二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的 从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法 树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果 树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero 和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论 对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法,为树鼩的质量控制提供检测方法。方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒,经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)。根据GenBank中已发表的MRV L1基因的保守区域,设计合成巢式引物,对所分离的三株树鼩呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT-nPCR扩增,优化反应条件,进行特异性、敏感性试验。应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测。结果针对分离到的三株树鼩呼肠孤病毒的RNA进行RT-nPCR扩增,均得到513 bp的特异性目的片段,培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带。敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0.01 pg/μL。25只树鼩粪便样本经RT-nPCR检测,有14只TRV阳性,其中死亡动物组10只,检出率为100%;存活动物组15只,检出率为27%。结论建立的TRV RT-nPCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于TRV的常规检测。     

呼吸道合胞病毒蛋白G基因l核苷酸分析

目的:对河南省呼吸道合胞病毒(RSV)进行分离与鉴定.方法:选择2006年冬季至2007年春季河南省部分医院急性呼吸道感染患者,采集咽拭子,利用Hep-2细胞和Vero细胞进行病毒分离,对分离株用特异性RTPCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行蛋白G全基因序列测定,并进行同源性分析,构建基因进化树.结果:共分离到4株RSV毒株,各分离株之间核苷酸同源性92%～99%;与A型RSV标准参考株的核苷酸同源性为86%～92%,与B型RSV标准株的同源性为70%.结论:2006年河南省RSV流行株为A型.     

浙江省萧山区轮状病毒A组G型和P型基因同源性比较与进化分析

目的分析浙江省萧山区婴幼儿急性腹泻患者中分离的轮状病毒A组G型、P型的基因序列,探讨该病毒的遗传变异和分子特性。方法收集2010年6～12月浙江省萧山区急性婴幼儿（≤5岁）腹泻患者粪便标本,应用多重PCR技术从临床标本中扩增轮状病毒A组G型、P型基因片段并测序分析,比较基因的亲缘关系并绘制进化树。结果162例粪便样本,ELISA结果为54例阳性。PCR检测结果G1型为32株,G2为5株,G3为9株,P型中,P4为3株,P8为5株,成功地对16例A组轮状病毒基因进行测序。2010年A组轮状病毒基因的核苷酸序列与参考株具有较高的同源性,且A组基因核苷酸序列发生了一定的变异。结论轮状病毒A是引起浙江萧山地区急性腹泻的主要的病原之一,其病原具有基因型别的多样性,Gl型可能是2010年浙江萧山地区流行的优势株。     

宁夏2004-2007年流行麻疹野病毒基因特征分析

目的了解宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒分离株基因特征,为控制、消除麻疹提供科学依据。方法用B95a、Vero/Slam细胞从疑似麻疹暴发和散发患者的标本中分离麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从分离到的麻疹病毒中扩增出核蛋白(nucleoprotein,N)基因C末端676个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析。结果分离的36株麻疹野病毒全部为H1基因型H1a亚型。36株麻疹野病毒的核苷酸同源性为96.2%-100.0%,氨基酸同源性为94.0%-100.0%。宁夏14株麻疹病毒代表株与中国S191疫苗株的核苷酸同源性为91.0%-92.5%,氨基酸同源性为85.4%-89.4%。结论宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒为H1基因型H1a亚型,未发现其它基因亚型。H1a基因亚型病毒株引起了多个传播链造成宁夏各市的麻疹流行。     

人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的 探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法 采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果 分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×10⁵ TCID₅₀/mL。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论 确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。     

形觉剥夺树鼩视皮质17区的可塑性

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性.方法 通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定.用EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况.结果 通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞.EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似.结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台.     

河北省首例D8基因亚型麻疹病毒株的分子流行病学分析

目的开展麻疹患者的病原学和分子监测,加强麻疹病毒基因型的监测。方法利用Vero/SLAM细胞(淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞),按常规方法分离病毒;利用RT-PCR扩增麻疹病毒N基因,然后测序并构建基因亲缘性关系树。对麻疹疫苗株S191和此次分离的D8野毒株进行抗体中和试验,计算中和抗体滴度,比较疫苗对不同毒株的保护效果。结果该麻疹病毒分离株与世界卫生组织(WHO)D8基因亚型参考株在基因亲缘性关系树上同属1个分支,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.7%和97.3%;与2019年第44周我国香港监测到的D8基因亚型麻疹病毒流行株的核苷酸和氨基酸相似性均为100%。所选血清标本对麻疹疫苗株和此次分离的D8野毒株的中和抗体几何平均滴度分别为1∶50.80和1∶40.32,中和抗体滴度无明显差异。结论河北省首次监测到输入型D8基因亚型麻疹患者。     

小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白（VP1）基因测序分析

目的 对来自广东地区感染小鼠诺如病毒（Murine Norovirus,MNV）的小鼠进行病毒分离鉴定,对病毒的衣壳蛋白（VP1）基因进行测序和序列分析,绘制系统发生树,了解广东地区MNV的分子遗传特征和进化来源。方法 采用RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T 载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15 株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果 从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7~100%和94.8~100%之间, 15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5~92.9%和92.4~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B 的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、 Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论 成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。     

犬副流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析

目的分离并鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对该病毒N、HN和F基因进行序列分析,研究其遗传变异情况;为CPIV诊断、治疗以及预防奠定分子生物学基础。方法用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺组织,盲传3代,观察病变情况,收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性以及形态学观察。同时,用3对特异性引物,扩增N、HN和F全基因,进行序列测定和分析,并制作系统进化树。结果从犬肺中成功分离出一株犬副流感病毒,并命名为QF20100726。该病毒能凝集豚鼠、猪、鸡和人O型血,电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明,与人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒基因相比,N基因核苷酸同源性为95.7%~99.8%,氨基酸同源性为97.4%~99.6%,其中有两处氨基酸发生新的变异,分别是第257位由V变成了A,第301位由A变成了T;HN基因核苷酸同源性为95.5~99.8%,氨基酸同源性为96.3~99.6%,F基因核苷酸同源性为94.7%~99.6%,氨基酸同源性为95.6%~99.3%。有两处发生特异变异,分别是56位由T变成了S,89位由T变成了M。结论成功分离犬副流感病毒QF20100726分离株,其血凝特性及超微形态特征均符合CPIV特性,N、HN和F全基因生物进化树显示,该分离株与犬副流感病毒分离株08-1990(登录号:KC237063)亲缘关系最近;N基因氨基酸在第257位(由V变成了A)和第301位(由A变成了T),F基因氨基酸在第56位(由T变成了S)和89位(由T变成了M)发生了特异性变异。这些数据将为CPIV的防控奠定基础。     

戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖

目的 探索戊型肝炎病毒（HEV）敏感细胞及体外培养条件。为HEV体外研究提供基础。方法 用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化。超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞（包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞（非洲绿猴肾细胞Vero)。通过细胞病变观察,RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果 KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7-9d出现细胞病变,11-13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela,Vero细胞未见细胞病变,分别于2-4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论 在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感。本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。     

树鼩粪便细菌分离培养与鉴定

目的 了解人工饲养树鼩粪便菌群多样性,为树鼩的正常饲养繁殖和微生物质量控制标准化提供依据。方法 随机采集10份树鼩粪便样品,利用有氧及厌氧培养基进行细菌分离培养,提取细菌基因组DNA后PCR扩增16SrRNA基因并测序鉴定。结果 本实验从树鼩粪便样品中,经有氧培养分离鉴定出25株、12种细菌,经厌氧培养分离鉴定出25株、10种细菌,包括变形杆菌属、肠球菌属、埃希菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、气单胞菌属、拉恩氏菌属、拉乌尔菌属、微小杆菌属、链球菌属、明串珠菌属。结论 树鼩肠道好氧菌及厌氧菌具有丰富的种属多样性,普通变形杆菌群、费格森埃希菌群和屎肠球菌群可能是树鼩肠道的主要寄生菌群。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

风疹病毒的分离

自24例风疹症状典型的患儿咽拭中,经PRK细胞盲传后转种至RK_(13)及BhK_(21)细胞上出现明显的细胞病变,在MK_2细胞上对HSV-1型病毒攻击呈干扰现象者为阳性,分离出6株风疹病毒,命名为济南风疹病毒JRV_5、JRV_(11)、JRV_(13)、JRV_(18)JRV_(20)及JRV_(23)。     

FURTHER STUDIES ON THE ETIOLOGY OF AUTUMN INFANT GASTROENTERITIS

This article deals with further studies on the etiology of a larger series of autumn infant gastroenteritis (AIG) in Beijing in 1979. Fecal samples were collected from 126 and 52 cases in 2 hospitals. The positive rate of rotavirus detected by simple direct electron microscopy (EM) was 38.1To in l hospital and 19.2'70 in the other. Ultrasections were made from fecal sediment of the cases with negative findings by simple direct EM. The positive rate of rotavirus detected by ultrasection EM was 75.670 in 1 hospital and 5270 in the other. The total detec- tion rate obtained by the combined use of these 2 methods reached 84.970 in l hospital. In 1 hospital, adenovirus was found simultaneously with rotavirus in 3 and singly in 2. In the other hospital, adenovirus was found simultaneously with rotavirus in l. Paired sera were obtained from 49 cases, of which 37 ('75.5'/o) showed a 4-fold or higher rise in complement-fixing (CF) antibody to rotavirus, mostly a 32-fold or higher rise. Single convales- cent phase sera were obtained in 6 cases which all gave high rotavirus CF antibody titers. Fecal samples were inoculated into primary thesus monkey kidney monolayer cell cultures for virus isolation. Apart from isolation of a Type 19 ECHO virus strain from l case, addition of trypsin to the fecal samples, maintenance media or both showed no cytopathic changes. A crude extract of a rotavirus particle- positive fecal sample was fed t0 4 newborn pig- lets and one 3-month-old thesus monkey, none of which developed diarrhea. Fecal samples of 133 0f the 178 cases were cultured for bacteria. Only 8 cases (670) showed pathogenic Escherichia coli growth.     

我国肠道腺病毒的分离与鉴定

在国内首次从腹泻患儿粪便标本中分离得到一株病毒８６－１２３，其感染Ｇｒａｈｍ２９３细胞后，出现明显的细胞病变；进一步用电镜和Ｇａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｄｅｎｏｃｌｏｎｅ－ｔｙｐｅ４０／４１特异性诊断试剂盒检测，结果证明８６－１２３为肠道腺病毒，该工作为肠道腺病毒感染的预防和诊断及其病原学研究打下了坚实的基础。     

口服免疫球蛋白对轮状病毒肠炎患儿肠道SIgA分泌的影响

目的 了解口服免疫球蛋白对儿童轮状病毒肠炎的临床疗效,探究其对患儿肠道自身分泌型IgA(SIgA)生成的影响。方法 纳入本院确诊的轮状病毒肠炎患儿100例,采用随机对照试验方法分为两组（对照组和口服免疫球蛋白组）,每组50例患儿。在口服蒙脱石散和补液等基本治疗的基础之上,对照组予安慰剂口服,免疫球蛋白组予“抗轮状病毒鸡卵黄IgY”口服治疗。于治疗第1、3、5、7、9、11 d收集患儿大便,定期记录临床症状。采用放射免疫法定量检测大便SIgA水平,双抗体夹心酶联免疫法半定量检测大便轮状病毒排泄量。 结果 治疗1 d后,口服免疫球蛋白组患儿腹泻频次较对照组明显减轻（P<0.05）。口服免疫球蛋白组病程为（4.5±0.92） d,对照组为（5.8±1.68） d,两组差异有统计学意义（P=0.015）。口服免疫球蛋白组患儿大便中SIgA含量在各时间点均高于对照组（P<0.05),口服免疫球蛋白组大便SIgA含量倍增时间在第3 d,对照组在第5 d。口服免疫球蛋白组的大便轮状病毒排泄量在各时间点均低于对照组（P<0.05）。 结论 口服免疫球蛋白能促进机体自身SIgA生成,有益于肠道内轮状病毒的清除,从而快速缓解轮状病毒肠炎临床症状,缩短病程。