pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒,为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础.方法:以本实验室构建保存的pcDNA3.1 hKDR为模板,PCR扩增hKDR(Ig1-3)cDNA片段后用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中,经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性,然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA,用脂质体转染COS-7细胞,经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白.结果:PCR、酶切和测序证实pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)构建成功,体外转录出相应的mRNA,免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达.结论:成功构建含pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)的真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

pmRNA IRWS-hKDR重组质粒的构建、表达及鉴定

目的利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR重组质粒载体,为肿瘤的基因治疗研究奠定基础.方法利用本实验室保存的pDC520 hKDR用XbaⅠ和NcoⅠ顺序酶切,pmRNA IRES-Luc亦用XbaⅠ和NcoⅠ顺序酶切,通过分子生物学技术构建了pmRNA IRES-hKDR重组质粒,用PCR、酶切鉴定,然后用脂质体转染Hepall-6细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果重组质粒中含有pmRNA IRES-hKDR基因,转染Hepall-6细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用Westem blot检测证明能与特异性hKDR抗体结合.结论成功构建含pmRNA IRES-hKDR真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

反义PCDNA3.1(+)/TIMP-1真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒。方法：用Trizol Reagent抽提肝组织中总RNA．采用两对套式引物，以逆转录巢式PCR方法扩增TIMP-1目的片段，双酶切纯化PCR产物及PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒。再将TIMP-1反向插入PCDNA3.1（＋）线性质粒，即构建成反义TIMP-1／PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定。结果：DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论：反义TIMP-1／PCDNA3．1（＋）真核细胞表达质粒构建成功。     

Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及其表达特点

目的：构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒，并在Hela细胞中表达以研究蛋白的定位和分泌特点。方法：以pGEM—T—MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC），并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上，得到pDsRed2-N1—mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法转染Hela细胞，进行荧光显微镜观察，并用Western Blot分析蛋白分泌情况。结果：经酶切和DNA序列测定，证实重组质粒构建成功，mMYOC基因能在Hela细胞中表达，并且蛋白只定位在细胞质中，经Western Blot分析，mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论：成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1—mMYOC，并能有效表达，其表达的蛋白定位在细胞质，并且不能分泌。     

丙型肝炎病毒IRES基因T载体克隆及序列分析

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）核糖体插入位点（IRES）序列的基因克隆,为以后的亚克隆和抑制肝炎病毒作用的研究提供实验材料。方法以含HCV全长基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出HCV的IRES序列,将扩增产物IRES基因插入到PMD18T载体后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果经PCR获得355bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为99%。结论该实验成功构建了含HCV IRES基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆。     

STAT3基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带信号传导和转录激活子3(STAT3)基因短发夹状干扰RNA(shRNA)的真核表达载体.方法 从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamH Ⅰ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,PCR筛选阳性克隆,并行测序鉴定.重组质粒转染大肠癌LoVo细胞,RT-PCR检测STAT3的表达.结果 PCR和测序证实重组质粒构建正确.3种重组质粒对大肠癌LoVo细胞STAT3的表达有较强的抑制作用.结论 成功构建了携带有STAT3基因的短发夹状干扰RNA的重组质粒.     

人肺癌转移相关蛋白1重组慢病毒载体的构建和病毒包装及其鉴定

目的构建人肺癌转移相关蛋白1（LCMR1）重组慢病毒载体,并包装慢病毒颗粒,为进一步研究该基因在人肺癌发生发展中的功能提供实验基础。方法将人肺癌转移相关基因LCMR1扩增后,酶切连接构建人pLVX—IRES—Neo病毒载体,转化DH5a大肠杆菌,挑取阳性克隆测序鉴定,将重组质粒与慢病毒系统一起转染Lenti—X293T病毒包装细胞,并将收集的病毒感染肺癌细胞系95C,即时定量聚合酶链反应（q—PCR）及蛋白质印迹法验证其表达情况。结果DNA测序结果证实成功构建人LCMR1重组慢病毒载体,包装后的病毒浓缩液浓度可达2．5×10^8IFU／ml以上。包装后的病毒颗粒感染95C细胞系,LCMR1的mRNA水平提高9．98倍（P〈0．05）,蛋白水平的表达也明显增强。结论本研究成功构建了pLVX—IRES—LCMR1-Neo慢病毒载体,获得的慢病毒颗粒有效感染肺癌细胞系95C,为研究该基因在肺癌中的功能建立了模型。     

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术（重叠延伸PCR）并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES（internal ribosome entry site）的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备.方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3＇端与IRES基因5＇端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段.结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段.结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值.     

OX40Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究

目的 构建含OX40融合蛋白（OX40Ig）基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）即ADSCsOX40Ig,探讨其 在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法 构建pcDNA3.1（+）/OX40Ig融合基因表达载体,采用核转染技术转染大 鼠ADSCs,Western blot检测ADSCs中OX40Ig表达水平。ADSCs与大鼠异基因淋巴细胞共培养后分为对照组（反应 细胞+刺激细胞）、ADSCs组（反应细胞+刺激细胞+ADSCs）及ADSCsOX40Ig组（反应细胞+刺激细胞+ADSCsOX40Ig）,MTT法 检测淋巴细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测淋巴细胞内干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-10及 转化生长因子（TGF）-β mRNA表达。结果 经测序鉴定验证,pcDNA3.1（+）/OX40Ig质粒构建成功,转染ADSCs后 OX40Ig蛋白呈高表达;与ADSCs组比较,ADSCsOX40Ig显著增强异基因淋巴细胞增殖抑制率（P＜0.05）;对照组、ADSCs 组及 ADSCsOX40Ig组的 IFN-γ mRNA 相对表达水平依次降低,而 IL-10、TGF-β mRNA 相对表达水平依次升高（P＜ 0.05）。结论 ADSCsOX40Ig较单纯ADSCs能更好地发挥对异基因淋巴细胞的免疫调节作用。     

凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列反义核酸在血管内皮细胞中的作用研究

目的探讨TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HU-VECs)生长活性、增殖活性影响。方法构建TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA真核表达载体(pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ),经双酶切、测序及Western blot鉴定后,转染HUVECs。采用MTT法检测转染后HUVECs活性改变,流式细胞仪检测转染后HUVECs周期变化,透射电镜观察转染后HUVECs形态学改变。结果构建的pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ经鉴定后转染HUVECs,MTT法检测所得HUVECs OD值较未转染组、pcDNA3.1-空载体转染组升高(均P<0.01);流式细胞仪检测结果显示:pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ转染HUVECs后S+G2(%)较未转染组、pcDNA3.1-空载体转染组S+G2(%)延长(均P<0.01);透射电镜结果显示:pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ转染后HUVECs核仁相对增多。结论TSP-1反义RNA能够促进HUVECs增殖和生长。     

不同免疫球蛋白启动子控制的白喉毒素A链基因对淋巴瘤细胞的抑制作用

目的 比较免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子和免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链基因对淋巴瘤细胞生长抑制.方法 将白喉毒素A链基因或细菌β半乳糖苷酶基因与免疫球蛋白启动子/增强子相连构建成白喉毒素A链真核表达载体pcDNA3IgκDTA、pcDNA3IgHDTA或细菌β半乳糖苷酶真核表达载体pcDNA3IgκLacZ、pcDNA3IgHLacZ.由脂质体介导将质粒转染至产或不产免疫球蛋白的真核细胞中,检测β半乳糖苷酶基因在不同细胞中的表达水平,并进一步检测白喉毒素A链基因的表达对转染细胞的生长抑制作用.结果 由免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子或免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的β半乳糖苷酶基因只能在产免疫球蛋白(κ轻链型)细胞株CA46中表达.当β半乳糖苷酶基因与质粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA共转染时,β半乳糖苷酶基因的表达只在CA46细胞中被抑制.质粒pcDNA3IgκDTA、pcDNA3IgHDTA的表达均能明显抑制CA46细胞的生长,而对照质粒pcDNA3IgκLacZ或pcDNA3IgHLacZ对CA46细胞则无明显作用,并且pcDNA3IgκDTA的抑制作用较pcDNA3IgHDTA更强.结论 由免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子或免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链基因的表达能特异性地杀伤产免疫球蛋白(κ轻链)的肿瘤细胞.并且免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子较免疫球蛋白重链启动子/增强子有更强的启动转录活性.     

分泌型丛生蛋白通过抑制线粒体自噬缓解H2O2诱导的心肌细胞损伤 #br#

目的 探讨分泌型丛生蛋白（sCLU）对心肌细胞氧化损伤的影响及其机制。方法 采用大鼠心肌细胞 H9C2。实验1分为Control组（仅更换培养基）和H2O2组（100 µmol/L H2O2处理）。实验2分为Control组、pcDNA3.1组 （转染 pcDNA3.1 对照空质粒）、pcDNA3.1-sCLU 组（转染 pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒）、H2O2组（100 µmol/L H2O2处 理）、H2O2+pcDNA3.1 组（pcDNA3.1 对照空质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU 组 （pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）。实验 3 分为 DMSO 组（加入 1% 体积分数 的 DMSO）、Mdivi-1 组（10 µmol/L 的 Mdivi-1 处理）、H2O2+DMSO 组（加入 1% 体积分数的 DMSO 处理 30 min 后加入 100 µmol/L的H2O2处理）、H2O2+Mdivi-1组（10 µmol/L的Mdivi-1处理30 min后加入100 µmol/L的H2O2处理）、H2O2+ pcDNA3.1-sCLU 组（pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48 h后加入10 µmol/L的Mdivi-1处理30 min,再加入100 µmol/L H2O2 处理）。采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二 醛（MDA）水平。DFCH-DA荧光探针测定细胞活性氧（ROS）水平。实时定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验 检测细胞中sCLU表达,Western blot法检测CLU、PINK1、Parkin和LC3蛋白表达水平。结果 （1）实验1。与Control 组比较,H2O2组细胞中sCLU mRNA、细胞培养上清中sCLU蛋白及细胞中CLU蛋白相对表达水平均降低（P＜0.01）。 （2）实验2。与Control组比较,H2O2组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低,细胞凋亡率、ROS水平、MDA 水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均升高（P＜0.05）;与H2O2组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU组细胞活力、SOD水平、 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高,细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。（3） 实验3。与DMSO组比较,Mdivi-1组细胞活力与细胞凋亡率差异无统计学意义;H2O2+DMSO组细胞活力下降,细胞 凋亡率升高（P＜0.05）。与H2O2+DMSO组比较,H2O2+Mdivi-1组、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1 组细胞活力均升高,细胞凋亡率均下降（P＜0.05）。与 H2O2+Mdivi-1 组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU 组和 H 2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力差异无统计学意义,细胞凋亡率降低（P＜0.05）。结论 sCLU对氧化应 激条下的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与线粒体自噬的抑制有关。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

芬太尼通过 ILF3-AS1/miR-132对卵巢癌细胞生长和转移的影响

目的探讨芬太尼对卵巢癌细胞生长和转移的影响及分子机制。方法 2018年 8月至 2019年 10月,体外培养卵巢癌细胞 A2780,用浓度分别为 0、0.5、5、50、500 ng/mL的芬太尼处理,作为不同浓度芬太尼处理组。将过表达的白细胞介素增强结合因子 3反义 RNA1(ILF3-AS1)(pcDNA3.1-ILF3-AS1、对照 pcDNA3.1)、抑制微小 RNA(miRNA/miR)-132表达(抗 -miR-132、对照 anti-miR-NC)的载体分别转染 A2780细胞,并以 500 ng/mL芬太尼处理,记为芬太尼 500+pcDNA3.1-ILF3-AS1组、芬太尼 500+pcDNA3.1组、芬太尼 500+anti-miR-132组、芬太尼 500+anti-miR-NC组。将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、si-NC、si-ILF3AS1转染至 A2780细胞中,记为 pcDNA3.1组、 pcDNA3.1-ILF3-AS1组、 si-NC组、 si-ILF3-AS1组。四甲基偶氮唑盐比色法( MTT)检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞克隆形成数; Transwell检测细胞迁移和侵袭;实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测 ILF3-AS1和 miR-132的表达水平;荧光素酶报告实验检测 ILF3-AS1和 miR-132的靶向关系。结果与 0 ng/mL芬太尼处理组相比, 5、50、500 ng/mL的芬太尼处理的 A2780中 miR-132表达水平显著升高［( 1.39±0.13)、(1.68±0.17)、(2.34±0.23)比( 1.00±     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究#br#

目的　构建含可诱导共刺激分子（ICOS）融合蛋白（ICOSIg）基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）中表达。方法　克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1（+）/ICOSIg。经测序鉴定后转染ADSCs,Western blot法检测ICOSIg在ADSCs中的表达。结果　经测序鉴定验证pcDNA3.1（+）/ICOSIg质粒构建成功,且能在ADSCs中成功表达。结论　ICOSIg在ADSCs中成功表达,为进一步研究免疫耐受机制提供了实验基础。