不同发育阶段大鼠睾丸中Calretinin的表达

目的：Calretinin（CALB2）是一种钙结合蛋白。前期研究表明,CALB2可表达于人睾丸组织,推测其参与睾丸功能的调节。本研究观察不同发育阶段大鼠睾丸中CALB2的表达水平,探讨其在调节雄激素生成中的作用。方法： 3～4周龄SD雄性大鼠作为性发育前组（相当于人类的青春期前,n=35）,16周龄SD鼠作为性成熟组（相当于人类的成年期,n=16）,12个月以上的作为老年组（相当于人类男子的中老年,n=10）。放射免疫法测定各组血清睾酮浓度;免疫组织化学法观察CALB2的定位表达;定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分别检测睾丸中CALB2 mRNA和蛋白水平的表达。结果：CALB2表达定位于睾丸的间质细胞,细胞内定位于细胞质中。性发育前组大鼠血清睾酮水平最低,性成熟组最高,差异有统计学意义（P＜0.05）。性成熟组大鼠睾丸CALB2的表达水平较性发育前组和老年组均升高（P＜0.05）。结论：睾丸组织中,CALB2表达于间质细胞的细胞质;在不同发育阶段,睾丸间质细胞CALB2表达水平与血清睾酮水平呈正相关,表明CALB2参与调节雄激素生成。     

睾丸雄激素合成的调节机制及其研究进展

睾丸能产生精子和合成雄激素,前者在生精小管完成,后者由睾丸间质细胞(Leydig cell)完成.雄激素在促进男性性分化、青春期发育、维持第二性征和性成熟、维持男性生育等方面发挥重要作用.间质细胞合成雄激素功能受下丘脑-垂体-睾丸轴调控,经典的分子信号通路是黄体生成激素-黄体生成激素受体-环磷酸腺苷-蛋白激酶A(LH-LHR-cAMP-PKA)途径;实际上,雄激素合成还受睾丸内旁分泌、自分泌甚至细胞内分泌形式的局部调节,如泌乳素、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、转化生长因子α(TGF-α)、TGF-β等;除cAMP外,Ca2+也是第二信使,钙调蛋白参与调节雄激素合成.     

SET蛋白对精母细胞株(GC-2 spd)增殖和组蛋白乙酰化的影响

目的:观察SET蛋白对GC-2 spd精母细胞株增殖和组蛋白乙酰化的影响,探讨SET蛋白调节精子形成的作用。方法:体外培养GC-2 spd细胞,通过精母细胞标志物乳酸脱氢酶C(LDHC)和睾丸特异激酶1(TESK1)鉴定。琼脂糖珠免疫共沉淀试剂盒检测SET蛋白与组蛋白H4的结合。分别转染空载腺病毒(Ad H1-si RNA/NS,对照组)和SET干涉腺病毒(Ad H1-si RNA/SET,干涉组),比较细胞增殖情况,荧光显微镜观察GC-2spd细胞中SET蛋白的表达;用实时定量逆转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测m RNA以及蛋白的表达。结果:免疫荧光显示精母细胞株GC-2 spd阳性表达LDHC和TESK1;SET蛋白表达于GC-2细胞的胞核和胞质中,免疫共沉淀提示SET蛋白与组蛋白H4结合。转染SET干涉腺病毒后,核内和胞质中SET蛋白表达明显降低(P0.01)。与对照组相比,干涉组细胞增殖明显降低,组蛋白H4乙酰化水平明显增高(P0.05);但组蛋白乙酰化酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)m RNA表达水平差异无统计学意义(P0.05)。结论:精母细胞核内和胞浆中均表达SET蛋白;SET蛋白降调,则抑制GC-2spd细胞增殖。SET蛋白可能通过与组蛋白H4相互作用调节其乙酰化,参与调节精子形成。     

卵母细胞代谢及其调节

卵母细胞发育与成熟过程依赖大量ATP,因此物质代谢旺盛。卵母细胞以葡萄糖和/或其中间产物丙酮酸为底物,在线粒体内氧化磷酸化,产生大量ATP,是卵母细胞最主要的供能形式。但是,卵母细胞糖代谢模式有种属特异性差异。同时,卵母细胞也存在脂肪酸和氨基酸的代谢。除提供能量外,这些代谢产物在细胞信号传导、渗透压调节等方面也有重要作用。卵母细胞代谢的精确调控受多方面因素的影响如卵母细胞胞内、胞间、胞外的调控等。研究卵母细胞代谢及其机制,对探寻改善卵母细胞质量、提高卵母细胞体外成熟效能具有重要的意义。     

SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响

目的探讨SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响。方法使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5%CO2条件下培养GC-1spg细胞,分对照组(转染无关序列腺病毒)和实验组[转染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)];GC-1spg接种于96孔板或者6孔板,转染腺病毒48h、72h后收集细胞,免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检测SET蛋白在GC-1spg细胞中的表达与定位;提取细胞总蛋白,Western Blot检测转染前后SET蛋白的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法检测细胞的数目和增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 SET蛋白表达于GC-1spg细胞的胞核和胞浆中,且胞浆分布多于胞核;转染SET干涉腺病毒后,干涉组GC-1spg细胞中的SET蛋白相对表达量为(0.217±0.044)显著低于对照组的(0.629±0.170)(P0.05),同时GC-1spg细胞的数目减少,增殖减慢,且细胞凋亡率显著增加[干涉组(21.663±1.287)%,对照组(8.813±0.671)%](P均0.01)。结论SET蛋白在精原细胞GC-1spg胞核和胞浆中均有表达,且胞浆分布多于胞核;GC-1spg细胞中SET蛋白表达降低,能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,提示SET蛋白可能参与调节精子发生的过程。     

睾丸间质干细胞分化和移植

睾丸间质细胞是男性体内合成雄激素的主要细胞,胚胎发育期中肾胚的间质细胞及生精小管周成纤维样细胞可能是睾丸间质细胞的干细胞。在胚胎期间质干细胞分化为胎儿型间质细胞;出生后间质干细胞经间质祖细胞、未成熟间质细胞分化为成熟间质细胞。老年期间质细胞数量可能不变,但雄激素合成下降。间充质干细胞及脂肪干细胞等干细胞经诱导可分化为分泌雄激素的睾丸间质细胞,因此,间质干细胞移植可望成为治疗男性性腺功能不全和中老年雄激素缺乏的创新方法,本文对睾丸间质干细胞的分化及移植方面研究进行综述。     

腐胺提高高龄小鼠卵母细胞质量及其机制的研究

目的本研究探讨腐胺是否通过抗氧化应激的机制提高体外培养的高龄卵母细胞的质量。方法从9月龄C56/B6J雌鼠获取GV期卵丘-卵母复合体(COC),分为对照组、0.5mmol/L腐胺处理组、0.5mmol/Lα-二氟甲基鸟氨酸(DFMO,腐胺抑制剂)组。三组COC体外培养液16～18h,收集MⅡ期卵母细胞。计算各组高龄卵母细胞成熟率,检测卵母细胞mtDNA拷贝数,JC-1荧光分析染色线粒体膜电位,并分析卵母细胞内氧自由基和超氧化物歧化酶1(SOD_1)的表达。结果腐胺组卵母细胞成熟率显著高于对照组[(87.57±1.70)%vs.(66.02±4.05)%,P0.01]。DFMO处理组线粒体DNA拷贝数显著高于对照组(P0.05)。与对照组相比,腐胺组卵母细胞内氧化应激水平显著下降(P0.01);DFMO组氧化应激水平显著升高(P0.01)。与对照组比较,腐胺组卵母细胞线粒体膜电位显著升高(P0.01),而DFMO组显著下降(P0.05)。与对照组比较,腐胺组卵母细胞内SOD_1蛋白表达显著增高(P0.05),DFMO组显著下降(P0.05)。结论体外培养的高龄卵母细胞,腐胺通过抗氧化应激、改善线粒体功能提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能,具有潜在的临床应用价值。     

间质细胞增殖的睾丸内局部调节因子

睾丸间质细胞是男性体内合成雄激素的主要组织细胞.胎儿期睾丸间质细胞从间质前体细胞分化形成,出生后出现由间质干细胞分化形成的第二代睾丸间质细胞,青春期的间质细胞则是由多能间质前体细胞分化而来,经历前体睾丸间质细胞、不成熟睾丸间质细胞、成熟睾丸间质细胞3个不连续的成熟阶段.胎儿期及出生后间质细胞的分化、增殖、发育受多种因素的调节,包括性别决定基因Y、神经细胞黏附分子、转化生长因子、抗苗勒管激素(AMH)等调节;出生后的睾丸间质细胞增殖、发育、成熟除受黄体生成激素调节外,受睾丸局部的雄激素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)及自身合成的钙视网膜结合蛋白(calretinin)等因子的调节.     

LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体的构建及其在睾丸间质细胞的表达

目的：构建钙视网膜蛋白（CALB2）基因超表达及小干扰RNA（siRNA）慢病毒载体,观察CALB2对睾丸间质细胞雄激素合成的调节作用。方法：合成超表达及干涉的质粒,转入制备好的细菌感受态细胞,聚合酶链反应（PCR）鉴定阳性重组子后测序验证,确认构建成功的超表达及干涉慢病毒载体。用上述慢病毒载体分别感染MLTC-1及R2C间质细胞,观察感染效率,而后用放射免疫法检测睾酮和孕酮的合成。结果：PCR和基因测序证实LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体构建成功,并可高效感染MLTC-1及R2C细胞。超表达CALB2后,MLTC-1细胞睾酮生成显著增加（P＜0.001）;干涉CALB2表达后,R2C间质细胞孕酮生成显著减少（P＜0.05）。结论：成功构建了calb2基因超表达及干涉慢病毒载体,并可体外转染睾丸间质细胞系。初步结果表明,CALB2可促进间质细胞类固醇激素生成。