罗勒多糖对HLECs中VEGFR-2/3表达影响的实验研究

【摘要】目的：观察分析罗勒多糖对人淋巴管内皮细胞（HLECs）的血管内皮细胞生长因子受体-2/3(VEGFR-2/3)表达的影响,揭示罗勒多糖抗肿瘤转移的分子机制。方法：乏氧条件下体外培养HLECs细胞,实验分为3组,A组为不加罗勒多糖处理的空白对照组,B组(罗勒多糖,200μg/ml)、C组（罗勒多糖,400μg/ml）,观察各组HLECs体外成管能力;实时荧光定量PCR检测罗勒多糖处理的HLECs中VEGFR-2/3 mRNA的表达变化;免疫细胞化学分析VEGFR-2/3蛋白的表达差异。结果：经不同处理的HLECs细胞体外成管数目分别为：29.6±5.47（A组）、23.6±3.68（B组）、19.2±2.00（C组）,与A组相比,B、C组均能减少HLECs的体外成管数目（Ｐ<0.05）;VEGFR-2 mRNA相对表达量分别为：1±0（A组）、0.59±0.25（B组）、0.90±0.13（C组）,与A组相比,B、C组VEGFR-2 mRNA相对表达量下降;VEGFR-3 mRNA相对表达量分别为：1±0（A组）、0.52±0.19（B组）、0.19±0.09（C组）,与A组相比,B、C组VEGFR-2 mRNA相对表达量均下降,其中C组有统计学意义（Ｐ<0.05）。VEGFR-2蛋白表达累积光密度分别为：2.51±0.03（A组）、2.42±0.03（B组）、2.12±0.03（C组）,与A组相比,B、C组VEGFR-2 mRNA相对表达量下降;VEGFR-3蛋白表达累积光密度分别为：3.72±0.28（A组）、2.91±0.26（B组）、2.82±0.20（C组）,与A组相比,B、C组VEGFR-3 蛋白相对表达量均下降,差异具有显著性（Ｐ<0.05）。结论：罗勒多糖可降低HLECs体外成管能力和下调VEGFR-2/3的表达,这可能是罗勒多糖抑制淋巴管新生,抗肿瘤转移的新机制。     

罗勒多糖对肝癌细胞缺氧模型组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B及JARID1B表达的影响

目的研究罗勒多糖对肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L缺氧模型组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B及JARID1B表达的影响,探讨罗勒多糖抗肿瘤侵袭转移作用与表观遗传修饰的关系。方法采用二氯化钴诱导肝癌细胞缺氧,建立肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L体外缺氧模型,通过不同剂量罗勒多糖干预24h,细胞划痕实验检测缺氧条件下肝癌细胞的迁移能力,实时荧光定量PCR法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、LSD1、JMJD2B及JARID1B mRNA表达水平,Westernblot法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、LSD1、JMJD2B及JARID1B蛋白表达情况。结果罗勒多糖能抑制缺氧条件下MHCC97H和MHCC97L细胞的迁移能力,下调细胞中HIF-1αmRNA及蛋白的表达水平,与缺氧模型组相比有显著性差异(P0.05);罗勒多糖能够下调MHCC97H细胞缺氧条件下LSD1、JMJD2B、JARID1B mRNA和蛋白的表达,与缺氧模型组相比有显著性差异(P0.05);缺氧条件下MHCC97L细胞中LSD1、JMJD2B、JARID1B mRNA和蛋白的表达与正常对照组无显著性差别(P0.05),罗勒多糖对这三种酶的表达亦无显著作用。结论罗勒多糖能改善不同转移潜能肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L的缺氧微环境,抑制肿瘤细胞的侵袭转移。其中罗勒多糖对高转移潜能肝癌细胞MHCC97H的抗侵袭转移作用与其对细胞中组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B、JARID1B的调节有关,而对低转移潜能肝癌细胞MHCC97L侵袭转移能力的调节未发现与LSD1、JMJD2B、JARID1B有明显关系。     

温阳补肾药对抗骨髓间充质干细胞凋亡的实验研究

目的:探讨温阳补肾药对骨髓间充质干细胞凋亡的影响及作用机制。方法:建立白细胞介素1β诱导体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞凋亡体系,分别向其中加入巴戟天含药血清(A组)、鹿角胶含药血清(B组)、淫羊藿含药血清(C组)、骨碎补含药血清(D组)和空白血清(F组),E组不加入血清。各组细胞培养48 h后,采用RT-PCR法检测bcl-2和Bax的mRNA表达量,采用电泳法检测骨髓间充质干细胞凋亡体系的建立,采用Western Blot法检测bcl-2和Bax的蛋白表达量。结果:①骨髓间充质干细胞表面标记结果。流式细胞仪检测结果显示CD34、CD45表达阴性,CD90表达阳性。②bcl-2和Bax的mRNA表达量。各组bcl-2mRNA表达量比较,差异有统计学意义(22.25±1.15,15.18±1.51,15.36±0.72,16.12±0.95,16.79±1.39,16.02±1.14;F=182.000,P=0.000)。A组bcl-2mRNA表达量高于B组、C组、D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);E组高于B组(P=0.030)。各组BaxmRNA表达量比较,差异有统计学意义(19.17±0.67,15.37±1.02,18.18±0.23,17.37±0.72,28.36±0.93,23.52±1.26;F=28.422,P=0.000)。A组BaxmRNA表达量高于B组和D组(P=0.001,P=0.018),低于E组(P=0.001);B组低于C组、E组和F组(P=0.013,P=0.000,P=0.000),B组与D组比较,差异无统计学意义(P=0.052);D组低于F组(P=0.000);E组高于C组和F组(P=0.000,P=0.000)。③bcl-2DNA和BaxDNA电泳结果。电泳图谱显示,E组条带与A组、B组、C组、D组有明显差异。④bcl-2和Bax的蛋白表达量。各组bcl-2蛋白表达量比较,差异有统计学意义(11 526.18±697.38,20 096.88±953.73,16 784.88±504.36,14 856.65±546.90,8 549.29±313.63,9 004.79±399.12;F=341.740,P=0.000)。A组bcl-2蛋白表达量低于B组、C组和D组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),高于E组和F组(P=0.000,P=0.000);B组高于C组、D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);C组高于D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);D组高于E组和F组(P=0.000,P=0.000)。各组Bax蛋白表达量比较,差异有统计学意义(12 435.09±1002.35,4 590.96±71.45,11 721.90±855.08,10 393.54±662.79,13 874.83±541.16,12 774.15±674.40;F=136.305,P=0.000)。A组Bax蛋白表达量高于B组和D组(P=0.000,P=0.039);B组低于C组、D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);C组低于E组(P=0.010);D组低于E组和F组(P=0.000,P=0.002)。结论:温阳补肾药含药血清有对抗白细胞介素1β诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用,其机制主要是上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达,下调促进凋亡基因Bax的表达,抑制其蛋白酶活性从而降低细胞凋亡率。     

疏肝健脾饮对乳腺癌癌前病变裸鼠淋巴管生成的影响研究

目的研究疏肝健脾饮对乳腺癌癌前病变裸鼠淋巴管生成途径COX-2/VEGF通路中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白及mRNA表达的影响,探讨疏肝健脾饮对乳腺癌癌前病变淋巴管生成的干预作用机制,寻找中药复方抑制淋巴管生成的作用靶点。方法取120只BALB/c-nude mice裸鼠,采用乳腺原位移植MCF-10AT细胞株方法建立癌前病变模型,建模成功后随机分成6组,每组20只。模型对照组裸鼠予以0.9%氯化钠溶液灌胃,疏肝健脾饮组、疏肝理气组、健脾化痰组、活血化瘀组分别予以相应中药制剂灌胃,均1次/d;他莫昔芬组给予他莫昔芬腹腔注射,每周2次。各组均连续干预9周。至第9周周末处死各组裸鼠,分别采用Western-blot、RT-PCR技术检测肿瘤组织中VEGF-C、VEGFR-3、COX-2蛋白及mRNA表达情况。结果疏肝健脾饮组、疏肝理气组、活血化瘀组、他莫昔芬组VEGF-C蛋白及mRNA相对表达量均明显低于模型对照组(P均0.05),且疏肝健脾饮组均明显低于活血化瘀组(P均0.05)。疏肝健脾饮组、健脾化痰组、他莫昔芬组VEGFR-3蛋白相对表达量均明显低于模型对照组(P均0.05),且疏肝健脾饮组及他莫昔芬组均明显低于疏肝理气组(P均0.05);疏肝健脾饮组、疏肝理气组、他莫昔芬组COX-2蛋白相对表达量均明显低于模型对照组(P均0.05),且疏肝健脾饮组及他莫昔芬组均明显低于健脾化痰组及活血化瘀组(P均0.05)。疏肝健脾饮组、疏肝理气组、他莫昔芬组VEGFR-3 mRNA相对表达量均明显低于模型对照组(P均0.05),且疏肝健脾饮组和他莫昔芬组明显低于活血化瘀组(P均0.05);疏肝健脾饮组、他莫昔芬组COX-2 mRNA相对表达量均明显低于模型对照组和疏肝理气组(P均0.05)。疏肝健脾饮组与他莫昔芬组VEGF-C、VEGFR-3、COX-2蛋白及mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均0.05)。结论疏肝健脾饮可通过干预VEGF-C、VEGFR-3、COX-2的表达而影响淋巴管的生成,抑制乳腺癌癌前病变。     

黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP27B，CYP24A mRNA及蛋白表达的影响

目的:通过研究黄芪多糖对成骨细胞增殖及1α羟化酶(CYP27B),24-羟基化酶(CYP24A)基因与蛋白表达情况的影响对其治疗骨质疏松症(OP)作用机制进行初步探讨。方法:以MC-3T3-E1成骨细胞为研究对象,实验分为5组,分别为正常组,维生素D组(1×10-5mmol·L-1),黄芪多糖高、中、低剂量组(10,1,0.1 mg·L~(-1))。用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的黄芪多糖在不同时间(24,36,48 h)对MC-3T3-E1成骨细胞增殖率的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B mRNA的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B蛋白的表达情况。结果:MTT比色法显示黄芪多糖的质量浓度在0.1,1,10 mg·L~(-1)时可以提高MC-3T3-E1成骨细胞的增殖率,且在48 h促增殖作用最佳。Real-time PCR,Western blot检测结果显示,与正常组比较,维生素D组MC-3T3-E1成骨细胞CYP27B mRNA表达量、蛋白表达量有显著促进作用(P0.05);与维生素D组比较,黄芪多糖在质量浓度为10,1,0.1 mg·L~(-1)时对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A mRNA表达量、蛋白表达量有显著抑制作用(P0.05)。结论:黄芪多糖能够治疗骨质疏松症其机制与提高成骨细胞活性及调节MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B mRNA及蛋白表达水平有关。     

燧心胶囊对慢性心力衰竭大鼠保护作用及机制研究

目的:探究燧心胶囊对慢性心力衰竭(CHF)大鼠的保护作用及机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组(A组)、模型组(B组)、燧心胶囊高剂量(10.8 g/kg)组(C组)、燧心胶囊低剂量(2.7 g/kg)组(D组)、卡托普利(5.83 mg/kg)组(E组)。连续给药12周后,测定各组大鼠心输出量,血流动力学监测左室收缩压(LVESP)、左室舒张压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax),心肌组织钠钙交换蛋白(NCX)及肌浆网钙泵2a(SERCA2a)蛋白行IHC染色,利用PCR及Western Blot(WB)实验检测心肌组织中NCX和SERCA2a mRNA及蛋白表达量。结果:①与A组比较,B组NCX蛋白表达量增多,SERCA2a蛋白表达量减少;心输出量降低(P0.05);左心室收缩末期内径LVESP及左心室舒张末期内径LVEDP均显著升高(P0.05),±dp/dtmax明显减慢(P0.05);NCX mRNA及蛋白表达量增多(P0.05),SERCA2a mRNA及蛋白表达量减少(P0.05)。②与B组比较,C组、E组NCX蛋白表达量减少,SERCA2a蛋白表达量增多;心输出量增多(P0.05),LVESP及LVEDP均显著降低(P0.05),±dp/dtmax明显升高(P0.05);NCX mRNA及蛋白表达量减少(P0.05),SERCA2a mRNA及蛋白表达量增多(P0.05)。③D组大鼠上述结果与B组大鼠比较,差异无统计学意义(P 0.05)。结论:燧心胶囊对慢性心力衰竭大鼠心肌组织具有保护作用,可通过下调NCX的表达、上调SERCA2a的表达,调节CHF大鼠的心室舒缩功能。     

胃癌浆膜受侵犯程度对根治术后腹腔转移风险的影响

目的观察胃癌浆膜受侵犯程度对根治术后腹腔转移风险的影响。方法选取104例胃癌患者,根据浆膜受侵面积分为A组(受侵面积≤10 cm2,54例)、B组(受侵面积10 cm2,50例)。2组均行腹腔镜胃癌D2根治术,分别于2组手术开始时及术后关腹前收集腹腔冲洗液,检测其中癌胚抗原(CEA)mRNA、多巴脱羧酶(DDC)mRNA相对表达量,随访3年,比较总生存率。结果 A组术前与术后腹腔冲洗液中CEA mRNA相对表达量及DDC mRNA相对表达量均显著低于B组(P均0.05);A组术前与术后的CEA mRNA与DDC mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均0.05),B组术后腹腔冲洗液中CEA mRNA与DDC mRNA相对表达量均显著高于术前(P均0.05)。2组随访1年的总生存率无明显差异(P0.05);A组随访2年与3年的总生存率均显著高于B组(P均0.05)。结论浆膜受侵面积超过10 cm2的胃癌患者的术前及术后腹腔冲洗液中CEA mRNA、DDC mRNA相对表达量均更高,且术后腹腔冲洗液中CEAmRNA、DDC mRNA相对表达量较术前升高,增加了腹腔转移风险,预后相对较差。     

活血解毒方对HSG细胞凋亡及自噬表达的影响

目的 观察活血解毒方对HSG细胞凋亡及自噬表达的影响。方法 活血解毒方中药冻干粉干预IFN-γ+TRAIL联合诱导的HSG细胞凋亡,以白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)作为阳性对照组,实时荧光定量(quantitative real-time fluorescence, PCR)及蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞凋亡内源性途径中及自噬相关蛋白与m RNA的表达、激光共聚焦检测自噬情况。结果 与空白组比较,模型组Bax、LC3B蛋白相对表达量明显升高(P <0.01),而Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P <0.01);与模型组比较,两治疗组Bax、LC3B蛋白相对表达量明显降低(P <0.01),Bcl-2蛋白相对表达量明显升高(P <0.01);与TGP组比较,中药组LC3B蛋白相对表达量降低(P <0.05);与空白组比较,模型组Bax mRNA相对表达量明显升高(P <0.01),Bcl-2m RNA相对表达量明显降低(P <0.01);与模型组比较,两治疗组Bax mRNA...     

补中益气汤对Ⅲ度脱垂性内痔组织中Fibulin-5表达影响的研究

目的:探讨补中益气汤对Ⅲ度脱垂性内痔组织中Fibulin-5蛋白及其mRNA表达的影响。方法:将59例证型为脾虚气陷的Ⅲ度脱垂性内痔患者依门诊号顺序,按随机数字表法分为3组,其中治疗组(A组) 20例,对照组(B组) 20例,空白组(C组) 19例;A组病人口服草木犀流浸液片,同时服用补中益气汤;B组病人口服草木犀流浸液片;C组仅做空白对照,不服用任何药物,均治疗1周。疗程停止后第2天,分别于A、B、C组患者中收取肛垫组织标本各10例,重新对应分组为A1、B1、C1组,采用PCR、Western-blot技术从基因-蛋白层次系统研究比较各组患者内痔组织中Fibulin-5 mRNA与蛋白的表达分布差异。结果:Fibulin-5溶解曲线、β-Actin溶解曲线提示引物具有特异,且无杂带、无杂信号。3组间Fibulin-5 mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P 0.05)。组间的两两比较:A1组Fibulin-5 mRNA表达水平高于B1组(P 0.05);A1组Fibulin-5 mRNA表达水平高于C1组(P 0.05);B1组Fibulin-5 mRNA表达水平高于C1组(P 0.05)。从Fibulin-5蛋白条带发现,A1组中Fibulin-5蛋白表达最强且集中。3组间Fibulin-5蛋白表达水平比较,差异有统计学意义(F=12.581,P 0.05)。组间的两两比较:A1组Fibulin-5蛋白表达水平高于B1组(P 0.05);A1组Fibulin-5蛋白表达水平高于C1组(P 0.05);B1组与C1组Fibulin-5蛋白表达水平相当,差异无统计学意义(P 0.05)。结论:补中益气汤可促进Ⅲ度脱垂性内痔组织中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5mRNA的表达;Fibulin-5蛋白及Fibulin-5mRNA的表达水平的降低,可能是脱垂性内痔形成的病理学机制之一。     

藏药红景天对大鼠肺纤维化保护作用及机制探讨

目的观察红景天对肺纤维化大鼠肺组织I型胶原、转化生长因子β1(TGF-β1)及其信号通路分子Smad4表达的影响,探讨红景天对大鼠肺纤维化的防治作用与机制。方法健康SD大鼠40只随机分为4组:模型组(A组),正常对照组(B组),红景天14d治疗组(C组),红景天28d治疗组(D组)各10只。博莱霉素(BLM)气管内滴入建立大鼠肺纤维化模型,正常对照组气管内滴入生理盐水。在造模的第2日治疗组予红景天0.21g/kg灌胃干预,于第14,28日取肺组织,运用组织芯片结合图象分析技术,通过苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学改变,用免疫组化检测I型胶原蛋白和TGF-β1的表达,实时荧光定量RT-PCR检测I型胶原和TGF-β1的mRNA表达,原位杂交技术对Smad4 mRNA进行定位定量分析。结果红景天在两时相皆抑制I型胶原,TGF-β1的表达。C组I型胶原蛋白的IOD值为(0.362±0.241),D组I型胶原蛋白IOD值为(0.334±0.122),与A组(0.513±0.384)相比有统计学意义(P均<0.05)。C组TGF-β1蛋白的IOD值为(0.062±0.013),D组TGF-β1蛋白IOD值为(0.058±0.011),与A组(0.100±0.005)相比有统计学意义(P均<0.05)。C组I型胶原mRNA相对表达量为(0.041±0.017),D组I型胶原mRNA相对表达量为0.040±0.021,与A组0.071±0.054相比有统计学意义(P均<0.05)。C组TGF-β1 mRNA相对表达量为(0.0025±0.0013),D组TGF-β1 mRNA相对表达量为(0.0030±0.0005),与A组(0.0170±0.0157)相比有统计学意义(P均<0.05)。肺组织Smad4 mRNA表达呈局灶性,在炎症和胶原沉积部位表达较明显,而治疗组和模型组比较无统计学意义(P均>0.05);治疗组Smad4 mRNA表达量与正常对照组(0.165±0.099)比较亦无统计学意义(P>0.05)。结论红景天对大鼠肺纤维化具有一定治疗作用,其机制可能是通过抑制I型胶原及TGF-β1表达,从而干扰TGF-β-Smads信号通路对基因表达、蛋白合成的调节而实现的。     

金龙蛇颗粒含药血清对人淋巴管内皮细胞体外成管、迁移及凋亡的影响

目的观察金龙蛇颗粒含药血清(Jinlongshe Granule drug-containing serum,JG-DS)对人淋巴管内皮细胞(human lymphatic endothelial cells,HLECs)体外成管、迁移及凋亡的影响。方法制备JG-DS;将第3代HLECs分为2组:对照组(采用生理盐水血清进行培养)和实验组(采用JG-DS培养)。两组细胞培养12 h后,采用Matrigel基质胶成管实验检测HLECs成管能力;Transwell法检测HLECs迁移能力;采用流式细胞术、Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染法检测HLECs凋亡率。结果 10%JG-DS作用12 h后,HLECs小管总长度为(3 084.49±326.27)μm,明显低于对照组的(7 058.93±4 567.39)μm,差异有统计学意义(P0.01);HLECs迁移指数为(99±26)个,明显低于对照组的(160±32)个,差异有统计学意义(P0.05)。两组HLECs凋亡率比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论金龙蛇颗粒对HLECs体外成管及迁移有抑制作用,可能是其抑制肿瘤微淋巴管生成的机制之一。     

活血消异方对子宫内膜异位症盆腔粘连大鼠TGF-β/Smads信号通路相关因子的影响

目的观察活血消异方对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)盆腔粘连大鼠TGF-β/Smads信号通路相关因子的影响。方法将造模大鼠自体子宫内膜移植于肠系膜上建立EMs盆腔粘连大鼠模型,随机分为模型组(简称C组),术后第1天中药给药组(简称D1组),术后第3天中药给药组(简称D2组),术后第5天中药给药组(简称D3组),术后第1天西药给药组(简称E1组),术后第3天西药给药组(简称E2组),术后第5天西药给药组(简称E3组)。中药组予活血消异方灌胃,西药组予促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)肌肉注射。连续给药28天后,开腹进行盆腔粘连评分,再分别取造模大鼠粘连腹膜组织、空白组(简称A组)和假手术组(简称B组)正常腹膜组织,采用免疫组化、反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测腹膜组织中TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白和mRNA表达。结果与B组比较,C组盆腔粘连评分显著升高(P0.05),与C组比较,D1、D2、D3、E1、E2、E3组盆腔粘连评分均显著降低(P0.05);D1、D2组盆腔粘连评分显著低于D3组(P0.05);E1组显著低于E2、E3组(P0.05);C组大鼠TGF-β1、TGFβ3、Smad3、Smad7 mRNA及蛋白表达量显著高于B组(P0.05);D1、D2、D3、E1、E2、E3组TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达均显著低于C组(P0.05),TGF-β3mRNA和蛋白表达均高于C组(P0.05),Smad7 mRNA和蛋白表达均与C组相当(P0.05);D1、D2、D3组间TGF-β1、TGF-β3mRNA和蛋白表达量差异有统计学意义(P0.05),E1、E2、E3组间TGF-β3mRNA和蛋白表达量差异有统计学意义(P0.05)。结论 EMs可导致大鼠严重、广泛的盆腔粘连;活血消异方能过调控TGF-β/Smads信号传导通路相关因子的表达,改善EMs盆腔粘连程度,且中药干预越早,改善盆腔粘连程度疗效越显著。     

电针刺激后大鼠血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA及其蛋白表达的影响

目的观察电针刺激去卵巢骨质疏松症模型大鼠的血清对体外培养成骨细胞的骨形成因子骨保护素(osteoprotegerin, OPG)和骨吸收因子(receptor activator for nuclear factor-?B ligand, RANKL)mRNA表达及其蛋白浓度的影响。方法将45只雌性SD大鼠,随机分为空白组(A组)、模型组(B组)、电针刺激组(C组),每组15只。除A组外,B组、C组均切除双侧卵巢。造模成功后,C组给予电针刺激,B组正常饲养,A组不做任何处理,常规正常饲养。12周后,采用水合氯醛麻醉各组大鼠,心脏采血,经过处理后加到体外培养的大鼠成骨细胞培养液中。采用碱性磷酸酶(ALP)检测成骨细胞活性,RT-qPCR法检测大鼠血清对OPG、RANKL mRNA表达的影响,ELISA法检测大鼠血清对OPG、RANKL蛋白浓度的影响。结果各组大鼠血清处理成骨细胞后,与A组比较,B组ALP的活性明显降低(P0.05),C组电刺激后成骨细胞内ALP的活性明显增加(P0.05)。与B组比较,A组及C组OPG mRNA表达及其蛋白浓度表达明显降低(P0.05);与A组比较,C组OPG mRNA表达及其蛋白浓度均明显降低(P0.05)。与B组比较,C组及A组RANKL mRNA表达及其蛋白浓度表达明显降低(P0.05);与A组比较,C组RANKL mRNA及蛋白浓度明显降低(P0.05)。C组大鼠骨密度明显高于B组(P0.05)。结论电刺激后的大鼠血清可以提升ALP、OPG水平,降低RANKL水平,其治疗骨质疏松症的机制可能与此有关。     

黄芪含药血清对衰老骨髓间充质干细胞CYP24A1，CYP27B1 mRNA和蛋白的影响

目的:通过探讨不同浓度黄芪含药血清对衰老骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中24-羟基化酶(CYP24A1),1α羟化酶(CYP27B1)mRNA及蛋白表达的影响,初步探讨其治疗原发性骨质疏松症作用机制。方法:将SD大鼠随机分为6组,正常组、模型组、黄芪含药血清低、中、高质量分数组(20%,40%,60%),维生素D组。细胞增殖毒性检测(CCK-8)法检测不同浓度黄芪含药血清对衰老BMSCs成骨分化细胞存活率的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度黄芪含药血清对衰老BMSCs成骨分化细胞CYP24A1,CYP27B1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:CCK-8法显示,与正常组比较,模型组BMSCs成骨分化细胞经D-半乳糖诱导后细胞增殖存活率显著降低(P0.01);与模型组比较,黄芪含药血清中、高质量分数组及维生素D组均可在不同程度上提高衰老BMSCs成骨分化细胞增殖存活率(P0.01);Real-time PCR和Western blot结果显示,与正常组比较,模型组CYP27B1 mRNA和蛋白相对表达量显著降低,CYP24A1 mRNA和蛋白相对表达量显著升高(P0.01);与模型组比较,黄芪高质量分数组均可升高CYP27B1 mRNA和蛋白相对表达量(P0.01),降低CYP24A1 mRNA和蛋白相对表达量(P0.01),呈质量分数依赖性。结论:不同浓度黄芪含药血清可治疗骨质疏松症,其机制可能与调节衰老骨髓间充质干细胞成骨分化过程中CYP24A1,CYP27B1 mRNA及蛋白表达水平有关。     

益气养阴方影响Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长与调节Notch信号表达的关系

目的:通过不同剂量益气养阴方对Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长及肿瘤组织中Notch信号表达影响的观察,从调节Notch信号表达角度,探讨益气养阴方抑制肺癌生长的机制。方法:将60只荷瘤(Lewis肺癌细胞)近交系C57BL/6纯系小鼠随机分为4组:模型组、益气养阴方等效剂量组、益气养阴大剂量组、CTX化疗组,每组15只,模型组只行造模,益气养阴等效剂量组以小鼠体质量每克0.435 m L/g生药灌胃给药,3次/d,大剂量组按小鼠体质量1.36 m L/g生药灌胃给药,3次/d;CTX组按照20 mg/kg溶于0.2 m L生理盐水中腹腔注射,每周1次;各组均常规喂食;干预30 d后,观察记录各组肿瘤及Notch信号表达变化。结果:(1)肿瘤相对体积(RTV)及肿瘤相对抑制率:模型组肿瘤相对体积(RTV)为15.00±1.72,CTX组肿瘤相对体积(RTV)及相对肿瘤体积抑制率分别为8.86±0.91、40.92%,益气养阴等效剂量组肿瘤相对体积(RTV)及相对肿瘤体积抑制率分别为11.33±2.34、24.47%,益气养阴大剂量组为5.89±1.56、60.74%,上述3组较模型组RTV值均缩小(P<0.01),大剂量组RTV均低于其他3组(P<0.01),而CTX组肿瘤相对体积低于等效剂量组(P<0.05);肿瘤抑制率大剂量组较等效剂量组及CTX组高(P<0.05)。(2)肿瘤组织中Notch信号通路表达:模型组Notch1mRNA表达为1.03±0.27,Notch3mRNA表达为1.06±0.33,Jagged1mRNA表达为1.07±0.04,HeslmRNA表达为1.01±0.07;CTX组Notch1mRNA表达为0.24±0.05,Notch3mRNA表达为0.43±0.22,Jagged1mRNA表达为0.29±0.07,HeslmRNA表达为0.40±0.10;益气养阴等效剂量组Notch1mRNA表达为0.57±0.12,Notch3mRNA表达为0.62±0.12,Jagged1mRNA表达为0.43±0.06,HeslmRNA表达为0.60±0.14;益气养阴高剂量组Notch1mRNA表达为0.07±0.05,Notch3mRNA表达为0.05±0.02,Jagged1mRNA表达为0.18±0.07,HeslmRNA表达为0.17±0.04;药物干预组Notch1mRNA表达均较模型组低(P<0.05),等效剂量组Notch1mRNA表达高于CTX组(P<0.05);高剂量组较等效剂量组及CTX组Notch1mRNA表达量低(P<0.05);等效剂量组、高剂量组、CTX组Notch3mRNA表达均较模型组降低(P<0.05),等效剂量组Notch3mRNA表达与CTX组比较无统计学差异(P>0.05);高剂量组较等效剂量组及CTX组Notch3mRNA表达量降低(P<0.05);等效剂量组、高剂量组、CTX组Jagged1mRNA及HeslmRNA表达均较模型组降低(P<0.05),等效剂量组与CTX组Jagged1mRNA及HeslmRNA表达量降低,(P>0.05);高剂量组较等效剂量组及CTX组Jagged1mRNA及HeslmRNA表达量降低(P<0.05)。结论:益气养阴方剂有抑制Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的作用,且较大剂量的益气养阴方用量更有利于抑制Lewis肺癌细胞生长,而这种抑制作用与益气养阴方剂调控肿瘤组织中Notch1信号通路有关。     

醒脑静注射液对七氟醚麻醉手术成年小鼠的影响及机制

目的探讨醒脑静注射液对七氟醚麻醉手术成年小鼠的影响及机制。方法选取C57BL/6小鼠50只,随机分为对照组、模型组、1 mL/kg醒脑静组、5 mL/kg醒脑静组、10 mL/kg醒脑静组,每组10只,除对照组外,其余组大鼠给予3%七氟醚持续吸入6 h,其中1 mL/kg醒脑静组、5 mL/kg醒脑静组、10 mL/kg醒脑静组在麻醉前2 h分别给予1、5、10 mL/kg醒脑静注射,采用Morris水迷宫测试小鼠学习记忆能力,qRT-PCR检测S100A8 mRNA、syt-ⅠmRNA表达,Western Blot检测S100A8、syt-Ⅰ蛋白表达。结果模型组、1 mL/kg醒脑静组、5 mL/kg醒脑静组、10 mL/kg醒脑静组逃避潜伏期、S1008mRNA和蛋白明显高于对照组(P0.05),而穿越平台次数、目标象限游泳时间、syt-ⅠmRNA和蛋白明显少于对照组(P0.05);10 mL/kg醒脑静组逃避潜伏期、S100A8 mRNA和蛋白相对表达量分别为(19.40±2.10)s、(0.320±0.113)和(0.882±0.103),明显低于模型组、1 mL/kg醒脑静组、5 mL/kg醒脑静组(P0.05),而穿越平台次数、目标象限游泳时间、syt-ⅠmRNA和蛋白相对表达量分别为(5.00±1.03)次、(13.52±1.34)s、(0.821±0.105)和(0.800±0.107),明显高于模型组、1 mL/kg醒脑静组、5 mL/kg醒脑静组(P0.05)。结论醒脑静能改善七氟醚对成年小鼠学习记忆功能的影响,可能与其提高小鼠海马组织syt-Ⅰ表达,降低S100A8表达有关。     

罗勒多糖对缺氧条件下肝癌细胞组蛋白H3K9me2甲基化及G9a、JMJD1A表达的影响

目的:研究罗勒多糖对缺氧条件下肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L低氧诱导因子1α(HIF-1α)组蛋白甲基转移酶G9a、去甲基化酶JMJD1A的表达及组蛋白H3K9me2甲基化水平的影响,探讨罗勒多糖对肝癌细胞表观遗传学的调节作用。方法:采用二氯化钴(Co Cl2)模拟细胞缺氧,建立肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L体外缺氧模型,通过不同浓度罗勒多糖干预24 h,实时荧光定量PCR法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、G9a和JMJD1A mRNA表达水平,Western-blot法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、G9a、JMJD1A蛋白表达情况及组蛋白H3K9me2甲基化水平。结果:罗勒多糖能下调MHCC97H细胞缺氧条件下HIF-1α、G9a、JMJD1A mRNA和蛋白的表达和组蛋白H3K9me2甲基化水平以及MHCC97L细胞缺氧条件下HIF-1αmRNA和蛋白的表达和组蛋白H3K9me2甲基化水平(P0.05)。结论:罗勒多糖对缺氧条件下不同转移潜能肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L组蛋白H3K9me2甲基化水平均有有调节作用,其中对高转移潜能肝癌细胞MHCC97H组蛋白H3K9me2甲基化的调节与组蛋白甲基转移酶G9a和去甲基化酶JMJD1A有关,而对低转移潜能肝癌细胞MHCC97L组蛋白H3K9me2甲基化的调节可能是通过其他通路发挥作用。     

安胃汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠细胞凋亡因子表达的影响

目的:研究安胃汤对慢性萎缩性胃炎(CAG)模型大鼠细胞凋亡因子表达的影响。方法:采用MNNG法建立CAG大鼠模型,将60只大鼠随机分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、胃复春组(C组)、安胃汤低剂量组(D组)、安胃汤中剂量组(E组)、安胃汤高剂量组(F组)各10只,A、B两组给予3ml生理盐水灌胃,C组给予胃复春悬浊液按照0.078g/100(g·d)的剂量灌胃。D、E、F组分别给予0.5、1.0、2.0g/100(g·d)剂量的安胃汤灌胃,连续治疗4周。显微镜下观察胃黏膜组织形态的改变,使用QRT-PCR法和Western-blot法检测胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA及蛋白的表达,TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡指数。结果:镜下显示,B组胃黏膜明显萎缩,固有腺体萎缩消失,D、E、F组胃黏膜结构完整度呈递增趋势,固有腺体萎缩程度降低,数目增加,明显优于B组。与B组相比,C、D、E、F组的Bcl-2 mRNA相对表达量和蛋白表达量升高,Bax、Fas、FasL mRNA相对表达量和蛋白表达量降低(P0.05);与C组相比,E、F组的Bcl-2mRNA相对表达量和蛋白表达量升高,Bax、Fas、FasL mRNA相对表达量降低(P0.05)。与B组相比,C、D、E、F组凋亡指数均下降(P0.05);与C组相比,D、E、F组凋亡指数均下降,且随着剂量的升高,下降程度更明显(P0.05)。结论:安胃汤治疗CAG大鼠,能够通过调节Bax、Bcl-2、Fas、FasL等细胞凋亡因子水平,抑制胃黏膜细胞凋亡,改善胃黏膜萎缩,效果与安胃汤剂量正相关。     

人工关节假体磨损颗粒对巨噬细胞游走抑制因子表达的影响

目的:观察人工关节假体磨损颗粒对巨噬细胞游走抑制因子表达的影响.方法:配制钛颗粒悬液,并培养小鼠巨噬细胞.将培养的第3代小鼠巨噬细胞分别进行以下实验:①将细胞分为4组,A组不作任何处理,B组加入浓度为0.01％的钛颗粒;C组加入浓度为0.05％的钛颗粒,D组加入浓度为0.1％的钛颗粒培养24 h后分别用酶联免疫吸附剂测定法和聚合酶链式反应法检测各组的巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA的含量.②将细胞分2组,对照组不作任何处理,观察组加入浓度为0.1％的钛颗粒.分别在实验开始后0h、6h、12h、24 h和36 h对2组的不同培养孔的细胞用酶联免疫吸附剂测定法和聚合酶链式反应法检测各组的巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA的含量.③将细胞分为4组,Ⅰ组不作任何处理,Ⅱ组加入浓度为0.1％的钛颗粒,Ⅲ组加入浓度为1 00 μmol· mL-1的吡咯烷二硫代氨基甲酸盐,Ⅳ组先加入浓度为100 μmol·mL-1的吡咯烷二硫代氨基甲酸盐,1h后再加入浓度为0.1％的钛颗粒.培养24 h后用酶联免疫吸附剂测定法检测各组的巨噬细胞游走抑制因子蛋白含量.④将细胞分为2组,a组不作任何处理,b组加入浓度为0.1％的钛颗粒.分别在实验开始后0h、0.5h、1h、3h和6h对2组的不同培养孔的细胞用酶联免疫吸附剂测定法测定磷酸化p65的含量.结果:①钛颗粒浓度对巨噬细胞游走抑制因子表达的影响:各组小鼠巨噬细胞巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA含量的组间比较,差异均有统计学意义(F=207.158,P=0.000;F=64.955,P=0.000).A组巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA的含量[(3.93±0.11)ng· mL-1,(0.03±0.01)]与B组[(4.21±0.27)ng· mL-1,(0.10±0.01)]比较,差异无统计学意义(P=0.167;P =0.223);A组小于C组[(6.56 ±0.27)ng·mL-1,(0.25±0.09)],差异有统计学意义(P=0.000;P=0.004);A组小于D组[(7.82 ±0.21)ng·mL-1,(0.70 ±0.09)],差异有统计学意义(P =0.000;P=0.000);B组小于C组(P =0.000;P=0.025)和D组(P=0.000;P=0.000);C组小于D组(P=0.000;P =0.000).②钛颗粒刺激时间对巨噬细胞游走抑制因子的影响:对照组巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA含量各时点间比较,差异无统计学意义(F=0.310,P=0.865;F=0.065,P=0.991).观察组巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA含量各时点间比较,差异有统计学意义(F=32.857,P=0.000;F=15.621,P=0.000),各时点间两两比较:6h时的巨噬细胞游走抑制因子蛋白和巨噬细胞游走抑制因子mRNA表达量[(4.14±0.24)ng· mL-1,(0.08±0.04)]与0 h[(3.60±0.40)ng,mL-1,(0.03±0.01)]比较,差异无统计学意义(P =0.133;P =0.621);12 h的表达量[(5.61±0.47)ng· mL-1,(0.36±0.21)]大于0h,差异有统计学意义(P =0.000;P=0.004);24 h的表达量[(7.15 ±0.10)ng· mL-1,(0.71±0.12)]大于12 h,差异有统计学意义(P=0.000;P =0.003);36 h的表达量[(5.22±0.85)ng·mL-1,(0.31 ±0.18)]小于24 h,差异有统计学意义(P =0.000;P =0.004),但高于0h的表达量(P =0.000;P=0.003).③钛颗粒和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对巨噬细胞表达巨噬细胞游走抑制因子蛋白的影响:实验结束后4组小鼠巨噬细胞的巨噬细胞游走抑制因子蛋白量分别为,Ⅰ组(3.77 ±0.42)ng·mL-1,Ⅱ组(7.59±0.28)ng· mL-1,Ⅲ组(4.23 ±0.42)ng·mL-1,Ⅳ组(6.48±0.5)ng· mL-1 析因方差分析结果提示,单独使用0.1％钛颗粒能促进巨噬细胞表达巨噬细胞游走抑制因子蛋白(F=153.363,P=0.000);单独使用100 μmol·mL-1的吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对巨噬细胞表达巨噬细胞游走抑制因子蛋白无影响(F=1.762,P=0.221);100 μmol·mL-1的吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对0.1％钛颗粒促进巨噬细胞表达巨噬细胞游走抑制因子蛋白具有抑制效应(F=10.325,P=0.012).④钛颗粒浓度对巨噬细胞NF-κB信号通路的影响:a组各时点磷酸化p65含量比较,差异无统计学意义(F=0.248,P=0.904).b组各时点磷酸化p65含量比较,差异有统计学意义(F=30.217,P=0.000),各时点间两两比较:0.5 h磷酸化p65含量[(17.68±0.55)pg·mg-1]高于0 h[(10.38±3.18)pg·mg-1],差异有统计学意义(P =0.005);1 h磷酸化p65含量[(23.31 ±2.05)pg· mg-1]高于0.5h,差异有统计学意义(P =0.020);3 h磷酸化p65含量[(31.80±1.84)pg·mg-1]高于1 h,差异有统计学意义(P =0.002);6 h磷酸化p65含量[(18.42±3.61)pg·mg-1]低于3 h(P =0.000),但高于0 h(P=0.003) 结论:人工关节假体磨损颗粒可通过NF-κB信号通路上调巨噬细胞游走抑制因子的表达,促进假体周围炎症反应,导致假体周围骨吸收、溶解,导致假体无菌性松动.     

丹参注射液对体外培养兔膝关节软骨细胞MMP-9、TIMP-1表达的影响

目的:观察丹参注射液对体外培养兔膝关节软骨细胞MMP-9、TIMP-1表达情况的影响。方法:取12只6月龄新西兰大白兔关节软骨作体外细胞培养,培养后软骨细胞随机分为正常组、模型组、玻璃酸钠组、丹参组4组。采用Western blot法测定软骨细胞内MMP-9、TIMP-1蛋白表达,RT-PCR检测软骨细胞内MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA相对表达量。结果:Western Blot检测结果:相对正常组,OA模型组的软骨细胞组织中MMP-9、TIMP-1蛋白表达明显上调(P0.01);玻璃酸钠组MMP-9、TIMP-1蛋白表达低于空白模型组(P0.05),丹参组MMP-9、TIMP-1蛋白表达低于空白模型组(P0.01);丹参组MMP-9蛋白表达低于玻璃酸钠组,TIMP-1蛋白表达高于玻璃酸钠组。荧光定量PCR检测结果:与空白组相比,OA模型组家兔关节软骨组织MMP-9 mRNA相对表达量显著升高(P0.01),MMP-9/TIMP-1失衡;治疗后,与OA模型组相比,玻璃酸钠组、丹参组MMP-9mRNA相对表达量显著降低(P0.01),TIMP-1mRNA相对表达量显著升高(P0.01);与玻璃酸钠组相比丹参组MMP-9mRNA相对表达量显著降低(P0.01),TIMP-1mRNA相对表达量显著升高(P0.01)。结论:丹参注射液能够有效纠正MMP-9和TIMP-1在骨性关节炎软骨组织中异常表达,减轻软骨损伤,有效治疗骨性关节炎。