养大鼠脊髓神经元，10d后用不同比例的BMSC条件培养液培养24h，热休克诱导神经元凋亡，流式细胞仪检测凋亡细胞比率。结果：BMSC贴壁生长，免疫细胞化学染色CD44（＋）、CD45（-）和CD71（＋）。BMSC表达BDNF和NGF mRNA，BMSC培养液中含有BDNF和NGF，随培养时间的延长培养液中BDNF和NGF的含量增加。BMSC条件培养液可以减少热休克诱导的脊髓神经元凋亡的比率．并且BMSC条件培养液含量高者有更好的保护作用。结论：BMSC表达神经营养因子BDNF和NGF．对损伤脊髓神经元有保护作用。     

脑源性神经营养因子基因修饰人骨髓间充质干细胞有限细胞系的建立

目的：建立脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞系。方法：实验于2004—02／2005—06在解放军军事医学科学院干细胞研究中心完成。人类骨髓细胞来源于解放军三О七医院骨髓移植治疗的6名健康成年骨髓供者，男3名，女3名，年龄25-45岁。常规分离培养人骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面分子CD34、CD44、CD45，采用重组逆转录病毒载体将脑源性神经营养因子基因转入人骨髓间充质干细胞。检测脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的增殖特性，细胞内脑源性神经营养因子的蛋白表达，细胞培养液中脑源性神经营养因子含量，以及PCR检测脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞中外源性脑源性神经营养因子基因DNA。结果：①人工分离培养出的骨髓间充质干细胞，形态、大小一致，呈长梭型或长多边形，从P0至P20基本保持一致，P2代骨髓间充质干细胞表达基质细胞表面标志CD44，不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45。②反转录病毒感染骨髓间充质干细胞的感染效率约为10％，修饰后形成的脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞在形态上始终保持一致，与骨髓间充质干细胞几乎完全一样，生长速率与未经基因修饰的骨髓间充质干细胞基本相同，培养10代后细胞停止分裂，免疫细胞化学染色显示脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞的脑源性神经营养因子阳性率超过98％，培养72h后培养基中脑源性神经营养因子的含量较之骨髓间充质干细胞提高约20000倍。③PCR对脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞基因组DNA进行扩增，得到外源性脑源性神经营养因子条带。结论：利用反转录病毒载体进行基因修饰得到了稳定的脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞有限细胞系，为基因治疗提供了一种以多潜能成体干细胞为载体的种子细胞。     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景:传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制. 目的:拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞.方法:抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及鸶茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力.取传至4～6代的大鼠骨髓间充质千细胞.加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定. 结果与结论:P5骨髓间充质千细胞(91.5±3.1)%处于G1期.高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节.骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达.表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞:在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力.     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化神经细胞的实验研究

目的探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性，为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法无菌取成熟大鼠长骨骨髓，密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞，在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞，通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定。结果骨髓基质细胞能在神经干细胞条件培养基中增殖、分化，表达巢蛋白抗体抗原，在适宜诱导分化因子及条件下进一步分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经细胞特异性核蛋白抗体抗原表达阳性。结论在适宜培养条件及诱导因子联合作用下，骨髓基质细胞可成功诱导出神经元样细胞。     

猫骨髓源神经干细胞的诱导分化

目的 观察家猫骨髓源巢蛋白阳性细胞诱导分化情况，为家猫骨髓基质细胞（BMSC）作为自体神经干细胞种子细胞提供理论依据。方法 抽取家猫的骨髓。从中分离得到骨髓基质细胞，在体外给予神经干细胞培养基培养增殖，然后用分化诱导因子进行诱导分化，倒置相关显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果 猫骨髓基质细胞在体外培养中体型增大，继之出芽，贴壁生长，可形成克隆团，同时可传代培养，这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原巢蛋白，与5-溴尿嘧啶（BrdU）共培养3d后可见部分大圆形细胞BrdU染色阳性，这些细胞经进一步的诱导可分化为神经元样细胞，而且表达神经元特异性抗原NSE和NeuN。结论 家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征，可诱导为巢蛋白阳性细胞，并可进一步分化为表达烯醇化酶（NSE）和NeuN的神经元样细胞。证实家猫BMSC可作为移植修复神经系统损伤的神经干细胞种子细胞。     

脑源性神经营养因子基因修饰人骨髓间充质干细胞有限细胞系的建立

目的:建立脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞系。方法:实验于2004-02/2005-06在解放军军事医学科学院干细胞研究中心完成。人类骨髓细胞来源于解放军三○七医院骨髓移植治疗的6名健康成年骨髓供者,男3名,女3名,年龄25～45岁。常规分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面分子CD34、CD44、CD45,采用重组逆转录病毒载体将脑源性神经营养因子基因转入人骨髓间充质干细胞。检测脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的增殖特性,细胞内脑源性神经营养因子的蛋白表达,细胞培养液中脑源性神经营养因子含量,以及PCR检测脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞中外源性脑源性神经营养因子基因DNA。结果:①人工分离培养出的骨髓间充质干细胞,形态、大小一致,呈长梭型或长多边形,从P0至P20基本保持一致,P2代骨髓间充质干细胞表达基质细胞表面标志CD44,不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45。②反转录病毒感染骨髓间充质干细胞的感染效率约为10%,修饰后形成的脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞在形态上始终保持一致,与骨髓间充质干细胞几乎完全一样,生长速率与未经基因修饰的骨髓间充质干细胞基本相同,培养10代后细胞停止分裂,免疫细胞化学染色显示脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞的脑源性神经营养因子阳性率超过98%,培养72h后培养基中脑源性神经营养因子的含量较之骨髓间充质干细胞提高约20000倍。③PCR对脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞基因组DNA进行扩增,得到外源性脑源性神经营养因子条带。结论:利用反转录病毒载体进行基因修饰得到了稳定的脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞有限细胞系,为基因治疗提供了一种以多潜能成体干细胞为载体的种子细胞。     

GAP-43在骨髓问充质干细胞向神经样细胞分化过程中表达的实验研究

目的观察生长相关蛋白．43（GAP-43）在体外培养的骨髓问充质干细胞（BMSCs）向神经样细胞分化中的表达情况以探讨其在骨髓间充质干细胞定向分化过程中的作用。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，选取第3代细胞，经流式细胞仪检测细胞表面标志物进行鉴定，并分别应用化学诱导剂B巯基乙醇（BME）和脑源性神经生长因子（BDNF）诱导BMSCs分化，观察诱导后细胞的形态学变化，并应用免疫细胞化学方法对诱导后的细胞进行鉴定、分析生长相关蛋白43、神经巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）的表达情况。应用统计学方法比较两组细胞经诱导后2、4、6、8h GAP-43免疫细胞化学染色阳性率。结果第三代BMSCs经流式细胞仪检测CD90（＋）、CD71（＋）、CD29（＋），CD45（-），经两种方法诱导BMSCs均可分化为神经样细胞，分化后细胞均表达GAP-43、nestin、NSE、NF。诱导后2，4，6，8hGAP-43表达阳性率BME组为77．1％，83．4％，87．O％，82．5％，BDNF组：69．3％，78．1％，82．2％，86．8％。GAP-43随诱导分化时间增加而持续表达，两组问表达阳性率无统计学差异。结论GAP-43在化学诱导剂及生长因子诱导BMSCs分化为神经样细胞过程中持续表达，对于骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化具有重要意义。     

预诱导与全反式维甲酸并脑源性神经营养因子体外诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞可定向诱导分化为神经元样细胞,但目前培养的方法尚不统一.目的:采用预诱导与全反式维甲酸和脑源性神经营养因子为培养体系,拟在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-12/2008-06在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠2只,由新疆医科大学动物试验中心提供.方法:采用贴壁法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,经反复传代细胞逐渐纯化.取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞,按8×107L-1密度接种后,改换含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的神经干细胞培养体系进行预诱导,48 h后去除预诱导液,加入含10 μg/L脑源性神经生长因子、1 μmol/L全反式维甲酸的神经干细胞培养体系定向诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞.以未诱导的骨髓基质干细胞作为对照.主要观察指标:流式细胞仪检测第3代骨髓基质干细胞表面标志的表达,诱导后免疫荧光染色和流式细胞仪检测巢蛋白阳性的表达,免疫荧光染色鉴定神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:第3代骨髓基质干细胞CD29,CD44表达率分别为97.1%,99%,CD45表达率为0.5%,CD34呈阴性表达.预诱导48 h后巢蛋白阳性率为24%,而对照组仅为4.6%.诱导48 h后,巢蛋白染色呈阳性,并可见大量神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现;对照组均呈阴性表达.结论:神经干细胞培养体系联合全反式维甲酸与脑源性神经生长因子,可在体外高效、稳定地诱导骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞,并进一步向神经元和神经胶质细胞方向分化.     

GAP-43在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中表达的实验研究

目的 观察生长相关蛋白-43(GAP-43)在体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经样细胞分化中的表达情况以探讨其在骨髓间充质干细胞定向分化过程中的作用.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,选取第3代细胞,经流式细胞仪检测细胞表面标志物进行鉴定,并分别应用化学诱导剂β巯基乙醇(BME)和脑源性神经生长因子(BDNF)诱导BMSCs分化,观察诱导后细胞的形态学变化,并应用免疫细胞化学方法对诱导后的细胞进行鉴定、分析生长相关蛋白43、神经巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF) 的表达情况.应用统计学方法比较两组细胞经诱导后2、4、6、8 h GAP-43免疫细胞化学染色阳性率.结果 第三代BMSCs经流式细胞仪检测CD90( )、CD71( )、CD29( ),CD45(-),经两种方法诱导BMSCs均可分化为神经样细胞,分化后细胞均表达GAP-43、nestin、NSE、NF.诱导后2,4,6,8 h GAP-43表达阳性率BME组为77.1%,83.4%,87.0%,82.5%,BDNF组:69.3%,78.1%,82.2%,86.8%.GAP-43随诱导分化时间增加而持续表达,两组间表达阳性率无统计学差异.结论 GAP-43在化学诱导剂及生长因子诱导BMSCs分化为神经样细胞过程中持续表达,对于骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化具有重要意义.     

应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化

目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞。方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、表皮生长因子20μg/L、100U/mL青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养。3～5d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞。取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液。②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5d。常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞。对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液。③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率。RT-PCR检测标志性基因的表达。结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24h内聚集成细胞球并悬浮生长。免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多。第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性。当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性。RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达。另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin。②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%。结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞。     

大鼠神经干细胞体外培养条件下GDNF及NGF的分泌特点

目的：探讨体外培养条件下大鼠神经干细胞（NSCs）分泌胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和神经生长因子（NGF）的特点。方法：取SD胎鼠NSCs悬浮培养,光镜观察细胞形态,使用Nestin、微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、半乳糖神经鞘氨醇酶（GalC）免疫荧光法鉴定细胞。培养第3代后使用ELISA法测量其GDNF及NGF分泌量,连续测量6代。结果：光镜下第3代细胞仍保持较多NSCs特征,至第6代,大部分干细胞分化为星形胶质细胞,少部分分化为神经元或少突胶质细胞。第3代细胞GDNF的分泌量较低,但随着培养时间的延长,其分泌量逐渐增高;而第3代细胞NGF的分泌量较高,但其分泌有一个高峰期（第6代）,随后逐渐下降。结论：在体外培养条件下,NSCs干细胞阶段分泌GDNF的能力较低,而分泌NGF的能力较高;进入分化阶段后,分泌GDNF的能力提高,而分泌NGF的能力有所减弱。利用干细胞移植治疗中枢神经系统损伤时应注意时程的选择。     

人脐带源神经干细胞的培养和分化

目的研究诱导人脐带间充质干细胞(hucMSC)分化为神经干细胞样细胞(hucNSC)的方法。方法体外培养hucMSC,流式细胞仪鉴定细胞表型的表达。用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子添加B27诱导,流式细胞学、免疫细胞化学鉴定。用胶质源性神经营养因子(GDNF)、白介素-1β(IL-1β)和全反式维甲酸(ATRA)等诱导分化,免疫组化染色、RT-PCR鉴定。结果hucMSC表达CD105、CD44、CD29。诱导后聚集成细胞球悬浮生长,并不断增殖,流式细胞仪鉴定失去hucMSC的表面标志物特征,而表达Nestin、CD133。再经RA、GDNF、IL-1β诱导,细胞表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和酪氨酸羟化酶。结论hucMSC能分化为具有神经干细胞样生长、增殖、分化特征的细胞。     

神经干细胞研究进展

本文简要叙述了神经干细胞的发现、研究与脑内移植的前因后果关系。回顾了脑内移植的历史。阐述了神经干细胞的特性、作用及应用前景。神经干细胞可由胚胎干细胞分化而来 ,在人脑中存在 ,可以分离、培养 ,己试用于中枢神经系统的某些退行性疾病 ,前景广阔。但也有不少问题尚未解决 ,离临床普遍开展还有一定的时日。     

氯倍他索促进鼻粘膜间充质干细胞成神经样细胞分化

目的:研究氯倍他索(Clo)对鼻粘膜外胚层间充质干细胞(EMSCs)向神经样细胞分化的影响。方法:贴壁筛选法分离培养EMSCs,免疫荧光法鉴定体外扩增的EMSCs;MTT法检测Clo对EMSCs增殖能力的影响;成神经样细胞诱导实验分为Clo组、音猬因子(SHH)组和空白对照组,采用全反式维甲酸(ATRA)诱导各组细胞向神经样细胞分化;倒置显微镜观察细胞形态的变化;免疫荧光和免疫印迹方法检测神经元细胞相关蛋白。结果:体外分离培养的EMSCs高表达间充质干细胞和神经嵴源干细胞标志物Vimentin和Nestin。各组EMSCs成神经样细胞诱导7 d后,Clo组和SHH组EMSCs呈现双极和多极的典型神经样细胞形态并且高表达神经元细胞相关蛋白。Clo组EMSCs表达SHH和SMO的水平明显高于空白对照组,与SHH组比较差异无统计学意义(P0.05);Clo可促进EMSCs分泌内源性脑神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)。结论:Clo可通过激活SHH信号通路和上调内源性神经营养因子水平促进EMSCs向神经样细胞分化。     

pEGFP/A2M(FP6)重组质粒转染小鼠胚胎神经干细胞的实验研究

目的:观察携带pEGFP/A2M(FP6)重组质粒的神经干细胞(NSCs)的生物学特性.方法:培养NSCs,采用Nucleofector转染方法将pEGFP/A2M(FP6)重组质粒转染至NSCs,利用其携带的绿色荧光和RT-PCR观察其转染情况,免疫组织化学法检测A2M(FP6)蛋白表达.结果:Nucleofecto...     

神经干细胞与脊髓脱细胞支架体外共培养的可行性

目的 观察大鼠神经干细胞(NSCs)在脊髓脱细胞支架(SCAS)上黏附、生长和分化情况,评价其构建脊髓组织工程的可行性。 方法 新生Sprague-Dawley大鼠大脑皮质来源NSCs传代培养并鉴定;Sprague-Dawley雌性大鼠脊髓组织改良物理振荡结合化学萃取法制备SCAS,并行基础评估;将第三代NSCs种植在SCAS上,体外共培养,免疫荧光、免疫组化和扫描电镜观察支架上细胞形态。 结果 共培养的细胞为能增殖、分化的NSCs。制备的SCAS孔隙率、含水率、酶解率都明显高于正常脊髓(|t| > 4.679, P < 0.01);SCAS基质结构呈疏松网络状,基质上可见极少量残留细胞核。NSCs在SCAS上黏附、生长良好,可分化为神经元和神经胶质细胞。 结论 制备的SCAS脱细胞较彻底,具有多通道空间结构,适合NSCs黏附、生长和分化,可用于脊髓组织工程。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠神经干细胞移植于损伤脊髓后的迁移和存活

目的观察神经干细胞在体内的迁移和存活。方法体外培养胎鼠脊髓神经干细胞,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体进行转染,以乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)为支架移植入大鼠T9半横断脊髓损伤处。移植后1个月在荧光显微镜下观察神经干细胞在脊髓内的迁移,并计算其存活率。结果神经干细胞表达强烈的绿色荧光。细胞移植后1个月,在损伤脊髓的头端和尾端都可见GFP阳性细胞,计算出的存活率为(1.4911±0.0313)%。结论GFP标记的神经干细胞移植入大鼠损伤脊髓后向脊髓组织内迁移并有少数存活。     

甲泼尼龙抑制神经干细胞并诱导其凋亡的研究

目的：研究甲泼尼龙对体外培养的神经干细胞的直接作用，为有效的结合这两种治疗方法提供依据和指导。方法：体外培养神经干细胞，加入MP培养12h、24h和48h后，用细胞活性检测试剂CCK-8，检测其对神经干细胞活性的影响，用Hoeehst 33258染色观察细胞凋亡，用Annexin V／PI双染色法检测神经干细胞凋亡比率。结果：甲泼尼龙对体外培养的活性有抑制作用，而且可以诱导体外培养的神经干细胞的发生凋亡。结论：甲泼尼龙不利于神经干细胞的生长，不宜在进行甲泼尼龙冲击疗法的同时进行神经干细胞移植。