表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12 2?7 20μg/L表皮生长因子 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.     

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。     

脑源性神经生长因子促进成年大鼠脑海马神经干细胞定向分化的浓度选择

目的：探讨培养基中表皮生长因子与血清两者浓度一定的条件下，不同浓度的脑源性神经生长因子对成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响。 方法：实验于2007—08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料：清洁级雄性成年SD大鼠1只，由中国医科大学实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供：（多实验方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织，剪碎后胰蛋白酶消化，过滤、离心、弃上清，加入含2％B27、20μg／L表皮生长因子、20μg／L碱性成纤维生长因子的DMEM／F12无血清条件培养基体外培养神经干细胞，传至第4代时利用有限稀释法进行单克隆培养，100倍镜下克隆球直径约为200μm时制备单细胞悬液，稀释后滴加于96孔板内，设立两组，全量新鲜培养基组加入刚配置未使用过的DMEM／F12无血清培养基100μL，半量条件培养基组加入上述曾用于神经干细胞培养且含有其代谢产物的1／2DMEM／F12无血清培养基100斗L。（劲实验评估：观察神经干细胞的单克隆培养增殖情况。对克隆球行巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。按培养基中脑源性神经生长因子终浓度的不同将所培养细胞设立0，50，100，150，200μg／L组，各组均加入20μg／L表皮生长因子和体积分数为0．1的胎牛血清，1周后行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色，检测神经干细胞向神经元分化情况。 结果：①神经干细胞单克隆培养结果：单克隆培养开始时神经干细胞增殖缓慢，半量条件培养基组细胞增殖速度快于全量新鲜培养基组，随着细胞数的增多，两组细胞增殖速度也相应加快，分别在培养后第12天、第15天形成直径为200μm的克隆球。②神经干细胞免疫细胞化学染色结果：单克隆培养后克隆球表达巢蛋白，诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性表达：③各组神经干细胞分化为神经元的比例：与0μg／L脑源性神经生长因子组比较，50，100μg／L脑源性神经生长因子组的神经干细胞分化为神经元比例均明显增高（t=2．502～5．025，P〈0．05）；而浓度为150，200μg／L时均无明显变化（t=0．420～1．857，P〉0．05）。 结论：向含有B27、表皮生长因子、碱·性成纤维生长因子的DMEM／F12条件培养基中加入20μg／L表皮生长因子和体积分数为0．1胎牛血清的情况下，脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳浓度为50μg／L。     

水煮十自然腐蚀法制作骨骼标本

制作尸体骨骼标本方法有水煮法[1]、自然腐蚀法[1,2]和药物腐蚀法[3,4]等,其各有利弊.传统水煮法需对煮后骨骼上的肌肉、肌腱、软骨进行剔除,特别是脊椎骨、手脚骨的软组织(肌腱)难以有效剔除,且骨髓腔脂肪消除也难尽如人意,需进行有机溶剂(苯酮、酒精、汽油)长达半年以上时间脱脂,制作骨骼标本用时长;自然腐蚀法虽然操作简便,无需药品和设备等优点,但严重影响周围环境卫生,骨髓腔脂肪也不易消化干净,也须进行脱脂处理,制作骨骼标本用时也较长;药物腐蚀法对骨骼骨质有不同程度的损害,一般多用于防腐固定局解材料骨骼制作.我们经过长期工作探索,将新鲜或防腐固定过的尸体骨骼标本先采用传统水煮处理,拆开各关节骨骼,稍拔除骨骼较大软组织后,放置塑料箱,添加一定量水进行自然腐蚀,取得了满意效果,现将方法介绍如下.     

缺氧对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨单纯性缺氧对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法将36只新生1d大鼠随机均分为N组(正常对照组)、Q2组(缺氧2h组)、Q5组(缺氧5h组)。将海马组织在无血清培养液(均含有碱性成纤维生长因子bFGF、表皮生长因子EGF和白细胞抗原B27)中,分别进行原代培养、单克隆培养和传代培养,单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)和Hoechst33342免疫荧光双标染色;传代培养的细胞传三代诱导分化,诱导分化3d的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Hoechst3342免疫荧光双标染色,计数NSE阳性细胞比例,进行统计学分析。结果单克隆培养的细胞均呈Nestin阳性表达,诱导分化的细胞部分呈NSE或GFAP阳性表达。Q2组、N组、Q5组细胞原代培养克隆球直径达2μm的时间分别为7d、10d、13d。传3代后,对各组细胞进行诱导分化,Q2组细胞诱导分化为神经元的比例明显高于N组,Q5组的细胞诱导分化为神经元的比例明显低于N组。结论短时间缺氧可促进在体海马神经干细胞增殖和诱导其向神经元分化,长时间缺氧则抑制在体神经干细胞增殖和向神经元分化。     

大鼠脊神经前根切断后脊髓内Slit1表达的变化

目的 :探讨脊神经前根损伤后,大鼠脊髓组织中Slit1的表达变化,为进一步研究Slit1在神经再生中的作用提供依据。方法:应用2月龄SD大鼠共100只,体重250±20g,其中80只SD大鼠实施左侧L5及L6脊神经前根切断,分别在伤后1d、3d、7d、14d时处死(每个时间点20只),取L5~L6脊髓节段,标记左右;左侧半L5~L6脊髓节段为实验组;右侧半为自身对照组。假手术大鼠(20只)实施麻醉及暴露L5及L6脊神经手术,未行L5及L6脊神经前根切断术,取其L5~L6脊髓节段为空白对照组。采用免疫组化、Western blotting及RT-PCR法检测大鼠脊髓组织中Slit1的变化。结果:脊神经前根切断后1d、3d、7d、14d,实验组中Slit1阳性细胞数分别为5.78±1.53、15.85±2.65、23.93±1.53、8.78±1.78;自身对照组中分别为2.31±1.63、2.57±1.89、3.20±2.16、3.02±2.15。各时间点实验组中Slit1阳性细胞数显著高于空白对照组(2.89±1.26)及自身对照组(P0.05)。Western blotting示脊神经前根切断后1d、3d、7d、14d,实验组Slit1相对表达量分别为0.326±0.09、0.448±0.05、0.638±0.07、0.304±0.07;自身对照组分别为0.038±0.02、0.038±0.01、0.035±0.02、0.046±0.03。各时间点实验组Slit1相对表达量与空白对照组(0.038±0.03)及自身对照组比较,差异有显著性(P0.05)。RT-PCR示脊神经前根切断后1d、3d、7d、14d,实验组Slit1 m RNA相对量分别为0.380±0.03、0.425±0.04、0.768±0.05、0.605±0.04;自身对照组分别为0.210±0.04、0.265±0.03、0.292±0.02、0.261±0.02。各时间点实验组Slit1 m RNA相对量与空白对照组(0.231±0.03)及自身对照组比较,差异有显著性(P0.05)。结论 :脊神经前根切断后,同侧脊髓灰质前角内Slit1的表达显著增加。     

TRUST试验不宜作为入出境人员梅毒诊断的血清筛查试验

目的控制出入境人员梅毒血清筛查试验的假阴性,提高梅毒感染的诊断水平。方法通过对部分TRUST试验筛查阴性血清样品进行TPPA验证试验,最大限度发现梅毒患者。结果在400份TRUST试验阴性血清样本中,进行TPPA试验,检出4份阳性样品。结论TRUST试验不宜作为入出境人员梅毒诊断的血清学筛查试验,应探讨合适方法加以改进。     

利用防腐固定心脏制作心血管铸型标本

心血管铸型是血管铸型标本制作技术中较常见较复杂的一种,此类文献已见报道[1~3].选材方面多采用新鲜材料灌注铸型,材料来源较局限,难以满足研究工作的需要.笔者在以往采用新鲜心脏为材料制作心血管铸型标本(图1)成功的基础上,探索采用防腐固定的心脏材料进行心血管灌注铸型,经反复实验研究,成功灌注出高质量的心血管铸型标本,取得了满意的实验效果.现将方法介绍如下.     

应用放射造影术进行肝脏数字化及其管道三维重建的研究

目的:探索应用放射造影术进行数字化虚拟肝脏及其管道三维可视化重建研究。方法:采用4例新鲜肝脏标本进行聚乙烯醇-氧化铋造影填充剂管道灌注,经64层螺旋CT无间断连续扫描后,获得肝脏断层图像数据集加以数字化处理,利用Mimics10.01、3D-Doctor、Amkira4.1等电脑软件,构建数字化虚拟肝脏模型及其管道三维可视化重建,并对其各管道进行图像质量评估。结果:(1)4例标本灌注全部满意,管道连续、饱满圆滑、无伪影,构建的数字化肝脏可视模型,其形态逼真,能随意旋转、放大和缩小;肝内管道系统的空间结构与外形的三维关系显示清晰,将肝脏外形与内部管道透明成像显示,可进行虚拟肝切实验;(2)肝内管道显影清晰,肝静脉显示级数为(11.7±0.81),门静脉显示级数为(11.8±0.76),胆管显示级数为(10.1±0.98),肝动脉显示级数为(10.2±0.98);管道三维重建图像质量平均优秀率依次为:96.21%、97.05%、97.63%、97.82%;肝内管道图像平均优秀率为97.18%。结论:应用放射造影术,结合螺旋CT扫描可获得精确完整的肝脏数据资料,构建出理想的数字化虚拟肝脏及管道模型,图像质量高、空间立体感强烈,可进行临床术前虚拟肝切实验及数字化网络教学应用。     

聚乙烯醇水溶胶在解剖学教学标本制作中的应用

目的:探讨聚乙烯醇水溶胶在解剖学教学标本管道灌注和标本表面涂刷中应用的可行性,以期为人体解剖学教学标本制作提供新型材料。方法:采用浓度为6%、8%、10%、12%、14%聚乙烯醇水溶胶,5例前臂材料动脉血管进行灌注,5例已剥制标本进行表面涂刷,经凝胶后,以求得用于血管灌注和标本表面涂刷各自最佳浓度。结果:12%聚乙烯醇水溶胶适用于标本血管灌注,为最佳管道灌注浓度;8%聚乙烯醇水溶胶最适用于标本表面涂刷应用。结论:聚乙烯醇水溶胶是一种理想的适用于人体解剖学教学标本制作的新型材料。