PCR技术检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素基因的实验研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素的PCR方法，以期用于葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法根据文献报道选择金葡菌SEA基因中比较保守的片段设计引物，优化各种工作条件，建立PCR检测方法，并鉴定其敏感性和特异性以及抗杂菌干扰性。扩增片段应用限制性核酸内切酶RsAI消化进行分析。结果所建立的方法敏感性和特异性均较好，有较强的抗杂菌干扰能力。结论应用PCR法检测SEA基因为SEA基因的诊断提供了病因学基础。     

菌液SYBR实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立菌液SYBR荧光PCR法快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的特异基因耐热核酸酶nuc设计引物,PCR方法和SYBR荧光PCR溶解曲线法验证引物的特异性;建立菌液SYBR荧光PCR快速检测方法,奶粉加标实验和菌株特异性实验评价方法的特异性,制备基因组浓度梯度和菌落梯度检验方法的灵敏性。结果利用引物对实验室的3个标准菌株进行PCR扩增,出现的条带均为单一条带,且与目的片段长度一致。16株金黄色葡萄球菌菌株的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,无非特异性扩增。建立的菌液SYBR荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性和灵敏性,灵敏度达1pg／山DNA浓度,并可检测1 CFU／ml的复杂样品。结论本研究建立的菌液SYBR荧光PCR方法快速、特异性好、灵敏性高,对快速检测样品中金黄色葡萄球菌有重要意义。     

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的检测

[摘要]目的 检测临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况。方法 根据Genbank的序列设计合成金黄色葡萄球菌肠毒素基因A-F的引物,采用聚合酶链反应方法对随机收集的124株金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行检测,并进行序列分析。结果 在124株受检的金黄色葡萄球菌中,116株检出肠毒素基因,检出率为93.5%,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株（67.2%）,以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%,7.8%,13.8%。序列分析显示所检出的肠毒素基因与Genbank上登陆的参考序列的同源性为97%～100%。结论 金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因携带率高,其中以携带SEA、SEC、SEF基因为主。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,为进一步研究SEA在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法：PCR方法扩增肠毒素A基因（sea）,构建原核表达载体p ET 30 a/sea,经PCR方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定。蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S8和S 23株的菌体蛋白进行鉴定。结果：pET 30 a/sea重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8和S 23株菌体蛋白验证,证实得到理想的兔抗SEA多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA蛋白在构建的原核表达系统中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。     

PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因

[摘要] 目的 应用mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。方法 对临床分离的84株金黄色葡萄球菌,应用mecA基因PCR扩增法鉴定MRSA,并与苯唑西林纸片扩散法和头孢西丁纸片扩散法进行比较。结果 84株金黄色葡萄球菌中, 41株金黄色葡萄球菌的mecA基因扩增呈阳性,其中有1株表现为对苯唑西林敏感;苯唑西林纸片扩散法检出42株阳性，其中有2株mecA基因呈阴性. 头孢西丁纸片扩散法与PCR扩增法的试验结果完全符合。结论 mecA基因PCR扩增法可以准确、快速判定MRSA。     

三重聚合酶链反应快速诊断耐甲氧西林葡萄球菌感染

目的建立一种能快速有效地对葡萄球菌感染进行病原体诊断的方法.方法利用三重聚合酶链反应技术(Triplex PCR)同时检测葡萄球菌特异性16S rRNA 基因、金黄色葡萄球菌特异性Sa442基因和编码青霉素结合蛋白(PBP2a)的mecA基因.结果 84株葡萄球菌的16S rRNA 基因100%阳性,其中33株金黄色葡萄球菌的Sa442基因100%阳性,mecA基因阳性率为78.8%.51株凝固酶阴性葡萄球菌的Sa442基因100%阴性,mecA基因阳性率为76.5%.30株其他临床常见菌16S rRNA、Sa442、mecA基因100%阴性.结论该技术具有简便、快速、特异性强等特点,是一种非常有效的耐甲氧西林葡萄球菌感染快速诊断方法.     

食品中金黄色葡萄球菌的PCR检测

目的：建立检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法并将PCR方法与传统方法进行比较,评价PCR方法的检测效果。方法：采用PCR方法特异性扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶编码基因（nuc基因）,分别采用PCR方法和国家标准规定的方法检测180份吉林省各地区的抽检食品样品。结果：所检金黄色葡萄球菌在422 bp处出现nuc基因目的片段;食品样品传统方法检出阳性42份,PCR方法检出45份,PCR检测方法与国标法检出阳性率比较,差异无显著性(P>0.05)。结论：PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌较传统方法更快速和简便,且具有较高的特异性和敏感性,可作为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的手段。     

mecA、femA基因PCR联合扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 探讨mecA、femA基因PCR联合扩增快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的敏感性及特异性。方法 用纸片扩散法及mecA、femA基因PCR联合扩增检测178株葡萄球菌中的MRSA，并与琼脂稀释法的结果比较。结果 纸片扩散法筛检MRSA(耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌，MRCNS)的敏感性、特异性分别为94．4％(89．5％)、92．4％(73．7％)。在金黄色葡萄球菌中若以mecA基因阳性为判定MRSA的指标，则敏感性、特异性分别为91．7％、95.5％。在178株葡萄球菌中若以mecA、femA基因阳性作为判定MRSA的指标，特异性提高到97．9％．结论 PCR mecA、femA基因联合扩增既可用于筛检MRSA，又可免去常规生化鉴定，具快速、特异性强的优点。     

多重聚合酶链反应用于检测、鉴定耐甲氧西林葡萄球菌的研究

目的 建立一种快速的多重聚合酶链反应(PCR)方法，用于检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性，同时对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的种进行鉴定。方法 对临床分离的武汉地区金黄色葡萄球菌80株。表皮葡萄球菌70株，其余凝固酶阴性葡萄球菌60株，提取其基因组DNA，针对金黄色葡萄球菌独有的femA基因，表皮葡萄球菌的种特异性序列，决定葡萄球菌对甲氧西林耐药性的mecA基因，和细菌共有的16srRNA基因的保守序列设计四对引物。同时加入PCR体系中对相应片段进行扩增。结果 在210株葡萄球菌中，mecA基因检测结果与苯唑西林敏感试验结果的一致率为96．2％。mecA基因阳性但苯唑西林敏感的5个菌株，通过由低到高浓度的苯唑西林筛选培养后。均表现出耐药性。mecA基因阴性但苯唑西林耐药的3个菌株，经过对阿莫西林-克拉维酸敏感性试验后，被证明是β-内酰胺酶的高产株。结论 此多重PCR方法不仅可以对临床分离葡萄球菌菌株的甲氧西林耐药性作出判断。同时还可以对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌做出种的鉴定，是一种高效、敏感、特异性高的检测技术。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

双重实时荧光PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立

目的:建立一种能快速检测金黄色葡萄球菌,同时能快速鉴别是否具有耐甲氧西林基因的双重实时荧光PCR方法.方法:以金黄色葡萄球菌特异NUC基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,同时针对耐甲氧西林特异MecA基因设计另一对引物和探针;2条探针的5′端标记不同荧光报告基团(FAM和HEX),3′端标记荧光淬灭...     

多重PCR法检测金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因

目的：了解金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法：应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及Py￡基因。结果：84株金 葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测．检出率为58．3％（49／84）。PVL基因阳性菌株的分离率为23．8％（20／84）,州￡阳性的MRSA为13株（13／49,26．5％）,PyL阳性的MSSA为7株（7／35,20．O％）,差异无统计学意义（P〉0．05）;未检出TSST-1基因。结论：金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。     

临床标本金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及耐药性

目的 了解临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及耐药情况。 方法 对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定。采用聚合酶链反应检测肠毒素基因 (SEA~SEE),采用K-B法进行药敏试验。 结果 共收集到138株金黄色葡萄球菌,其中74株分离自痰液标本,占53.62%;从年龄≥50岁患者中分离得到102株菌株,占73.91%;金黄色葡萄球菌中肠毒素阳性为120株,检出率为86.96%,SEA、SEB、SEC和SEE阳性率分别为63.33%、46.67%、45.00%和37.50%,未检测出SED基因,分离自痰液标本菌株以携带SEA和SEC为主,而分离自创面分泌物菌株则以携带SEB和SEE为主;药敏 结果 显示金黄色葡萄球菌对青霉素（96.67%）、红霉素（81.67%）、氯霉素（74.17%）、四环素（71.67%）耐药较为严重,对呋喃妥因（6.67%）、复方磺胺甲恶唑（16.67%）、阿莫西林/克拉维酸钾（4.17%）则比较敏感,所有菌株对万古霉素、替考拉宁均敏感。 结论 临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因携带率较高;不同标本来源的金黄色葡萄球菌携带肠毒素基因型存在差异,对于临床金黄色葡萄球菌的感染治疗应根据药敏结果选择合理的抗生素。     

院内外环境分离金黄色葡萄球菌的耐药性及毒素基因检测

目的检测医院及环境样中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）耐药基因及毒素基因,了解其分布情况。方法采用多重聚合酶链反应（multiplex polymeras chain reaction,PCR）技术分别检测耐药基因mecA、femA与毒素基因TSST、PVL。结果 83株金黄色葡萄球菌,仅3株（3.61%）菌检出mecA基因,22株菌（26.50%）检出femA基因,15株菌（18.07%）同时检出mecA与femA基因。医院样本检出12株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）,3株甲氧西林耐药凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant and coagulasenegative Staphylococcus aureus,MRCNS）。83株分离自医院及环境样本SA,2株分离自咽拭子的样本检出TSST基因,检出率4.54%（2/44）;1株分离自血液的样本检出PVL基因,检出率2.27%（1/44）,其余菌株未检出毒素基因。结论院内样本中,部分菌株携带mecA基因,环境样本未发现携带mecA菌株,两者存在差异。83株SA菌,毒素基因携带率较低。检测耐药、毒素基因携带率,为临床治疗及院内感染控制,食物中毒溯源提供依据。     

食品中金黄色葡萄球菌污染状况及其毒素检测

目的了解食品中金黄色葡萄球菌污染状况、产肠毒素特性及耐药性,为制定HACCP(Hazard Analysis andCritical Control Point,危害分析与关键控制点)防止由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病及临床用药提供依据。方法从各大商场超市、农贸市场、酒店饭店等销售的食品中随机采集6类不同品种食品共361份,按照GB/T 4789.10-2008的方法进行金黄色葡萄球菌检测,并对检出的金黄色葡萄球菌阳性菌株进行产肠毒素检验及药敏试验。结果 361份样品共检出金黄色葡萄球菌22株,检出率6.09%,其中豆制品检出率最高(30.0%),其次为凉拌食品(10.4%),膨化食品及婴幼儿食品未检出。采自农贸市场的食品金黄色葡萄球菌检出率最高(11.1%)。由于资源有限,只对其中13株阳性菌株检测肠毒素,6株检出肠毒素,产毒力为46.15%;6株含肠毒素金黄色葡萄球菌对苯唑西林、青霉素G、阿莫西林、红霉素、阿奇霉素产生耐药性,表现出多种耐药谱。结论食品中金黄色葡萄球菌有一定的污染,尤其在豆制品、凉拌食品中比较严重;食源性金黄色葡萄球菌产肠毒素能力较强;食品中金黄色葡萄球菌对多种药物耐药,临床治疗应建立在体外药敏试验基础上,有针对性选择抗菌药物。     

食源性致病菌沙门氏菌与奇异变形杆菌二重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测食物中致病菌奇异变形杆菌与沙门氏菌的双重PCR方法。方法根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）和沙门氏菌属侵袭性抗原保守基因（invA）设计特异性引物,建立其双重PCR检测方法,并对反应条件进行优化。结果两对引物分别能扩增出374 bp和724 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,两菌可同时检出的浓度限度为104cfu/ml。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食物中奇异变形杆菌与沙门氏菌的快速诊检和监控。     

金黄色葡萄球菌抗生素耐药相关基因检测

目的检测医院及环境样中金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaurell,SA）耐药基因,了解耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MethicillinResistantStaphylococcusaUleus,MRSA）和甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（MethiciUinResistantcoagulaseStaphylococcusanl＇e118,MRCNS）检出率以及金黄色葡萄球菌耐药基因分布情况。方法应用多重聚合酶链反应（Multiplexpolymeraschmnreaction,muhiplexPCR）检测医院及环境样中金黄色葡萄球菌的mecA、居mA基因。采用聚合酶链反应（Polymeraschmnreaction,PCR）技术检测金黄色葡萄球菌的11种耐药基因,分别是Bβ内酰胺类耐药基因blaTEM,氨基糖苷类耐药基因Aac（6’）／aph（2”）、aph（3’）-Ⅲ、ant（3”）-I、ant（4’,4”）与ant（6）-I,四环素耐药基因tetM,红霉素耐药基因erm,万古霉素耐药基因vanA、vanB,耐消毒基因qacA。结果44株菌分离自医院病人样本,检出12株MRSA,3株MRCNS。其中29株菌携带1种以上耐药基因,14株携带tetM基因,5株携带vanB基因,7株携带A0c（6’）伽h（2”）基因,9株携带aph（3’）-Ⅲ基因,7株携带ant（4＇,4”）基因,5株携带ant（6）-I基因。29株菌分离自环境样本,未检出MRSA与MRCNS。仅1株检出Aac（6’）/aph（2”）基因,16株检出ant（4＇,4”）基因,其余10种耐药基因未检出。结论院内样本中,不同样本分离菌株携带耐药基因存在差异,未检出携带qacA基因的菌株。环境样本携带肌￡（4’,4”）基因较高。检测耐药基因分布情况,为指导临床用药、控制院内感染及监测环境中菌株耐药情况提供依据。     

细菌性感染性腹泻常见病原菌的多重PCR检测

目的:建立一种能同时检测细菌性感染性腹泻标本中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法:根据沙门菌的invA基因序列、志贺菌的ipaH基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列、副溶血性弧菌的tdh基因序列设计特异性引物,通过多重PCR反应对样品中上述4种病原茵的目标基因进行扩增,同时优化反应体系。结果:本方法的特异性和灵敏性良好,该方法能检测的灵敏度分别为103.56pg的沙门菌DNA,94.85pg的志贺菌DNA,14.1pg的金黄色葡萄球菌DNA,115.32pg的副溶血性弧菌DNA。结论:该方法特异性和灵敏度高,检测周期短,适用于细菌性感染性腹泻标本中多种致病菌的快速检测,具有较好的应用前景。