RGD-TAT-KDRsiRNA慢病毒载体构建及抗肿瘤活性

目的 构建精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)介导的穿膜肽(TAT)-血管内皮细胞生长因子受体(KDR) siRNA融合基因慢病毒载体,探讨其对人肺癌A549细胞的抑制效果.方法 设计合成编码RGD的2条寡核苷酸链,克隆到pGC/TAT-KDR siRNA载体的TAT下游,构建TAT-RGD-KDR siRNA融合基因载体;慢病毒包装并感染A549细胞;通过Western blot和real-time PCR检测A549细胞KDR基因表达水平;通过噻唑蓝法、双色法流式细胞仪和Transwell侵袭实验检测KDR基因沉默对A549细胞凋亡和侵袭力的影响.结果 测序和Blast比对证实重组载体中的RGD序列与设计一致;TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染A540细胞KDRmRNA和蛋白表达水平分别为(22.7±3.9)％和(19.3±2.7)％,明显低于TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染组,差异有统计学意义(P＜0.01);该载体具有较强的抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡和抑制细胞体外侵袭力的作用.结论 TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体通过抑制细胞KDR mRNA和蛋白表达,抑制A549细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡.     

靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建

目的构建靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体。方法针对人ERG基因的mRAN序列,设计特异性干扰序列,两端引入酶切位点,人工合成OligoDNA,退火后与双酶切的pLVX-shRNA2慢病毒载体质粒连接,构建慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-ERGsiRNA,通过测序鉴定连接正确后,以293T细胞包装得到荷载ERGsiRNA基因的慢病毒;根据293T细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染前列腺癌VCaP细胞株,通过实时荧光定量PCR检测ERGmRNA的表达。结果测序结果表明,靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为1.1×108TU/ml。感染VCaP细胞后,实验组和对照组相比ERGmRNA的表达水平显著降低,siRNA对ERG表达的干扰效率为87.46%。结论成功构建靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体。     

NOB1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:构建针对NOB1基因的shRNA慢病毒载体,并在卵巢癌SKOV3细胞上鉴定其沉默效率,观察其对细胞增殖能力的影响。方法:将筛选的NOB1基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与pLVTHM慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3细胞;采用Real-timePCR和Westernblot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率,MTT和克隆形成实验观察NOB1基因沉默对SKOV3细胞增殖的作用。结果:构建的shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3细胞后,NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降73.5%,蛋白表达显著抑制,同时MTT实验显示细胞增殖能力显著降低,克隆形成实验表明细胞克隆形成能力明显减弱。结论:成功构建的NOB1基因shRNA慢病毒表达载体能够在卵巢癌SKOV3细胞上有效沉默靶基因,验证了NOB1基因具有影响卵巢癌细胞恶性增殖的能力。     

含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体,以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中,包装并收集病毒,感染人胰腺癌细胞系Aspc-1细胞后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,同时利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确,包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光,RT-PCR和western blot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体,为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

腺相关病毒载体介导的人类HIF-1α基因对海马神经细胞凋亡的影响

目的构建人类缺氧诱导因子-1α(human hypoxia inducible factor,HIF-1α)的腺病毒相关载体(rAAV-HIF-1α),并观察其对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导原代培养海马神经细胞凋亡及细胞内游离钙离子浓度的影响。方法构建含人类HIF-1α基因的AVV载体rAAV-HIF-1α转染BHK21细胞并选择培养获得的G418抗性细胞,即AVV载体细胞株。以重组单纯疱疹病毒感染此细胞株获得rAAV-HIF-1α,PCR技术鉴定病毒,地高辛标记的CMV探针点杂交方法测定重组病毒滴度电泳测定病毒纯度,SDS-PAGE电泳测定病毒纯度,Aβ25-35旅导原代培养海马神经细胞凋亡。Western印迹检测目的蛋白的表达。流式细胞术分析细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。结果 PCR证实rAAV-HIF-1α内含有人HIF-1α基因序列,病毒滴度为1×1012/ml,纯度大于98%,感染原代培养海马神经细胞后能够表达目的蛋白,同时可显著降低Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡百分率及细胞内游离子浓度上调(P0.05)。结论缺氧诱导因子-1α基因转染可能通过抑制细胞内游离钙离子浓度上调使海马神经细胞对Aβ25-35产生抗凋亡作用。     

小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定。方法应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定。以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量。结果构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65×108 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达。结论成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础。     

慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建

目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株。采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0×109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的m RNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P0.05)。结论成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株。     

应用干扰RNA慢病毒技术抑制人脑胶质瘤细胞中红细胞生成素受体mRNA的表达

目的探讨重组红细胞生成素受体(EPOR)干扰RNA慢病毒抑制人脑胶质瘤细胞中EPOR mRNA的表达情况。 方法选择人脑胶质瘤U251细胞株和人胚肾293T细胞株为研究对象。利用RNA干扰技术构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,进行病毒包装、病毒收集、病毒滴度检测后,感染人脑胶质瘤U251细胞,选择最佳MOI值;采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测U251细胞和感染重组EPOR干扰RNA慢病毒的U251细胞EPOR mRNA相对表达量,并计算重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞EPOR mRNA表达的干扰效率。 结果①本研究成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,并测定其病毒滴度为1×10¹⁴TU/L。②MOI值为100的重组EPOR干扰RNA慢病毒感染U251细胞的荧光蛋白表达量最高,MOI值为1的荧光蛋白表达量最低。③重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞的干扰效率为69%,并使EPOR mRNA表达明显受到抑制。 结论成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,使U251细胞的EPOR mRNA相对表达量明显降低,为后续EPOR转录水平变化的相关研究奠定实验基础。     

RyR2-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对离体心肌细胞RyR2基因表达的影响

目的构建携带RyR2-shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠离体心肌细胞中RyR2的基因沉默效果。方法设计并合成针对小鼠RyR2基因的shDNA,克隆入含U6启动子和EGFP报告基因的慢病毒载体psiHIV-U6-eGFP,构建表达RyR2-shRNA的慢病毒载体,通过将慢病毒转移质粒和包装质粒共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体颗粒,然后离体感染小鼠心肌细胞,采用Real-timePCR检测RyR2在mRNA水平的沉默效应。结果经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功并成功包装。流式细胞仪测得重组慢病毒感染小鼠心肌细胞的阳性率达80%以上。Real-timePCR证实,重组慢病毒Lenti-siRyR2感染的小鼠心肌细胞中RyR2在mRNA水平基因抑制率达90%以上。结论成功构建了表达RyR2-shRNA的重组慢病毒表达载体,并在小鼠心肌细胞中实现有效的基因沉默效应。     

趋化因子融合蛋白SDF KDEL慢病毒载体pLenti6/V5 S K的构建和表达

目的构建含趋化因子融合蛋白SDF KDEL的慢病毒载体pLenti6/V5 S K，为研究I型人免疫缺陷病毒（HIV 1）感染的基因治疗奠定基础。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段SDF KDEL，纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5 D TOPO载体，构建慢病毒载体pLenti6/V5 S K，并在293FT细胞中建立慢病毒株，最后转染人宫颈癌HeLa细胞观察SDF 1蛋白的表达。结果成功构建了慢病毒载体pLenti6/V5 S K，并证实SDF 1蛋白可在HeLa细胞系内表达。结论慢病毒载体可介导CXC 细胞内趋化因子（CXC intrakine，SDF K）基因高效、稳定转染HeLa细胞，可用于抗HIV 1感染的基因治疗。     

Hsa miR-7慢病毒表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞HO8910-PM中表达的有效性

目的：构建Hsa miR-7的慢病毒表达载体,感染人卵巢癌细胞HO8910-PM后检测微小RNA 7（miR-7）及其靶基因血管内皮生长因子受体（EGFR）的表达,为研究miR-7在HO8910-PM中的生物学功能奠定基础。方法：将聚合酶链反应（PCR）扩增得到的miR-7前体序列pre-miR-7和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1经酶切后连接产生pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1,经酶切及测序鉴定正确后在HEK293T细胞中包装病毒,病毒浓缩后感染HO8910-PM用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测感染后的HO8910-PM中pre-miR-7和miR-7的表达,qPCR及蛋白质印迹（Western blot）方法检测其靶基因EGFR的表达。结果：酶切及测序结果示慢病毒表达载体pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒浓缩液感染HO8910-PM后能有效提高pre-miR-7的表达（t=17.909,P=0.004）和miR-7的表达（t=35.320,P=0.024）,并能有效降低其靶基因EGFR的mRNA的表达（t=8.83,P=0.005）及蛋白的表达（t=22.14,P=0.002）。结论：成功构建了pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体及稳定表达miR-7的HO8910-PM细胞亚系。     

LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体的构建及其在睾丸间质细胞的表达

目的：构建钙视网膜蛋白（CALB2）基因超表达及小干扰RNA（siRNA）慢病毒载体,观察CALB2对睾丸间质细胞雄激素合成的调节作用。方法：合成超表达及干涉的质粒,转入制备好的细菌感受态细胞,聚合酶链反应（PCR）鉴定阳性重组子后测序验证,确认构建成功的超表达及干涉慢病毒载体。用上述慢病毒载体分别感染MLTC-1及R2C间质细胞,观察感染效率,而后用放射免疫法检测睾酮和孕酮的合成。结果：PCR和基因测序证实LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体构建成功,并可高效感染MLTC-1及R2C细胞。超表达CALB2后,MLTC-1细胞睾酮生成显著增加（P＜0.001）;干涉CALB2表达后,R2C间质细胞孕酮生成显著减少（P＜0.05）。结论：成功构建了calb2基因超表达及干涉慢病毒载体,并可体外转染睾丸间质细胞系。初步结果表明,CALB2可促进间质细胞类固醇激素生成。     

H7N9禽流感病毒感染A549细胞生物标志物研究

目的通过建立H7N9禽流感病毒和H1N1pdm09流感病毒(对照病毒)感染A549细胞模型,分析H7N9禽流感病毒感染A549细胞的特征蛋白,筛选其生物标志物,初步揭示H7N9禽流感病毒致细胞病变的蛋白分子机制。方法感染复数为0.001的H7N9和对照病毒分别感染A549细胞24、48、72 h后提取细胞总蛋白进行荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE),筛选H7N9禽流感病毒感染A549细胞的可能生物标志物并进行蛋白印迹(WB)验证。结果血小板活化因子乙酰水解酶Ⅰb亚基β(PAFAH1B2)蛋白在H7N9感染A549细胞72 h后表达量急剧下降,而在空白对照组和H1N1pdm09感染A549细胞组的表达量未出现明显变化。结论 PAFAH1B2可作为H7N9感染A549细胞后期的生物标志物,其表达量的变化可能与H7N9感染患者的症状相关。     

慢病毒介导β-珠蛋白基因添加在β-地中海贫血基因治疗中的应用

目的:构建全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体,稳定转染K562细胞使得β-珠蛋白高效表达,为β-珠蛋白基因添加治疗奠定基础。方法:采用PCR扩增人正常β-珠蛋白基因,加上Sph I和Not I两个酶切位点进行T载体克隆,获得重组质粒p UC57-β-globin。用限制性内切酶连接目的基因片段和慢病毒载体,筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin,测序。将慢病毒载体转染293T细胞,包装病毒。用LV-β-globin感染K562细胞。采用流式细胞仪检测荧光效率,运用实时PCR及Western Blotting检测K562细胞中β-珠蛋白mRNA及蛋白表达情况。结果:通过PCR获得长度为2 128 bp的目的基因。连接p UC57载体和慢病毒表达载体,慢病毒表达载体LV-β-globin构建成功,序列正确。LV-β-globin转染K562细胞72 h后,显示大量绿色荧光表达,荧光效率为94.8%。β-珠蛋白mRNA 2-ΔΔCt值为4.080±0.078,高于对照组;β-珠蛋白灰度值为1.063±0.082,高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建并包装含人β-珠蛋白基因的慢病毒载体并高效稳定表达。     

亲环素A基因在非小细胞肺癌中的功能

目的 研究亲环素A(CyPA)基因在非小细胞肺癌中的功能.方法 设计并合成4对针对CyPA siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火形成双链DNA,与经Hpal和Xhol酶切后的pGCL-GFP载体连接产生Lv-shCyPA慢病毒载体,该载体含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP),经聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并测序鉴定.将Lv-shCyPA、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共感染包装细胞293T细胞,包装成假病毒颗粒并感染非小细胞肺癌A549细胞,经免疫印迹法(Western blot)检测筛选CyPAsiRNA有效靶点和慢病毒颗粒,采用流式细胞技术分析细胞周期和凋亡率,进行裸鼠移植瘤实验.结果 PCR和测序结果证实,Lv-shCyPA慢病毒载体构建正确,经Western blot法筛选最有效的CyPA siRNA病毒颗粒滴度为2×10 9TU/ml,感染A549细胞凋亡率(5.01%±0.57%)增加,细胞周期G2-M期比例(11.40%±0.68%)减少,裸鼠移植瘤瘤体生长明显减缓,与未感染病毒的A549细胞细胞凋亡率(0.35%±0.17%)及G2-M期比例(14.52%±1.19%)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CyPA基因沉默在非小细胞肺癌的发生中有一定的抑瘤作用,对非小细胞肺癌的预防和分子流行学研究提供了新的理论依据.     

慢病毒介导shRNA靶向下调过氧化物酶体增殖物激活受体α对全氟十二烷酸致大鼠肝细胞BRL 3A氧化损伤的影响

目的通过观察慢病毒介导shRNA靶向下调大鼠肝细胞BRL 3A中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)α的表达,研究PPARα在全氟十二烷酸(perfluorododecanoic acid,PFDoA)致大鼠肝脏氧化损伤中的作用。方法构建PPARα慢病毒兼容shRNA干扰载体Lenti-iPα和阴性对照载体Lenti-NC,与慢病毒包装辅助质粒共转染293FT细胞进行慢病毒包装,收集慢病毒原液后浓缩并测定病毒滴度。分为NC-组(加阴性对照病毒,不加PFDoA)、NC+组(加阴性对照病毒,加75μmol/L PFDoA)、iPα-组(加干扰病毒,不加PFDoA)、iPα+组(加干扰病毒,加75μmol/L PFDoA)。使用慢病毒处理大鼠肝BRL 3A细胞96 h,最后24 h再对NC+组、iPα+进行75μmol/L PFDoA暴露。观察BRL 3A细胞中PPARα的干扰情况及PPARα的表达在PFDoA引起活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)变化中所起的作用。结果慢病毒介导shRNA成功实现靶向下调PPARα的表达,与NC-组相比,iPα-组的大鼠肝细胞系BRL 3A中ROS平均荧光强度为12043.42±808.58,显著升高(P0.05);PPARα下游靶蛋白酰基辅酶A硫酯酶(acyl-CoA thioesterases,Acot)1的基因和蛋白表达水平(分别为0.43±0.04和0.34±0.08)均显著下降(P0.05)。PFDoA处理后,与NC+组相比,iPα+组大鼠肝细胞BRL 3A中ROS平均荧光强度为12386.25±356.36,显著上升(P0.05);Acot1的基因和蛋白表达水平(分别为0.85±0.10和0.33±0.04)显著下降(P0.05)。结论 PPARα及其下游靶蛋白Acot1在大鼠肝细胞系BRL 3A中可能起到清除ROS的作用,避免外源物质对肝脏的氧化损伤。     

应用RNA干扰沉默NOB1基因对卵巢癌HEY细胞增殖和周期的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制NOB1基因的表达,并在卵巢癌HEY细胞上观察NOB1下调对细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:NOB1特异性siRNA构建于慢病毒载体,感染卵巢癌HEY细胞后,Real-time PCR和Western验证NOB1的抑制效率,MTT、Brdu实验观察NOB1基因沉默对HEY细胞增殖的作用,PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:shRNA慢病毒感染HEY细胞能够将NOB1基因mRNA表达抑制82.2%,蛋白表达也显著降低,MTT和Brdu实验显示细胞增殖水平显著变弱,流式细胞仪检测证实细胞出现G1期阻滞。结论:应用RNA干扰技术能在HEY细胞上有效沉默NOB1基因,并降低卵巢癌细胞的增殖能力,使细胞阻滞在G1期。