解脲脲原体的DNA模板制备方法的研究比较

目的:从蛋白酶K法,酚-氯仿法,双蒸水煮沸裂解法中遴选出提取UuDNA的较好方法。方法:分别以双蒸水煮沸裂解法,蛋白酶K法(PK法)及酚-氯仿提取法提取UuDNA模板并作比较。结果:PK法及酚-氯仿提取法比较两法无差异,双蒸水煮沸裂解法与酚-氯仿提取法比较前者敏感率较低。结论:应用PCR检测Uu,PK法及酚-氯仿法均可用于UuDNA模板的提取,而双蒸水煮沸裂解法不主张应用。     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

不同核酸提取法对HCMV-DNA准确定量的影响

目的评价不同核酸提取法对人巨细胞病毒核酸(HCMV-DNA)荧光定量PCR准确定量的影响。方法含HCMVAD169株病毒颗粒的病毒培养物,以不同浓度分别与10份健康人HCMV-DNA阴性血浆标本混合;另取15份临床移植患者HC-MVpp65抗原血症阳性血浆样本,上述2种标本分别用碱裂解吸附法、沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿抽提法提取病毒核酸模板,随后运用荧光定量聚合酶链反应对样本进行定量分析,并作评价。结果15例临床检测阳性血浆标本中,酚-氯仿法提取效率为最高(P<0.05),换算后其相对提取效率为100%,而沉淀煮沸裂解法为90%,碱裂解吸附法为65%;此外,沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿法的重复性均好于碱裂解吸附法,变异系数(CV)值分别为0.26、0.30和0.39。结论经典、传统的酚-氯仿抽提法仍不失为实验室首选的核酸提取方法。     

不同核酸提取法对HCMV-DNA准确定量的影响

目的 评价不同核酸提取法对人巨细胞病毒核酸(HCMV-DNA) 荧光定量PCR准确定量的影响.方法 含HCMV AD169株病毒颗粒的病毒培养物,以不同浓度分别与10份健康人HCMV-DNA阴性血浆标本混合;另取15份临床移植患者HCMVpp65抗原血症阳性血浆样本,上述2种标本分别用碱裂解吸附法、沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿抽提法提取病毒核酸模板,随后运用荧光定量聚合酶链反应对样本进行定量分析,并作评价.结果 15例临床检测阳性血浆标本中,酚-氯仿法提取效率为最高(P＜0.05),换算后其相对提取效率为100%,而沉淀煮沸裂解法为90%,碱裂解吸附法为65%;此外,沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿法的重复性均好于碱裂解吸附法,变异系数(CV)值分别为0.26、0.30和0.39.结论 经典、传统的酚-氯仿抽提法仍不失为实验室首选的核酸提取方法.     

快速提取基因组DNA鉴定转基因鼠

采用PCR方法快速鉴定转基因鼠是目前较为常用的方法。但剪取鼠尾提取DNA做模板则较为费时、费力，它需要蛋白酶K消化过夜，然后酚／氯仿抽提等程序，这对大批量筛选转基因鼠来说，工作量相当巨大。     

热变性法处理HCVRNA模板直接扩增

采用低浓度２－巯基乙醇作为裂解剂，配合高热变性处理血清等标本中丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶＲＮＡ）模板，将裂解上清直接逆转录，使ＨＣＶＲＮＡ转变为ｃＤＮＡ，再行套式多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增．５８份抗－ＨＣＶ阳性血清标本中，可检出３２份（５５．２％）ＨＣＶＲＮＡ，虽与常规的酸胍酚抽提方法所检出相当（即３０份被检出ＨＣＶＲＮＡ阳性，５１．７％），由于这种直接法省去了用酚及氯仿抽提和醇类沉淀等步骤，具有明显的实用价值。     

杭州地区健康献血员输血传播病毒的检测及部分阳性标本的核苷酸序列分析

目的：了解杭州地区健康献血员中输血传播病毒（TTV）的感染情况和病毒基因组片段的变异性。方法：用酚－氯仿法从献血员的血清标本中提取DNA，半套式聚合聚合链反应检测TTV，部分阳性标本的扩增片段T－1克隆后测序。结果：203例献血员血清标本中TTV DNA的阳性率为15．3％，部分阳性标本扩增产物与报道的TTV TA278株的核苷酸和氨基酸序列比较，其同源性分别为63．51％－67．12％和59．46％－66．22％，结论：杭州地区献血员中TTV的携带率比较高。献血员感染的TTV可能是一种新的基因型。     

外周血基因组DNA提取方法比较

目的建立快速经济有效提取微量外周血基因组DNA的方法。方法采用酚/氯仿提取法、NaCL沉淀法和试剂盒法,直接从人外周血中提取基因组DNA,并以此为模板,进行肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段的扩增及鉴定。结果酚/氯仿法和试剂盒法提取的DNA量大,需血量少,用于PCR扩增结果稳定。结论酚/氯仿提取外周血DNA稳定、高效、经济,可用于批量临床标本的制备。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的　改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法　石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55　℃消化3　h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果　以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论　改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

血清HCV RNA不同提取方法的对比研究

目的:探讨不同方法提取丙型肝炎患者血清HCV RNA ,比较每种方法提取的RNA用于RT-PCR荧光定量检测的敏感度.方法: 分别采用异硫氰酸胍-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法、固相吸附法、柱式总RNA抽提法提取7例疑似 HCV感染者血清标本中的HCV RNA,采用实时荧光定量PCR法进行检测.结果:采用异硫氰酸胍-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法提取HCV RNA用于核酸检测有漏检现象,而采用固相吸附法和柱式总RNA抽提法,敏感度均可达到100%.结论采用固相吸附法和柱式总RNA抽提法提取血清HCV RNA具有较高的敏感度,在实时荧光定量PCR法检测中具有重要的临床价值.     

荧光定量PCR检测TTV方法学建立及临床应用

目的　建立一种灵敏度高、特异性好、操作简便的荧光实时定量PCR技术。方法　设计针对TT型肝炎病毒(TTV)基因保守序列非转录区的一对引物和一条荧光基团双标记探针。将PCR扩增所得的产物片段克隆 ,作为定量检测的标准品。对 36例丙肝患者及 12 3例不同血清标志物阳性的乙肝患者、16 6例健康体检者血清中TTVDNA定量检测 ,评估TTVDNA在不同人群中检出阳性率的差异显著性。结果　该方法检测TTVDNA的灵敏度高于普通套式PCR ELISA方法 ,线性范围为 10 2～ 7拷贝 /ml;批间CV为 13.2 %～ 16 .0 % ,批内CV为 6 .5 %～ 11.3%。健康体检者、丙肝患者、乙肝患者三组人群阳性检出率无显著性差异 ;且乙肝患者 (TTVDNA )血清ALT水平与TTVDNA载量无显著相关性 (P >0 .0 5 ) ;乙肝患者血清ALT异常与正常两组TTVDNA阳性检出率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　该方法操作简单、灵敏度高、特异性好、结果数据化 ,适合于临床实验室进行临床标本的TTVDNA定量检测。     

重型病毒性肝炎经输血传播病毒感染状况调查及其临床意义

目的：调查重型病毒性肝炎经输血传播病毒的感染状况。方法：设计ＴＴＶ基因的特异性引物,采用巢式ＰＣＲ法对３７例重型肝炎进行血清中ＴＴＶ ＤＮＡ的检测,并对ＴＴＶ ＤＮＡ阳性病例进行临床资料分析。结果：３７例重型肝炎中９例血清ＴＴＶ ＤＮＡ阳性（２４．３％）,其中７例重叠感染ＨＢＶ,１例重叠感染ＨＣＶ,１例为单纯ＴＴＶ感染,９例中急性重型肝炎,亚急性重型肝炎１例,亚急性重型肝炎６例,慢性重型肝炎２例;     

献血员血清输血传播病毒抗体及DNA检测结果及意义

目的：检测献血员中输血传播病毒（TTV）感染率，并对检测方法进行评估。方法：应用ELISA和PCR法分别检测90例献血员血清中TTV-Ab和TTV-DNA。结果：ELISA法检测TTV-Ab的阳性率为12.2%，PCR法检测TTV-DNA的阳性率为33.4%。结论：献血员中TTV的感染率较高，将PCR法和ELISA法结合能更好地筛查人群中TTV的感染。     

原因不明性肝炎血清TTV DNA的检出和意义

目的：调查原因不明性肝炎的ＴＴＶ感染状况。方法：设计ＴＴＶ基因的特异性引物,应用ＰＣＲ反应检测４８ 例原因不明性肝炎血清中的ＴＴＶ ＤＮＡ。结果：４８例原因不明性肝炎中１３ 例ＴＴＶ ＤＮＡ阳性（２７．１％ ）,其中急性肝炎９ 例,慢性肝炎３ 例,亚急性重型肝炎１例。结论：ＴＴＶ感染是原因不明性肝炎的致病因子,ＴＴＶ 感染能引起急性、慢性以及重型肝炎     

肝炎患者TTV感染情况及部分基因序列分析的研究

目的 :新发现的DNA病毒 (transfusiontransmittedvirus简称TTV)被认为是一种新的肝炎病毒。为了研究肝炎患者中TTV的感染情况 ,对 10 8例肝炎患者 (ALT >2 0 0IU/L)进行了TTVDNA的检测。方法 :利用巢式PCR方法扩增TTV基因 ,并对两例TTV分离株的部分基因进行克隆和序列分析。结果 :10 8中有 2 4例TTVDNA阳性 ,阳性率为 2 2 2 % ;在非甲～非庚型肝炎中TTV的阳性率为 3 4 6% ( 9/ 2 6) ;甲型肝炎病例中TTVDNA的阳性率为 9 1%( 1/ 11) ;乙型肝炎病例为 2 3 2 % ( 13 / 5 6) ;丙型肝炎病例 7 1% ( 1/ 14 )。两个TTV分离株 (TTVHN 1AF15 15 3 2 ,TTVHN 2AF15 1683 )的核酸序列与GenBank资料中TTV对应序列的核酸同源性高于 90 %。结论 :TTV病毒可能是非甲～非庚型肝炎的重要致病因子 ,并且能够与甲、乙、丙型肝炎病毒发生重叠感染     

献血员中TT病毒感染的检测及序列分析

目的： 研究ALT正常的献血员中TTV(transfusion transmitted virus) 的感染情况,探讨TTV感染的传播途径和致病性。方法： 设计TTV保守区域的特异性引物,聚合酶链反应(PCR)方法检测120例ALT正常的献血员,对1例TTV DNA阳性标本（TTVD026）进行PCR产物测序,并与已知TTV核苷酸序列比较同源性。结果： 120例ALT正常献血员中有20例为TTV DNA阳性,感染率为16.7％。同源性分析表明TTVD026与TA278,GH1,TTVCHN1和TTVCHN2的核苷酸同源性分别为99％,99％,99％和89％。结论： ALT正常的献血员中存在TTV的感染; TTVD026与TTV TA278,GH1,TTVCHN1和TTVCHN2可能属于同一个基因型;输血可能是TTV传播的主要途径。     

TT病毒粪-口传播途径的初步探讨

①目的 探讨TT病毒（TTV）经粪－口传播的可能性。②方法 采用半巢式聚合酶链反应，检测6例TTV感染的肝病病人粪便标本中TTV－DNA，测序，与N22和TA278株核苷酸比较并进行基因分型，探讨粪便中TTV－DNA检出率与血清中病毒滴度的关系。③结果 血清病毒滴度较高的2例病人（10^7/L,10^6/L)的粪便标本中检出了TTV－DNA，滴度分别为10^7/L,10^6/L，基因型分别为G1a,G1b；在血清病毒滴度为10^4/L的4例病人中，仅1例在粪便中检出了TTV－DNA，滴度为10^4/L，基因型为G2。④结论 肝病病人粪便标本中TTV含量与血清滴度直接相关，TTV具有经粪－口传播的可能性。     

原位杂交法检测肝组织中输血传播病毒

采用对称和不对称PCR法 ,以地高辛素标记双链和单链探针 ,用原位杂交法检测了 56例肝组织中输血传播病毒 (TTV)核酸 ,以探讨TTV的致病性。发现 51例非甲～非庚型肝炎肝组织中TTV总检出率为 2 7.5% ( 1 4 /51 ) ;5例非肝炎肝组织杂交阴性。TTVDNA主要定位于肝细胞核内 ,受染肝细胞见于急性、慢性和重症肝炎的肝组织。双链探针杂交结果与单链探针检测病毒基因链的结果一致 ,2例 ( 2 /6)例组织TTV基因链与互补链同时存在。提示TTV是导致肝炎的一种新病原 ,并且在肝脏内有复制     

孕产妇血清及乳汁中输血传播病毒的感染状况

目的:旨在了解孕产妇血清及乳汁中输血传播病毒(TTV)的感染状况,探讨TTV的传播途径。方法:采用PCR-微孔板杂交法对105例孕产妇血清及乳汁标本进行TTV DNA检测。结果:①105例孕产妇血清及乳汁TTVDNA阳性率分别为12.4％(13/105)、10.5％(11/105);②13例孕产妇血清TTV DNA阳性病例中乳汁同时阳性10例,占76.9％(10/13),血清与乳汁感染状况无显著性差异(P>0.05)。结论:孕产妇存在TTV感染,并可能经乳汁感染婴儿。     

TTV 部分传播途径的初步研究及西安地区TTV部分片段测序分析

目的研究输血传播肝炎病毒(TTV)有否直接垂直传播途径及尿液传播的可能性,初步了解西安地区TTV结构部分特点.方法参照文献[1]在TTV DNA ORF1区设计一套套式PCR引物,建立TTV DNA套式PCR检测方法,对16例血清检测TTV DNA阳性的患者尿液做了TTV DNA检测,对52 例正常顺产孕妇血清及其婴儿脐带血同时检测TTV DNA; 并且对西安地区1例原因不明而TTV阳性肝炎患者的TTV套式PCR扩增终产物纯化直接测序.结果 16例血清检测TTV DNA阳性的患者尿液TTV DNA检测未发现1例阳性; 在52例顺产妇外周血中,9例TTV DNA阳性TTV基因检测阳性率为17.3%(9/52);而新生儿脐带血TTV基因检测阳性率为7.7%(4/52); 其中,母子同时TTV DNA阳性2 例,单纯母亲血TTV DNA 阳性7例; 单纯婴儿脐带血TTV DNA 阳性2例.直接测序法测序,测得的143bp序列用DNAsis分析软件中国1株(BDH1)序列比较,二者同源性为65.0%,差异率为35.0%(>30%).结论 TTV可能不能通过尿液传播,但能经胎盘直接垂直传播, 西安地区TTV流行毒株可能存在新的TTV基因型.